少根紫萍转录因子及其营养胁迫下的表达

少根紫萍(Landoltia punctata)是一种浮水生、多功能、高环境适应能力的能源植物,为了解其生理特性的分子机制,利用少根紫萍转录因子预测数据与拟南芥、水稻、玉米数据库数据进行宏观比较,并结合转录组测序技术对少根紫萍营养胁迫后转录因子表达分析.结果显示,少根紫萍有1 076个转录因子,分属于66个家族,其中在b ZIP、WRKY、AP2/ERFERF、MYB、NAC、MADS-box等家族基因数明显减少,一定程度上解释了浮萍高黄铜低木质素、难开花的生理特性;少根紫萍在营养胁迫下偏向上调AP2/ERF-ERF、MYB、bHLH家族特定基因和下调AP2/ERF-ERF、WRKY家族特定基因来响应营养胁迫,尤其是AP2/ERF-ERF、WRKY两个家族中特定基因表达下调在响应水体营养胁迫中有非常重要的作用.本研究在转录因子层面对浮萍的生理特性,特别针对营养胁迫下转录因子的表达进行了探究,可为建立浮萍水生模式植物系统、深入探讨少根紫萍响应营养胁迫机制以及改造成耐受胁迫的高效淀粉积累能源植物提供理论指导.     

少根紫萍对微污染地表水的净化及淀粉积累能力

根据地表水环境质量标准研究少根紫萍(Landoltia punctata)对微污染地表水的净化效果,同时,对其淀粉积累能力进行评价.结果显示,少根紫萍对微污染地表水体可以实现深度处理,经处理的Ⅴ类、劣Ⅴ类水体中氨氮(NH4+-N)和总磷(TP)均在1d内提升一个水质级别,在3d内达到地表Ⅱ类水标准(NH4+-N0.15mg/L,TP0.09mg/L),且氮、磷去除率均达到98.5%和82.9%以上.此外,少根紫萍在快速修复水体的同时能大量积累淀粉.处理3 d,Ⅴ类和劣Ⅴ类水处理中浮萍干重的淀粉含量分别为28.38%、21.57%,15 d后达到52.15%、49.58%.另外研究发现,额外添加二氧化碳(CO2)对淀粉积累有进一步促进作用.处理3 d淀粉含量相比未添加CO2提升了55.7%,平均淀粉积累速率提高了2.72倍.因此,少根紫萍不仅能够快速净化微污染水体,同时也能积累大量的淀粉干物质,结果可为实际污水处理及后期少根紫萍资源化应用提供参考.     

羟丙基-β-环糊精对新金色分枝杆菌合成ADD蛋白质组的影响

新金色分枝杆菌(Mycobacterium neoaurum JC-12)可降解植物甾醇合成药物中间体雄甾-1,4-二烯-3,17-二酮(ADD),由于植物甾醇的溶解度较低,因此在转化体系中添加羟丙基-β-环糊精(HP-β-CD)作为助溶剂.本次研究在HP-β-CD存在与否条件下利用二维凝胶电泳(2-DE)和基质辅助激光解析电离飞行时间串联质谱技术(MALDI-TOFMS)分离和鉴定新金色分枝杆菌蛋白质表达量的差异;再使用反转录实时荧光定量PCR(RT-q PCR)对挑选出的5个与ADD合成相关的蛋白质编码基因进行转录水平分析.结果表明,2-DE图谱及质谱结果共鉴定到12个具有显著差异表达量的蛋白质点.其中,参与植物甾醇降解合成ADD途径的乙醇脱氢酶、烯酰-Co A水合酶、乙酰-Co A乙酰基转移酶、3α,7α,12α-三羟基-5β-胆甾-24-烯酰-Co A水合酶和4,5-9,10-双断裂-3-羟基-5,9,17三氧雄甾-1(10),2-二烯-4-酸酯水解酶的蛋白质表达量在羟丙基-β-环糊精存在条件下显著提高;参与糖、脂、氨基酸和核酸类物质代谢的乙二醛酶、3-氧代酰基-ACP合酶、3-酮脂酰-ACP还原酶、分支酸合酶、氮调节蛋白P-II和DNA结合蛋白的蛋白质表达量也有一定的提高,但磷酸甘油酸变位酶的蛋白质表达量有所下降.通过RT-q PCR分析的转录水平的变化情况与2-DE得到的蛋白水平的结果相符.综上所述,羟丙基-β-环糊精可促进降解植物甾醇合成ADD代谢途径及糖、脂、氨基酸和核酸类物质代谢途径相关酶的表达量.     

