尾矿固氮菌的分离筛选及其植物促生效应研究

尾矿是一种寡营养环境,含有大量重金属元素,然而营养元素的缺乏,尤其是氮素的缺乏严重阻碍了尾矿生物修复策略的发展。固氮菌可为植物提供可利用性氮,促进尾矿生态修复。然而,目前关于栖息在尾矿中固氮菌的分离研究较少。采用无氮培养基和稀释涂布平板分离法,从湖南怀化溆浦县黄家尾矿分离出7株具有固氮功能的菌株,结果表明,PC-3的固氮酶活性最高(7 133.71μmol·h^-1·mL^-1)。IAA、金属抗性和铁载体定性测定结果表明,G6、L31和PC-3同时具备有IAA特性、铁载体和金属抗性的能力。同时研究了菌株的最适生长pH,结果表明大部分菌株在pH偏中性下生长较好,但G6、L2+2在pH=9的条件下生长趋势最好。16S r RNA测序结果表明,上述7株菌分别为Brevundimonas(G15、G18),Xanthobacter(L31),Sphingobium(L2+2),Pseudomonas(PC-3),Mycobacterium(G6),Rhodococcus(L45)。为了进一步探究尾矿固氮菌的植物促生潜力,进行了盆栽试验。与对照组相比,接种...     

慢生根瘤菌交叉结瘤及其系统发育关系的研究

选用包括6株花往根瘤菌[Bradyrhizobium sp.(Arachis)]在内的13株慢生根瘤菌，进行了6种豆科植物结瘤试验及共系统发育分析。研究结果表明，慢生根瘤菌与试验的豆科宿主植物间普遍存在交叉结瘤，还发现有些菌株在原宿主外的豆科植物根部形成类根瘤的现象。16S rDNA和23S rDNA的PCR－RFLP分析揭示出这些菌株rDNA基因的差异性，不同宿主来源的慢生根瘤菌株可以同属一个rDNA类型，而从同一宿主中分离的根瘤菌菌株可分属多种不同的rDNA类型，研究结果表明，采用rDNA PCR-RFLP等遗传背景分析的手段，可能筛选出广谱的根瘤菌力株，表4参8。     

应用全细胞蛋白SDS-PAGE分子标记技术验证含羞草根瘤菌的结瘤能力

对云南省热带及亚热带地区的含羞草根瘤菌进行了分离,选择其中40株菌为接种菌株,通过结瘤试验并采用全细胞蛋白SDS-PAGE分子标记方法研究了其结瘤能力.经过结瘤试验,发现除菌株SWF66075和SWF66093没有结瘤外,其它38株菌株均与含羞草植物结瘤.结瘤率为95%.从结瘤试验所获根瘤中,分离得到结瘤菌株,采用全细胞蛋白SDS-PAGE分子标记对结瘤菌株与接种菌株进行了比较研究.蛋白图谱及聚类分析显示,26株接种菌株与其结瘤菌株的全细胞蛋白分子图谱完全相同,在100%的相似水平上与其结瘤菌株聚在一起,说明宿主植物所形成的根瘤确系接种菌株侵入所致,因而可将这些菌株确认为根瘤菌菌株;而SWF66012、SWF66029、SWF66044和SWF66058等12株菌株的结瘤菌株与其各自接种菌株的全细胞蛋白图谱存在较大差异,推测这12株接种菌株与其结瘤菌株可能不是同一菌株,尚不能确定它们与含羞草植物的结瘤能力,这些菌株是否为根瘤菌菌株仍需进一步验证.研究结果表明,全细胞蛋向SDS-PAGE分子标记技术是一种快速、准确地验证根瘤菌结瘤能力的方法.该方法进一步完善了结瘤试验,并初步揭示了根瘤菌的竞争结瘤能力,适用于对大量根瘤内分离菌株进行根瘤菌的证实研究.图2参28     

