2种化感物质胁迫下内生真菌感染对木麻黄幼苗小枝活性氧代谢和清除系统的影响

为探讨使用木麻黄-内生真菌共生体应对连栽障碍的可能性,在前期已获得2种木麻黄化感物质(槲皮黄素-3-α-阿拉伯糖苷,Q3A;槲皮黄素-3-β-葡萄糖苷,Q3B)胁迫对木麻黄(Endophyte-free,EF)幼苗小枝活性氧代谢和清除系统影响的基础上,本研究以感染(Endophyte-infected,EI)内生真菌Aspergillus sp.的木麻黄水培幼苗(Casuarina equisetifolia Forst.)为实验材料,在控制环境水培条件下,分析内生真菌对Q3A和Q3B胁迫下木麻黄幼苗小枝活性氧代谢和清除系统的影响.结果显示,内生真菌的侵染能够有限缓解木麻黄化感物质的胁迫,在中度轻度及短期胁迫(100 mg/L 0-12 h、50 mg/L 0-24 h、25 mg/L 0-36 h、12.5 mg/L 0-48 h)下有明显的效果,表现在与木麻黄EF相比,木麻黄EI活性氧含量显著下降,丙二醛(MDA)含量显著降低,保护酶活性显著增加;内生真菌缓解化感物质胁迫的有效浓度和胁迫期与木麻黄EF能够耐受的化感物质胁迫浓度和胁迫期一致;Q3A胁迫下木麻黄EI保护酶活性显著高于Q3B胁迫下的提升幅度.说明内生真菌提升了宿主木麻黄的抗逆性,对宿主应对Q3A胁迫的贡献更大,推测内生真菌对木麻黄EI保护酶系统的提升需要建立在木麻黄保护酶系统合成和降解还未受到不可逆伤害的前提下.(图6表1参40)     

均匀设计法优化高效杀藻菌Microbulbifer sp.BS03培养基及发酵条件

采用均匀设计法设计和二次多项式逐步回归分析,对一株高效杀塔玛亚历山大藻微泡菌BS03(Microbulbifer sp.)产杀藻活性物质的发酵培养条件进行优化.通过单因素实验筛选出碳源、氮源、pH、培养时间和接种量为显著影响因子,并对5个显著影响因子采用U15(155)水平对培养基进行优化.结果表明BS03最适发酵培养条件为:蔗糖8 g/L,蛋白胨10.50 g/L,初始pH值7.5,培养时间32 h,接种量3.00%.验证试验结果显示,在此条件下该菌发酵液的干重为4.725 g/L,较优化前增加了31.35%,LD50为0.768%,较优化前降低了25.14%.研究结果为杀藻活性物质以及杀藻机理的研究奠定了理论基础.     

抑制多重耐药致病菌的丹参内生真菌的筛选、鉴定及次生代谢产物分析

对四川道地药材丹参内生真菌的抑菌活性及其次生代谢产物进行研究,以期寻找出抑制多重耐药致病菌的新型抗菌物质.通过分离纯化丹参茎和叶中的内生真菌,得到145株菌株,将菌株发酵液分别进行普通致病菌(肠炎沙门氏菌、鸡白痢沙门氏菌、绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌O157:H7和鼠伤寒沙门氏菌)和多重耐药致病菌(沙门氏菌耐药株、金黄色葡萄球菌耐药株和大肠杆菌耐药株)的抑菌试验,筛选得到3株具有显著抑菌效果的菌株.其中抑菌效果最显著的一株菌株S4,经形态学观察和18S rDNA序列分析确定其为Phomopsis sp.对S4发酵液的乙酸乙酯萃取相进行大类成分、LC-MS和GC-MS分析,结果显示发酵液中富含酚性物质、生物碱、对羟基苯乙醇等重要生物活性物质.本研究表明丹参内生真菌抑菌效果显著,富含活性物质,为耐药菌的控制提供了新的资源.表5图4参20     

野生白桦茸的分离鉴定及其生物学特性

以采集自俄罗斯的野生白桦茸菌核为原料,经组织分离获得纯培养菌株(编号F1501),进一步进行分类鉴定、最适生长条件、液体发酵产多糖及其抗氧化活性与人工驯化研究.依据内转录间隔区ITS鉴定,确定F1501菌株属于锈革菌科纤孔菌属(Inonotus)真菌,其与桦褐孔菌(Inonotus obliquus)的相似性为99%;结合菌核、菌丝形态学特征,确定F1501菌株为桦褐孔菌.最适培养条件研究实验表明,F1501菌株的最适碳源、氮源、C/N、生长因子、温度、pH值分别为麦芽糖、牛肉浸膏、10/1、VB2、28℃、8.0;以马铃薯葡萄糖(PD)培养基、10%接种量、28℃、150 r/min培养10 d,发酵液中多糖含量为476.32 mg/L,总抗氧化活性为0.19 mmol/L(Trolox),对羟自由基(·OH)清除率为72.7%.以棉籽壳为主要栽培基质进行人工驯化试验,可以形成类子实体结构.本研究获得野生桦褐孔菌菌株,其生物学特性研究结果可为野生桦褐孔菌的人工驯化和开发利用提供理论依据.     