甘蔗蔗糖磷酸合成酶SPSⅡ cDNA片段克隆与表达分析

蔗糖磷酸合成酶(Sucrose phosphate synthase,SPS)是蔗糖合成途径的关键限速酶,在蔗糖积累和碳分配中具有重要作用.在茎组织中SPSⅡ表达量占SPS转录总量的40%,表明SPSⅡ cDNA的克隆与表达对蔗茎中蔗糖的积累有着重要的影响.通过RT-PCR技术克隆分离SPSⅡ基因cDNA片段.序列分析表明该cDNA片段包含1个3 183 bp的开放读码框,可编码1 060个氨基酸.GenBank登录号为EU269038.通过实时荧光定量PCR检测SPSⅡ基因在甘蔗糖分积累的不同时期、不同组织部位的相对表达量.结果表明,在糖分积累初期蔗茎中的SPSⅡ相对表达量最大,在糖分积累中期蔗叶中的SPSⅡ相对表达量达到最高峰;同组织部位中,糖分积累初期SPSⅡ相对表达量高于糖分积累中期、后期.图6参11     

非生物胁迫诱导青蒿素生物合成基因的表达

对离体培养青蒿试管苗中3个青蒿素合成相关基因的非生物胁迫诱导表达模式进行了初步研究.半定量RT-PCR测定结果表明,当暴露于冷、热和紫外光后,青篙植株的紫穗槐-4,11-二烯合酶基因(ADS)和细胞色素P450单加氧酶基因(CYP71AV1)转录上调;相反,在未经胁迫处理的情况下,ADS和CYP71AV1基因的表达水平较低,而在胁迫处理前后细胞色素P450还原酶基因(CPR)转录所产生的mRNA均保持恒定.同时,冷胁迫的诱导效果也得到实时荧光定量RT-PCR测定数据的支持.经低温锻炼的青蒿试管苗,其ADS和CYP71AV1基因的转录产物拷贝数比对照分别提高11倍和7倍,而CPR基因的mRNA拷贝数与对照基本持平.短暂预冷处理还可显著提高青蒿试管苗的青蒿素含量,达到7.5～8.8 mg/g干重,比对照提高66.7%～95.6%,为进一步探索利用环境胁迫促进青蒿素高产的新途径提供了可能性.图2表3参21     

运动发酵单胞菌共表达α-淀粉酶和葡萄糖淀粉酶发酵甘薯生产乙醇

运动发酵单胞菌是乙醇发酵的极佳菌种,但其所能利用的发酵底物范围狭窄,不能利用淀粉作为发酵底物.为增加其利用底物的范围使其能够水解淀粉,本研究构建了3种表达淀粉酶的运动发酵单胞菌菌株:1)Zymomonas mobilis(pAmyE)表达α-淀粉酶;2)Z.mobilis(pGA)表达葡萄糖淀粉酶;3)Z.mobilis(pAmyGA)共同表达α-淀粉酶和葡萄糖淀粉酶.DNS法测定淀粉酶活显示,每种转化菌株的胞外淀粉酶活性均高于胞内,且两种淀粉酶共表达的酶活高于这两种淀粉酶单独表达的酶活之和,说明这两种淀粉酶能够协同作用降解淀粉.对于重组菌株Z.mobilis(pAmyGA),约59.3%的淀粉酶活性都在胞外检测到.用淀粉含量高且耐贮存的徐薯18匀浆加少量葡萄糖作为培养基直接用上述3个菌株发酵生产乙醇.结果显示,共表达α-淀粉酶和葡萄糖淀粉酶的重组菌株Z.mobilis(pAmyGA)的乙醇产量为54.7 g/L,达到了理论值的83.2%,表明本研究得到了能够直接高效利用淀粉生产乙醇的运动发酵单胞菌的菌株.     