石漠化地区豆科植物根瘤菌降解碳酸钙、镁能力研究

微生物对岩溶地区岩石风化、成土具有明显的促进作用,为了筛选出能够促进碳酸盐岩风化、加快成土速率的优势根瘤菌菌株,将其与豆科植物建立共生体系,进行石漠化地区修复与治理,实验以分离自云南石漠化地区的9株豆科植物根瘤菌为研究对象,将9株根瘤菌接种于加有难溶性碳酸钙或碳酸镁的液体培养液中,28.5℃、160 r·min-1摇床培养15 d,于0、1、3、6、10、15 d取样2 mL,每个样3个平行;将样品加入到10 mL体积比5∶1的硝酸高氯酸消化液中浸泡过夜,放在电热板上缓慢加热至溶液澄清透明,分别用含La3＋2%的盐酸溶液定容至10 mL,空白用同样方法处理;最后采用原子火焰吸收方法测定样品中Ca2＋和Mg2＋含量,筛选出对碳酸盐岩主要成分碳酸钙和碳酸镁具有强降解作用的根瘤菌菌株。结果表明：热带根瘤菌Rhizobium tropici （SWFU09）和根瘤菌Rhizobium sp.（SWFU02）对碳酸钙降解作用最强;对碳酸镁降解作用最好的菌株为根瘤菌Rhizobiumsp.（SWFU03）、热带根瘤菌Rhizobium tropici（SWFU05）和慢生根瘤菌Bradyrhizobium sp.（SWFU01）。溶液pH值对碳酸镁降解作用具重要的影响,对碳酸钙降解作用影响不大,说明根瘤菌代谢产生的酸性物质（有机酸、氨基酸）对碳酸钙和碳酸镁降解作用有一定影响,但不是唯一影响因素;也可能是微生物代谢产生的有机配体（基）吸附碳酸钙和碳酸镁表面,与水体中的成分形成复合物,改变溶解的平衡,置换出Ca2＋和Mg2＋。     

豆科树种刺槐、黄檀、合欢根瘤菌的数值分类及16S rDNA-PCR RFLP研究

测定了从豆科树种刺槐、黄檀、合欢根瘤中分离获得的51个菌株与18株参比菌株的唯一碳源、氮源利用，抗生素抗性，耐逆性和酶活性等132个表型性状，并用MINTS软件进行聚类分析，结果表明，全部供试菌株在59％的相似性水平上分为两大群：一个各为慢生菌群，另一群为快生和中慢生菌群，在85.1%的相似性水平上分为5个亚群，其中亚群4不与任何已知参比菌株聚在一起，可能为新种。同时，表型性状测定结果发现某些菌株对抗生素（300μg／mL）、温度（40℃）有较强抗性，大多数菌株能在较宽的pH值范围内生长（pH5-12），这些具有抗逆特性的菌株为我国西部大中种植豆科植物接种适宜的根瘤菌提供了宝贵的种质资源，在数值分类的基础上，又对47株菌进行了16S rD-NA-PCR RFLP分析，经SPSS软件聚类后，划分为7个亚群，在较大类群的划分上，与数值分类的结果有较好的一致性，16S rDNA-PCR RFLP遗传图谱共有30种类型。表型及遗传型分析结果表明，豆科树种根瘤菌具有极大的多样性，图2表2参14。     

四川省部分豆科植物根瘤菌的遗传多样性

从四川省豆科植物鸡眼草属、合欢属、豇豆属、葛属、金合欢、杭子梢分离获得了103株根瘤菌,采用AFLP、BOXAIR-PCR研究了这些菌株的遗传多样性.结果表明,分离自四川省豆科植物6个属的根瘤菌存在明显的遗传多样性,AFLP分析中,全部供试菌株的相似性为21%,全部供试菌株可分为26个AFLP遗传群;BOXAIR-PCR聚类分析结果表明,103个菌株分在70%相似性水平处,供试菌株被分为18个BOX遗传群.除部分菌株外,多数根瘤菌按宿主类型聚群,同一宿主而地理来源不同的根瘤菌分布于不同的遗传群,表明宿主和地理环境对根瘤菌具有深刻影响.图3表1参9     