一株草莓根腐尖孢镰刀菌拮抗内生细菌的分离鉴定及抑菌特性

为筛选对草莓根腐尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)有较好抑菌活性的草莓内生细菌,从草莓的根、茎、叶和果实中分离内生细菌,采用平板对峙法筛选具有抑菌活性的菌株,经形态特征观察、生理生化特性及分子鉴定后,进行拮抗菌抑菌特性分析.结果筛选到1株对草莓根腐尖孢镰刀菌具有较高抑菌活性(抑菌带达9.8 mm)、稳定性较好的菌,标记为SY-4.此外,该菌对桃褐腐病菌(Monilinia fruticola)、棉花红腐病菌(Fusarium moniliforme)和草莓根腐石楠拟盘多毛孢(Pestalotiopsis photiniae)等也有较好的拮抗作用.SY-4经鉴定确定为枯草芽胞杆菌.SY-4发酵液在培养时间48 h、培养温度37℃、pH值为7时,抗菌效果最好,但发酵产物不耐高温、不耐酸、较耐碱性,对蛋白酶敏感,初步说明存在蛋白类抑菌活性物质.电镜观察发现SY-4发酵液处理草莓根腐尖孢镰刀菌后,菌丝形态变得不规则.该拮抗内生细菌是潜在的植物病原真菌生防菌资源,具有一定的开发与应用价值.     

菲律宾蛤仔(Ruditapes philippinarum)血淋巴中抑菌活性物质的活性影响因素

为了建立蛤仔血淋巴中抑菌活性物质的快速高效分离、纯化方法，利用正交设计法对影响菲律宾蛤仔血淋巴中抑菌物质抑菌活性的3个因素进行了探讨．结果表明，在本实验条件下，pH对抑菌活性影响最大，温度次之，处理时间的影响最小；而以在pH值为4，温度小于65℃的介质中活性物质能保持较高抑菌活性．提示菲律宾蛤仔血淋巴中抑菌活性物质对热有一定的耐受性，且适于偏酸性的环境．表2参10     

槲皮黄素-3-α-阿拉伯糖苷胁迫下内生真菌对木麻黄幼苗根系形态和生理特性的影响北大核心CSCD

采用水培方式研究不同浓度化感物质槲皮黄素-3-α-阿拉伯糖苷（Q3A）胁迫对感染（EI）和未感染（EF）内生真菌的木麻黄幼苗根系形态和生理特性的影响.结果显示：不同浓度Q3A胁迫下,感染内生真菌能够有限缓解化感物质的胁迫,在中轻度胁迫（50、25、12.5 mg/L）下有明显的效果,表现在与木麻黄EF相比,木麻黄EI根系生物量、根系总长、根表面积显著增加;根系活力显著提升,根系渗透调节物质除可溶性蛋白含量显著增加外,可溶性糖、游离脯氨酸含量显著降低;根系抗氧化系统除谷胱甘肽还原酶（GR）活性显著降低,超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、愈创木酚过氧化物酶（GPX）、抗坏血酸过氧化物酶（APX）、还原型抗坏血酸（AsA）和还原型谷胱甘肽（GSH）含量均能显著增强;过氧化氢（H2O2）、羟自由基（OH·）含量、超氧阴离子（O2^-）产生速率和膜脂过氧化产物丙二醛（MDA）含量也显著降低;内生真菌缓解化感物质胁迫的有效浓度与木麻黄根系能够耐受的化感物质胁迫浓度存在一定相似性.上述研究表明内生真菌能在一定条件下缓解不同浓度化感物质槲皮黄素-3-α-阿拉伯糖苷胁迫对木麻黄幼苗根系生长的抑制和氧化损伤,提升木麻黄根系的抗逆性,在木麻黄根系适应化感胁迫的调节中起关键作用.     

冬虫夏草内生菌NS2-B1发酵培养基筛选

以核苷类物质为目标产物筛选冬虫夏草内生真菌NS2-B1生产具有和冬虫夏草相似活性成分的培养基.通过单因素实验,分别从5种碳源(蔗糖、果糖、葡萄糖、麦芽糖、淀粉)和5种氮源(尿素、硝酸铵、牛肉膏、酵母膏、蛋白胨)中各筛选出2种最佳碳源和氮源;然后通过4因素3水平正交实验L_9(3~4),以代谢产物总核苷(尿苷、鸟苷、腺苷和虫草素)为指标筛选最佳的碳、氮源组合.结果显示:NS2-B1液体发酵培养基组合为麦芽糖2%、淀粉1.5%、酵母膏1.5%、蛋白胨1%,附加KH_2PO_4 0.8 g/L和MgSO_4.7H_2O 0.8 g/L;利用该培养基在25℃、210 r/min条件下震荡培养,5 d后菌丝体发酵液中总核苷的产量达到(92.62±4.19)μg/m L.综上,从天然冬虫夏草中分离的内生真菌NS2-B1具有替代冬虫夏草生产核苷类物质的潜力.     