比较转录组研究钛离子对紫花苜蓿基因表达的影响

钛离子可显著促进植物生长,增加作物产量.以紫花苜蓿(Medicago sativa)为材料,用钛离子水溶液(0,8 mg/L)喷施植株叶面,24 h后取样进行Illumina高通量RNA-Seq测序,研究钛离子对紫花苜蓿叶片基因表达的影响,在转录水平上研究钛离子作用的分子机理.以蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)为参考基因组进行比对,结果显示,共获得28437个注释基因.差异表达分析表明,与对照相比,8mg/L钛离子处理引起大量基因表达发生变化,482个差异表达的基因中247个上调表达,235个下调表达. GO和KEGG注释结果显示,大量核糖体(18)、热激蛋白(7)、转录因子WRKY(5)类编码基因上调表达;尽管抗病相关基因上调的个数(11)低于下调的(22),但这些抗病相关基因的总体表达量,FPKM从12 563上升至16 197.下调的基因主要有细胞色素P450家族基因(上调2个,下调7个).推测钛离子作为一种胁迫信号刺激紫花苜蓿产生应答,引起基因表达发生变化,上调了与生长和胁迫适应相关基因的表达,进而促进植物生长和提高对逆境的耐受性.本研究为揭示钛离子调节植物生长的机制打下基础,为进一步钛离子制剂在农业生产中的应用提供指导.     

甘蔗茉莉酸合成关键酶基因ScOPR1的克隆、亚细胞定位及表达

12-氧-植物二烯酸还原酶(12-Oxo-phytodienoic acid reductase,OPR)是十八碳烯酸途径的关键酶之一,控制着茉莉酸合成的最后一个步骤.目前,甘蔗(Saccharum spp.)OPR基因的研究尚未见报道.从课题组构建的甘蔗转录组unigene注释库中筛选到一个OPR基因,利用RT-PCR技术从ROC22接种黑穗病菌48 h的蔗芽中扩增获得全长cDNA序列,命名为ScOPR1(GenBank Accession Number:MG755745),并对该基因的序列特征、亚细胞定位、组织特异性表达及其在不同植物激素胁迫和不同基因型甘蔗与黑穗病菌互作过程中的表达情况进行分析.生物信息学分析发现,ScOPR1基因全长1 287 bp,包含1个1 116 bp的开放阅读框,编码371个氨基酸,理论等电点为6.01,含有底物结合活性、FMN结合活性和催化活性的氨基酸保守位点以及OYE家族的保守结构域,且与高粱(Sorghum bicolor)OPR蛋白(XP_002447901.2)的氨基酸序列一致性高达96.23%,推测其为酸性稳定亲水性非分泌OPRⅠ蛋白.本氏烟(Nicotiana benthamiana)瞬时表达显示,ScOPR1::GFP融合蛋白定位于细胞质和细胞膜.qRT-PCR分析结果显示,ScOPR1基因在甘蔗不同组织中均有表达,其在根中的表达量最高,其次为叶和蔗皮,而在蔗芽和蔗肉中的表达量最低.茉莉酸甲酯和水杨酸处理后,随着胁迫时间的延长(3-24 h),ScOPR1基因显著上调表达;该基因在脱落酸处理0.5 h时被诱导表达,为对照的1.54倍.此外,ScOPR1基因在抗黑穗病品种崖城05-179受黑穗病菌侵染初期(24 h)显著上调表达,但在感黑穗病品种ROC22中下调表达;48-72 h时ScOPR1基因的表达量在两个甘蔗基因型中较对照有所增加,但在抗病品种中高于感病品种.本研究表明,ScOPR1基因积极响应茉莉酸甲酯、水杨酸和脱落酸信号分子以及黑穗病菌的胁迫,结果可为进一步分析ScOPR1基因的功能和甘蔗抗病基因工程提供参考.     