我国蚕豆根瘤菌的多样性和系统发育研究

采用数值分类、16S rDNA PCR-RFLP、IGS PCR-RFLP等方法对分离自我国11个省的50株蚕豆根瘤菌及11株参比菌株进行了表型测定和遗传型研究,同时对5株蚕豆根瘤菌的代表菌株进行了16S rDNA全序列测定.表型测定的结果表明,在80%的相似水平上供试菌株分为4个群,各群间存在地区交叉;16S rDNA PCR-RFLP的聚类结果与数值分类的聚类结果有很好的一致性;IGSRFLP反映的多样性更明显,形成的遗传群较多,可用于菌株间的鉴别.实验结果表明我国蚕豆根瘤菌具有极大的表型多样性和遗传多样性.系统发育研究结果表明,蚕豆根瘤菌的代表菌株均位于快生根瘤菌属(Rhizobium)系统发育分支,与R.leguminosarum USDA2370的全序列相似性达99.9%,说明蚕豆根瘤菌属于Rhizobium,系豌豆根瘤菌的一个生物型.图4表3参12     

慢生型大豆根瘤菌的遗传多样性研究

采用选择性扩增片断长度多态性 (简称AFLP)DNA指纹技术对来自泰国北部的 2 45株慢生型大豆根瘤菌进行遗传多样性的研究 .通过AFLP图谱揭示出该地区的慢生型大豆根瘤菌有较显著的遗传多样性 .从 2 45株中选择出 92个代表株用计算机进行的树状图分析结果表明 ,所分析的菌株在 82 %的相似性水平上聚类成 8个群 .对这 92个代表株的部分菌株和慢生型大豆根瘤菌的参比菌株进行多聚酶链反应 (PCR)扩增的 16SrDNA的 4种限制性内切酶长度多态 (简称 16SrDNAPCR RFLP)分析 ,得出 2个不同的 16SrDNAPCR RFLP类型的菌株 ,分别与慢生型大豆根瘤菌的参比菌株Bradyrhizobiumjaponicum和Bradyrhizobiumelkanii相同 .图 1表 2参 14     

四川攀西干热河谷区根瘤菌的多样性研究

采用数值分类、BOXAIR-PCR和16S rDNA PCR-RFLP方法,对分离自四川攀西干热河谷区11种豆科植物上的43株根瘤菌的表型和遗传多样性进行了研究.数值分类结果表明,攀西地区根瘤菌具有极大的表型性状多样性,在80%相似性水平上绝大多数供试菌株单独成群,能耐60℃(10min处理)的高温,在低温(10℃)或者低pH(4.0)条件下生长很差.与数值分类结果相比较,BOXAIR-PCR的分群结果更分散,说明供试菌株在遗传性状上也具有多样性.在数值分群基础上,选取15个代表菌株进行16S rDNA PCR-RFLP分析.结果表明,供试的15株代表菌株遗传差异明显,仅CCBAU61224与Rhizobium leguminosarum USDA2370T,CCBAU61303与Agrobacterium tumerfacienseIAM13129T具有相同的遗传图谱类型.数值分类和16S rDNA PCR-RFLP分析具有较好的一致性,BOXAIR-PCR适合于对根瘤菌种内菌株间的遗传多样性研究.图4表2参21     

陕甘宁地区根瘤菌数值分类与DNA同源性分析

在陕甘宁地区根瘤菌资源调查的基础上,选取其中与黄芪、岩黄蓍、木兰、鸡眼草及胡枝子共生的４０株快生根瘤菌和２５株参比菌株,对１３３项表型性状进行聚类分析,在８２％的相似性水平上构成５个不同于已知种的新亚群．对第１、２、３、４亚群ｘ（Ｇ＋Ｃ）／％测定及ＤＮＡ同源性分析结果表明,４个亚群ｘ（Ｇ＋Ｃ）／％含量均处于Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ属范围;各亚群内菌株ＤＮＡ同源性均在７５％以上,每个亚群中心菌株与１３个已知种模式菌株的ＤＮＡ同源性均小于６３％．从而证明,第１、２、３、４亚群为４个独立的快生根瘤菌新种群     

内蒙古中东部地区几种豆科牧草根瘤菌的表型多样性及水分梯度对其分布的影响

选用101株分离自扁蓿豆、胡枝子、野豌豆、锦鸡儿属植物的根瘤菌菌株，进行了营养利用、抗生素抗性、耐逆性和酶活性测定等84个表型性状分析，发现分离自同种寄主植物的根瘤菌由于地理来源的不相同而存在着较大的多样性．通过数值分类，各已知种分别聚群，101株未知菌在84％的相似水平上分为4个各不同的群．根据1、2、3、4群菌的聚类情况，结合在不同水分梯度下采集的豆科牧草根瘤菌，结果发现除个别菌外，绝大部分菌株呈现随着水分梯度的不同，各菌以类群形式分布．证明土壤中水分含量对根瘤菌的分布有很大影响．     

锰胁迫对青葙生长及叶绿素荧光特性的影响

通过温室水培实验,研究在不同锰质量浓度（2.5、50、100、150、200、300 mg·L-1）胁迫下青葙（Celosia argentea Linn.）的叶绿素含量、叶绿素荧光参数的变化,及对其生长的影响,探究青葙对锰毒的耐性。结果表明,随着Mn2＋质量浓度的升高,青葙叶片的叶绿素含量和叶绿素荧光参数值都出现不同程度下降。当Mn处理浓度大于50 mg·L-1时,叶绿素a、叶绿素b含量和总叶绿素含量显著下降,但在Mn质量浓度为100-300 mg·L-1的范围内,叶绿素b含量变化不明显（p〉0.05）。青葙的最大光化学量子产量（Fv/Fm）、最大荧光产量（Fm）、最小荧光产量（Fo）、光合量子产量（EQY）、表观光合电子传递速率（ETR）、光合化学淬灭系数（qP）均随Mn2＋质量浓度的增加显著降低,说明锰胁迫抑制了青葙的电子传递过程。但在150、200、300 mg·L-1质量浓度锰处理下ETR、EQY、qP下降趋势变缓,且ETR、EQY不存在显著差异。青葙株高与ETR、EQY的变化规律基本相似,根长则与对照组相比下降不显著,到300 mg·L-1才出现明显降低。试验结果证明青葙对锰毒具有耐性。     

NaCl胁迫对甜高粱发芽期生理生化特性的影响

为筛选耐盐甜高粱材料,探讨NaCl胁迫对甜高粱发芽期生理生化特性的影响,研究了0、70、140、210 mmol.L-1NaCl胁迫对吉甜3、BJK156、甜132、凯勒、威利、考利、吉甜2、戴尔等8个甜高粱材料发芽率、发芽势、发芽指数、活力指数、芽长、根长、芽鲜质量、根鲜质量等8个指标盐害系数的影响,利用系统聚类分类法对甜高粱耐盐性进行聚类可分为3类：耐盐性最强的是甜132,耐盐性中等的是BJK156,耐盐性较敏感的是考利、吉甜3、吉甜2、戴尔、凯勒、威利。进一步研究了盐胁迫对甜高粱芽苗中丙二醛、可溶性蛋白含量及过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）活性的影响。结果得出：随着盐胁迫的加重丙二醛含量逐渐增加,可溶性蛋白含量逐渐减少。NaCl胁迫不同程度地提高了8个甜高粱材料POD、CAT、SOD活性,受3种NaCl质量浓度胁迫后8个甜高粱材料POD、CAT、SOD活性的变化趋势不同,这可能是它们耐盐差异的生理原因之一。另外,在3种NaCl浓度胁迫后甜132中的丙二醛增加量在8个材料中都是最低的,这与系统聚类分析得出甜132耐盐性最强的结论相吻合。研究认为丙二醛含量的变化可以作为筛选发芽期耐盐甜高粱品种的一个指标。     

不同土壤胶质芽孢杆菌生理生化特征及其解钾活性

利用土壤矿物为K源的硅酸盐细菌选择性培养基,从我国部分省市土壤中筛选到30株胶质芽孢杆菌Bacillus muci-laginosus,以辽宁菌种保藏中心胶质芽孢杆菌LICC10201(编号K31)为参照菌株,对其生理生化特性、耐盐性、耐酸碱性、温度敏感性及解K能力等生物学特性进行了测定.结果表明,30株胶质芽孢杆菌菌体均为杆状,产生椭圆至圆形芽孢.其中K3、K9、K19、K31为短杆状,30株菌株均为G~-.NH_4~+、NO_3~-为良好N源,且能在无N培养基上生长.菌株K5、K12和K31解K能力较强,释放的K比不加菌液对照分别增加2.39倍、2.28和2.27倍;K5、K11、K26、K31在w=3%NaCl的培养基上能生长;在25～30℃范围内供试胶质芽孢杆菌均能良好生长;以上试验数据可为将来微生物肥料的研制提供必要的依据.     