香菇生长发育过程中漆酶基因家族的转录表达

香菇可分泌胞外漆酶降解木质素作为自身营养物质.为探究不同漆酶基因在香菇生长发育过程中的不同作用,采用RT-q PCR方法分析10个漆酶基因在香菇4个不同发育阶段(菌丝体、原基、幼小子实体和成熟子实体)的转录表达情况.结果显示,5个漆酶基因(Lelac1、Lelac3、Lelac5、Lelac8和Lelac9)的转录表达表现出差异性和发育阶段特异性,另外5个漆酶基因(Lelac2、Lelac4、Lelac7、Lelac10和Lelac11)只表现出差异性.Lelac2和Lelac3随着香菇的生长,其转录表达量持续上升,可能与成菇过程有关;Lelac1和Lelac7在菌丝体阶段大量表达,可能参与菌丝体的生长代谢;Lelac8在原基时期表达量显著高于其他时期,与原基分化有关.本研究表明漆酶基因在香菇不同发育阶段的转录表达存在差异,结果可为进一步阐明漆酶在香菇生长发育阶段的作用奠定基础.     

鄱阳湖流域浮萍种质资源分布及其对水环境因子的响应

为全面了解鄱阳湖流域浮萍种属资源分布及其生长水环境,对流域内浮萍资源开展调查并测定生长水体的水质.结果显示,鄱阳湖流域采集到的浮萍共4属5种,分别为青萍(Lemna minor)、稀脉浮萍(Lemna perpusilla)、紫背浮萍(Spirodela polyrrhiza)、少根紫萍(Landoltia punctata)、芜萍(Wolffia arrhiza)、青萍和紫背浮萍为该地区的优势种.青萍生长水体的p H范围最广(5.5-9.43),其他浮萍生长水体呈弱酸性.青萍生长水体中的氨氮(NH_3-N)、硝态氮(NO_3-N)、总氮(TN)、化学需氧量(COD)浓度范围较其他4种浮萍更为广泛,分别为0.18-4.25 mg/L、0.027-3.27mg/L、0.38-13.28 mg/L、16.16-614.72 mg/L,少根紫萍生长水体的总磷(TP)浓度范围最广,为0.06-2.68 mg/L.从重金属含量来看,青萍生长水体Cu、Pb、Zn、Co含量范围最广,少根紫萍对Cd、紫背浮萍对Mn的适应能力表现出优势.从自然状态下富集效果来看,青萍对Zn、紫背浮萍对Cr、少根紫萍对Mn的富集能力强.青萍和紫背浮萍对Pb富集效果好于少根紫萍.RDA分析表明,少根紫萍的分布主要受TN、TP、NH_3-N的影响,紫背浮萍主要受Mn的影响,青萍主要受NO_3-N的影响.稀脉浮萍和芜萍分别受Cd、Cr的影响.不同浮萍种属的水环境差异较大,在修复富营养化水体时,可利用当地优势品种组合以达到最佳的去除效果.根据浮萍对重金属耐受能力、富集效果的不同可筛选出对特定重金属耐性好且富集能力强的品种.本研究对利用浮萍品种修复不同污染的水体具有一定的指导意义.(图4表5参40)     

高浓度氯化镍胁迫下酿酒酵母组蛋白H4K5去乙酰化调控金属硫蛋白基因的表达

金属硫蛋白(MTs)具有重金属解毒功能.组蛋白乙酰化/去乙酰化是表观遗传因子之一,并且参与基因的表达调控.然而,组蛋白乙酰化/去乙酰化在真核生物响应氯化镍胁迫过程中对金属硫蛋白基因的调控作用还不清楚.以酿酒酵母突变株H4K5R(该菌株模拟组蛋白H4赖氨酸5去乙酰化的状态)为试验材料,采用流式细胞术检测不同浓度氯化镍处理下酵母细胞的死亡率,发现突变菌株的生长状态和细胞存活率明显优于野生型菌株BY4741;qRT-PCR检测5 mmol/L氯化镍处理后,酿酒酵母金属硫蛋白基因Cup1、Crs5、Sod1及转录因子Cup2的表达量.结果显示,高浓度氯化镍胁迫下,野生型菌株中基因的表达水平均显著降低;耐镍菌株H4K5R中,金属硫蛋白基因Cup1表达量上调7.4倍,Crs5表达量显著下调2.56倍,Sod1表达量不显著上调,转录因子Cup2表达量上调3.81倍,并且表达水平均显著高于镍处理后的BY4741.本研究表明突变菌株H4K5R具有较强的镍耐受性;镍胁迫下,突变菌株中金属硫蛋白Cup1与转录因子Cup2的表达变化趋势与BY4741相反,说明组蛋白H4K5的去乙酰化可能通过改变基因表达模式,从而在酿酒酵母响应镍胁迫时发挥重要的调控作用.(图6表1参38)     