分泌吲哚乙酸的蒌蒿内生耐镉细菌的筛选与鉴定

从蒌蒿（Artemisia selengensis）体中分离分泌吲哚乙酸（IAA）的内生耐镉（Cd）细菌将有助于构建有效的植物-微生物联合修复体系。本研究以分泌IAA和Cd耐性为筛选指标,采用研磨法从蒌蒿的根、茎、叶中分离能产生IAA的内生耐Cd细菌,并对其铅（Pb）、铜（Cu）、锑（Sb）的耐受性及对蒌蒿生长特性的影响进行研究,根据形态特性、生理生化测定和16S rDNA序列分析对目标菌株进行分类鉴定。结果表明,从蒌蒿体内分离获得2株分泌IAA能力较强的内生耐Cd细菌J2和Y5,J2和Y5菌对Cd的耐受质量浓度均为90 mg·L-1,IAA的分泌量分别为23.108、15.192 mg·L-1;J2菌能明显增加蒌蒿的株高、最长根长、平均根长、鲜质量和干质量,Y5菌可显著提高蒌蒿的株高、鲜质量和干质量;J2和 Y5菌对 Pb 的耐受质量浓度均为1200 mg·L-1,对Cu的耐受质量浓度分别为120和160 mg·L-1,对Sb的耐受质量浓度分别为50和150 mg·L-1;J2菌在LB平板上菌落为黄色、近圆形、粘稠,Y5菌在LB平板上菌落为白色、近圆形、湿润;J2和Y5菌的16S rDNA序列经扩增,分别获得1条大小约为1500 bp的条带,经比对分别与GenBank中Pantoea agglomerans STY29（HQ220151）、Pseudomonas fluorescens V7c10（KC195905）的相似性最高,结合形态特征与生理生化特性可分别鉴定为成团泛菌（Pantoea agglomerans）和荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）。研究表明,从蒌蒿体中分离获得分泌IAA能力较强的内生耐Cd成团泛菌和荧光假单胞菌,为进一步研究其在蒌蒿修复Cd污染土壤中的作用奠定了基础。     

低效低质人工林优化改造后林下植被多样性研究

采用样地调查法,对经过人工优化改造的陕西吴起县城周边的低效低质林,选取了其中的11种改造模式（即人工林林分）及1块天然次生林,进行了林下植被多样性的研究。结果表明：12个样地共调查到55种植物,各样地林下植物种有11-23种;阿尔泰狗娃花（altaicus（Willd．）Novopokr．）、达呼里胡枝子（davuriea（Laxm．JSehi月d1．）、赖草（JPc口li”淞（GeorgOTzveL）、针茅（capillataLinn．）、毛连蒿（vestitaWall．exBess．）和委陵菜（chinensisSer．）是最常见的种。而赖草、毛连蒿、达呼里胡枝子、华北米蒿（giraldiiPamp．）、茵陈蒿（capillarisThunb．）、艾蒿（1avandulaefolia DC．）是改造后人工林林下重要值最大的优势种,植物偶见种也较多;不同样地林下植物多样性指数差异显著;物种多样性指数Gleason指数和种间相遇机率（PIE）指数变化趋势基本一致,Simpsom指数、Pielou均匀度指数变化趋势与前两者相反,Shannon—Wiener指数变化趋势不明显。分析表明：人工林林下植被多样性较之天然林要差,其多样性受人工林林分密度、林龄及林分组成等影响。     

鸡爪槭光合特性对模拟酸雨的响应

研究了模拟酸雨（对照、pH 5.0、pH 4.0、pH 3.0、pH 2.0）胁迫对鸡爪槭（Acer palmatum Thunb.）叶片光合特性的影响。结果表明,试验前20 d,所有处理净光合速率日积分值（DIV of Pn）、蒸腾速率日积分值（DIV of Tr）及水分利用效率（WUE）日均值均显著高于对照（P〈0.05）。试验中后期（喷后40 d、喷后60 d）,pH 5.0的处理Pn日积分值均最高,WUE相对较高而Tr日积分值相对较低。pH≤4.0的处理在同一时期Pn日积分值、Tr日积分值均随pH值的降低而降低,WUE日均值变化趋势则相反。各处理Pn日积分值、Tr日积分值和WUE日均值均随试验时间的延长而降低。喷后60 d,pH 4.0的处理较pH 2.0和pH 3.0的处理WUE低而Pn日积分值和Tr日积分值则相反。综合分析表明,pH 5.0的酸雨处理有利于鸡爪槭叶片光合能力的发挥,酸度低于pH 3.0则会使光合能力下降,影响植株生长。     

酸雨对全生育时期水稻叶绿素荧光的影响

酸雨是全球关注的重大环境污染问题之一,中国亦继西欧和北美之后,成为当今世界第三大酸雨区。光合作用是植物生物量和作物经济产量形成的生理基础,叶绿素荧光常用来判断逆境胁迫对植物光合作用造成的伤害。有研究表明,酸雨会对植物叶绿素荧光造成影响,然不同生长阶段植物对逆境的抵抗能力亦存在差异,采用模拟酸雨（酸雨 pH 值梯度为4.5、3.5、2.5）或模拟天然降水持续胁迫（每隔3天喷施1次）水稻（Oryza sativa）（从幼苗期至灌浆期）,利用原位无损伤叶绿素荧光测定技术（德国Walz公司PAM-210脉冲调制式荧光仪）分别探测和分析幼苗期、分蘖期、孕穗期和灌浆期水稻叶片（处理组和对照组）,研究酸雨对全生育期水稻叶绿素荧光的影响,相关研究未见报道。结果表明,与CK相比,pH 4.5酸雨使幼苗期和孕穗期初始荧光（Fo）显著提高了7.69%、8.84%,使幼苗期、分蘖期和孕穗期非光化学猝灭参数（qN）显著提高了8.64%、4.86%、6.09%,使幼苗期和孕穗期最大光化学量子产量（Fv/Fm）,PSII电子传递速率（ETR）,实际原初光能捕获效率（ΦPSII）,光化学猝灭参数（qP）显著降低,幼苗期、孕穗期降幅依次为Fv/Fm（3.01%、6.88%）、ETR（8.40%、10.24%）、ΦPSII（8.39%、12.23%）、qP（3.79%、12.55%）;pH 3.5、pH 2.5酸雨不同程度地显著降低了各生育时期Fv/Fm、ETR、ΦPSII、qP,幼苗期和孕穗期qN,显著提高了各生育时期Fo,且随酸雨pH值降低,变化幅度增大。同时,pH 4.5或pH 3.5酸雨持续胁迫下,水稻受到伤害大小规律为灌浆期＆lt;幼苗期＆lt;分蘖期＆lt;孕穗期;pH 2.5酸雨持续胁迫下,水稻受到伤害大小规律为分蘖期＜幼苗期＜灌浆期＜孕穗期。总之,酸雨胁迫强度与水稻叶绿素荧光参数存在剂量-效应关系,酸雨持续胁迫会对不同生育时期水稻光合作用造成影响,并且不同生育时期水稻光合作用对酸雨胁迫敏感性存在差异,这些是评价酸雨胁迫对植物影响时需考虑因素。     

干旱胁迫对文心兰抗氧化酶活性和渗透调节物质含量的影响

以切花文心兰＂黄金2号＂（Oncidium Gower Ramsey‘Gold 2’）幼苗及成熟苗为材料,用盆栽控制浇水模拟干旱的方法,对不同程度干旱胁迫下其叶片抗氧化酶活性和渗透调节物质含量的变化进行研究。结果表明,文心兰＂黄金2号＂具有一定的耐旱性。随着干旱胁迫程度的加深,文心兰幼苗及成熟苗的相对含水量和相对电导率变化慢、幅度小,超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化物酶（POD）活性能保持一定水平,渗透调节物质可溶性糖和脯氨酸含量持续上升,表明文心兰＂黄金2号＂对干旱胁迫具有较强的适应能力。