渗透压对产甘油假丝酵母磷酸果糖激酶和6-磷酸葡萄糖脱氢酶的调控

磷酸果糖激酶(PFK)和6-磷酸葡萄糖脱氢酶(G6PDH)分别是糖酵解途径(EMP)途径和磷酸戊糖途径(HMP)途径的关键酶,控制着流入两种途径的葡萄糖流量,对耐高渗产甘油假丝酵母(Candida glycerinogenes)高效合成甘油、抵抗渗透压胁迫非常重要.为考察渗透压对产甘油假丝酵母这两个关键酶的影响,首先克隆得到编码产甘油假丝酵母G6PDH的Cgzwf基因及编码PFK亚基的Cgpfk1和Cgpfk2,并通过生物信息学分析、酶活检测及基因互补实验验证它们的功能.渗透压胁迫发酵(添加50 g/L NaCl)结果显示,菌株生物量未受渗透压影响,但甘油积累量增加了2倍.与对照相比,盐胁迫激活PFK但弱化了G6PDH活性.此外,盐胁迫下PFK活性表现出更为明显的先降低后升高的趋势,而G6PDH活性的变化则与对照基本相似,表明盐胁迫下碳流可能存在EMP-HMP-EMP形式的不同程度偏转.转录水平检测发现,在发酵中的甘油积累过程盐胁迫对上述酶基因转录的影响并不明显,表明细胞可能通过酶活性调节而不是主要依赖于转录调节来调控两种关键酶以适应耐渗长期胁迫和甘油合成的需要.综上,产甘油假丝酵母以调节关键代谢酶活性的方式来实现碳硫偏转,高产甘油,从而适应外界渗透压力,这一结果可为阐明产甘油假丝酵母耐高渗和高产甘油机制提供新的信息,为未来代谢改造该菌株打下基础.     

两种启动子对聚γ-谷氨酸降解酶基因在地衣芽胞杆菌中的加强表达效果

聚γ-谷氨酸(γ-PGA)是一种应用前景良好的生物高分子材料.比较了蔗糖诱导的枯草芽胞杆菌果聚糖蔗糖酶基因(SacB)启动子和地衣芽胞杆菌α-淀粉酶基因启动子对γ-PGA降解酶基因ywtD在地衣芽胞杆菌中加强表达的影响.分别用SacB基因启动子和α-淀粉酶启动子构建了穿梭表达载体pHY300-SYT和pHY300-PYT,通过电转化地衣芽胞杆菌WX-02获得重组子SYT和PYT.酶活测定结果显示SYT和PYT中γ-PGA降解酶基因ywtD得到加强表达,摇瓶发酵结果显示两个重组菌株的γ-PGA相对分子质量都由1 000 000~1 200 000降低为800 000~900 000,PYT的γ-PGA产量较对照菌株PLK提高了33%,由13.50 g L-1提高到17.97 g L-1,而SYT的γ-PGA产量则降低为10.85 g L-1.因此,α-淀粉酶启动子更适合于在地衣芽胞杆菌WX-02菌株中表达γ-PGA降解酶基因,从而获得高产低分子量γ-PGA的工程菌.     

解淀粉芽孢杆菌DC-4豆豉溶栓酶成熟肽编码序列的克隆及表达

利用PCR方法从解淀粉芽孢杆菌DC 4总DNA中扩增出豆豉溶栓酶 (DFE)成熟肽编码区片段 .测序结果表明 :DFE成熟肽编码区长 82 5bp,编码 2 75个氨基酸残基 ,分子量为 2 7.7× 10 3 ,推导的N’ -端氨基酸序列与豆豉溶栓酶N’ -端氨基酸测序结果完全一致 ,说明克隆到的基因确实是豆豉溶栓酶基因 .同源性分析表明 ,DFE成熟肽编码区的核苷酸和氨基酸序列与日本纳豆激酶的同源性分别为 80 .0 %和 86 .5 % ,这提示豆豉溶栓酶可能是一种新型的溶栓酶 .将表达质粒pET Nde转化E .coliBL2 1(DE3)中 ,IPTG可诱导表达大量的DFE融合蛋白 ,占菌体可溶性蛋白的 4 0 % ,主要以包涵体的形式存在 .图 3表 1参 19     

中华猕猴桃‘红阳’Alase家族基因的克隆及表达分析

在高等植物中醛糖酸内酯酶(Alase)催化L-半乳糖酸(L-Gal A)形成抗坏血酸(Ascorbic acid,As A)的前体物质L-半乳糖-1,4-内酯(L-Ga IL),是As A合成分支途径D-半乳糖醛酸途径中的关键步骤.基于最新的猕猴桃基因组数据库,分离并克隆到3个Alase家族基因,分别命名为Alase1、Alase2、Alase3,并从基因信息、蛋白质理化性质、二级结构及序列特征方面对其进行预测及分析.结果表明,Alase为亲水性蛋白,二级结构主要以α-螺旋和不规则卷曲为主,3个Alase基因具有高度的相似性.定量RT-PCR分析表明3个Alase家族基因在不同组织中均有表达,且在成熟的叶片中表达量最高.同时在猕猴桃果实发育及成熟过程中,Alase家族基因在幼果中的表达水平较低,而在果实发育后期及果实成熟过程中表达量不断升高.本研究可为Alase家族基因后续功能研究及猕猴桃中As A生物合成和积累分子机制解析奠定基础.     

闽侯野生蕉LDOX基因的克隆及表达特性

为探讨闽侯野生蕉无色花青素双加氧酶基因(MiLDOX)的序列和表达特性,利用反转录PCR(RT-PCR)克隆MiLDOX基因cDNA序列,并对其进行系列生物信息学和不同组织器官中的表达特性分析.结果显示,MiLDOX基因包含1 083 bp完整的开放阅读框,可编码分子量(Mr)为40.73×10~3、包含360个氨基酸的蛋白质. MiLDOX基因属于α-酮戊二酸依赖性双加酶基因家族,其编码蛋白为不含信号肽和跨膜结构的亲水性蛋白,理论等电点为5.71.MiLDOX二级结构中不规则卷曲和α-螺旋占比较大.亚细胞定位预测结果显示MiLDOX可能定位于细胞质中.系统进化树显示MiLDOX与小果野蕉MaLDOX和阿比西尼亚红脉蕉EvLDOX亲缘关系最近.实时荧光定量PCR结果显示MiLDOX在闽侯野生蕉不同组织部位都有表达,在雄花中的表达量最高,且与类黄酮和花色素苷含量呈显著正相关.此外,通过研究MiLDOX基因在不同转色阶段果皮中的表达情况,发现它的表达随着果皮色素积累逐步升高.本研究表明MiLDOX基因可能分别参与闽侯野生蕉类黄酮和花色素苷的积累,并在果皮转色等过程发挥着重要作用.(图9表1参37)     

基于回补途径的TCA循环改造对克雷伯氏菌生长和甘油代谢的影响

回补途径和TCA循环在克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)的中心代谢中扮演着十分重要的角色.通过过表达回补途径的关键酶磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PPC)和柠檬酸(TCA)循环的关键酶柠檬酸合成酶(GLTA)将磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)和乙酰辅酶A节点的碳流引入TCA循环,以考察基于回补途径的TCA循环强化对K. pneumoniae生长和甘油代谢的影响.结果显示:单独过表达ppc或gltA基因,TCA循环还原和氧化分支的中间代谢产物琥珀酸和α-酮戊二酸分别增加了8.3倍和1.2倍,甘油利用能力明显增强,除2,3-丁二醇外,其他副产物积累量均有所下降,但1,3-PDO产量分别降低了23.3%、5.9%.共表达ppc和gltA基因后,与对照菌相比,生物量降低了35.7%,甘油利用能力进一步增强,1,3-丙二醇产量提高了10.2%,所有副产物积累量均有所减少;与单独过表达ppc或gltA基因相比,乙醇、乳酸、乙酸积累量未有明显变化,但生物量略有提高,2,3-丁二醇积累量显著降低.上述结果表明通过共表达磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶和柠檬酸合成酶强化TCA循环能够提高菌株的甘油利用能力,弱化副产物合成,强化1,3-丙二醇的合成.(图4表2参19)     

汕头海域几丁质酶产生菌的筛选及其几丁质酶编码基因研究

在汕头海域表层沉积物中分离得到69株高产几丁质酶的菌株,对其中6株形态特征差异比较明显、几丁质酶活力比较高的菌株SWCH-1、SWCH-2、SWCH-3、SWCH-5、SWCH-6和SWCH-9进行了16S rDNA序列鉴定,发现它们分别归属于5个属.即短芽孢杆菌属(Brevibacillus)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus)、芽孢杆菌属(Bacillus)、气单胞菌属(Aeromonas)和寡养单胞菌属(Stenotrophomonas).采用兼并引物对6株菌几丁质酶编码基因的催化保守区片段进行了PCR扩增和序列分析,发现菌株均含有18家族几丁质酶编码基因;但是其编码的蛋白序列与NCBI收录的蛋白序列存在着差异,其中菌株SWCH-1和SWCH-3的蛋白序列与数据库中序列的相似性比较低,分别为85%和81%,菌株含有比较新的几丁质酶编码基因,其全基因序列的克隆和酶蛋白的纯化分析尚在进一步研究中.图6参18     

番茄SlNAC1基因启动子的盐应答功能分析

番茄NAC转录因子编码基因SlNAC1受假单胞菌、盐、干旱和低温等多种生物和非生物胁迫诱导表达,但其转录调控机制仍不清楚.为研究SlNAC1的盐应答转录调控机制,分离SlNAC1基因的启动子并分析其盐应答功能.构建4个5′-缺失的SlNAC1启动子(起始密码子上游2 039 bp、1 508 bp、1 373 bp和777 bp)驱动的GUS基因表达载体,并利用农杆菌介导法分别转化烟草(Nicotiana benthamiana),随后对转基因植株进行NaCl处理和GUS染色分析.结果显示,未经NaCl处理的转基因植株均不被明显染色,而NaCl处理后,除777 bp启动子转基因植株外,2 039 bp、1 508 bp和1373 bp启动子转基因植株都被明显染色.这说明SlNAC1启动子中盐应答元件位于-1 373 bp和-777 bp之间.结合该区间有4个盐应答元件——GT1GMSCAM4元件(核心序列为GAAAAA)的预测分析结果,推断这4个GT1GMSCAM4元件中的一个或者多个协同负责SlNAC1基因的盐应答转录调控.这4个GT1GMSCAM4元件将用于筛选SlNAC1盐应答的转录调控因子.(图4表1参28)     

香蕉MaMPK1基因的克隆与表达模式

为研究香蕉MAPK1的序列特征及其在不同激素处理、逆境胁迫下的表达趋势,以‘天宝蕉’为材料,采用RTPCR技术克隆MaMPK1并对其进行生物信息学分析和不同处理下的表达模式分析.结果显示该基因编码区长为1182bp,可编码393个氨基酸.其编码蛋白具有STKc_TEY_MAPK结构域,属于MAPK基因家族TEY亚型A亚家族,是不稳定的脂溶性亲水酸性蛋白,无信号肽和跨膜结构,有多个磷酸化位点.亚细胞定位预测结果显示MaMPK1主要定位于细胞核.蛋白互作预测结果显示该蛋白与HSFA4A存在互作,暗示其可能在香蕉抗热反应过程中发挥作用.启动子顺式作用元件预测结果显示MaMPK1启动子包含多种激素和逆境胁迫相关作用元件.定量分析结果显示MaMPK1的表达受SA、45℃、低温和盐胁迫抑制,受茉莉酸甲酯(MeJA)和枯萎病菌侵染诱导上调,在脱落酸(ABA)处理后期极显著上调表达.本研究表明MaMPK1广泛参与香蕉逆境胁迫应答.(图9表1参35)