一株桃树内生真菌Pestalotiopsis vismiae N1培养条件优化与抗氧化、抗菌活性分析

对一株内生真菌韦司梅拟盘多毛孢(Pestalotiopsis vismiae)的培养条件进行探究,在此基础上进一步对其发酵提取物抗氧化、抗菌活性进行分析.通过测定菌丝的生长速度寻找菌丝培养适宜的温度、碳源、氮源和pH,并采用正交试验优化培养条件;通过测定菌株深层发酵液提取物对羟基和DPPH自由基的清除率以分析其抗氧化活性;通过测定菌株深层发酵液提取物对多种病原细菌抑菌圈大小的影响来分析其抗菌活性.结果表明,韦司梅拟盘多毛孢菌丝最适宜培养温度为25℃,在该温度培养条件下菌丝生长最佳碳源为蔗糖,最佳氮源为酵母提取粉,最佳初始pH为6.5,这3种因素的显著性差异大小顺序为碳源氮源 pH;菌株深层发酵液提取物具有良好的抗氧化活性,其对羟基自由基和DPPH自由基清除率的EC50分别为1.19 mg/mL和0.56 mg/mL;菌株发酵液提取物对铜绿假单胞杆菌、金黄色葡萄球菌均具有一定的抑制作用;深层发酵液提取物抗氧化和抗菌活性具有一定的稳定性.本研究结果可为深入开发利用该真菌资源提供科学依据.(图12表3参26)     

高原土壤中稻瘟病拮抗细菌的抑菌效果及抗菌机理

利用平板稀释法从西藏7个不同地点的土壤中分离筛选细菌,并通过平板对峙法对所分离菌株的稻瘟病菌抑制效果进行初筛,获得一株拮抗细菌YN01,对其进行生理生化和分子生物学鉴定、最适生长和发酵条件筛选,分泌IAA和铁载体能力检测及稻瘟病菌孢子抑制实验.经形态、生理生化特征和分子生物学鉴定,确定菌株YN01为萎缩芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus).YN01对稻瘟病菌丝生长的抑制率超过90%,最适生长碳源、氮源分别为蔗糖和酵母粉,在pH值低于6时不能正常生长,最适生长温度为30-35℃;碳源及氮源分别为乳糖和谷氨酸、pH值为8以及培养温度为30-35℃时发酵液抑菌活性最强;YN01能够分泌IAA,浓度达到4.287 mg/L,同时能够产生铁载体,可溶性指数为1.72;与阴性对照相比,菌悬液和发酵液对稻瘟病菌的孢子萌发起到显著的抑制效果.拮抗菌菌体通过与病原菌丝进行营养和空间位点竞争以及产生有抑菌效应的代谢产物,从而导致稻瘟病菌的孢子萌发缓慢,菌丝发育停滞,扰乱其生理活动,达到抑菌目的.综上,拮抗细菌YN01具有较强的抑菌活性,是潜在的植物病原真菌生防菌资源,具有一定的开发与应用价值.     

拟威克酵母产生表面活性剂的发酵条件

通过单因子试验和正交试验,对拟威克酵母WickerhamielladomercqiaeY2A产生槐糖脂的发酵培养基组成和发酵条件进行了优化.培养基组成为:8.0%葡萄糖、8.0%菜子油、0.3%酵母粉;发酵条件为:初始pH值6.0、接种量2.5%、发酵时间120h.在此条件下,槐糖脂产量可达到41.3gL-1.图4表5参16     

产氢新种Ethanoligenens harbinese B49的氮素营养与代谢特征

从氮源角度研究了一株产氢新种Ethanoligenens harbineseB49发酵葡萄糖和糖蜜的产氢特性及其营养需求,以及酵母粉对产氢菌E.harbinese B49生长和产氢的特殊效应.试验结果表明,在以葡萄糖为底物条件下,以酵母粉替代蛋白胨作为唯一氮源可以大大提高E.harbineseB49的产氢能力,单位体积产氢量从1700mL L-1培养基提高到2400mL L-1培养基,产氢能力提高40.35%.该条件下去除维生素液,E.harbinese B49的产氢能力不受影响.从E.harbinese B49产氢动力学分析可以看出,对数生长期处于12~22h期间.从对数期开始迅速产氢,并且一直持续到稳定前期,产氢速率达到16.8mL/h,生物气中最大氢含量为41%.驯化后的E.harbinese B49利用糖蜜为底物产氢,糖蜜COD为13g L-1时,单位体积最大产氢能力为1576mL L-1.当培养基中额外加入0.5g L-1酵母粉时,可以大大促进E.harbinese B49发酵糖蜜产氢的能力,单位体积氢产量达到1960mL L-1,提高了24.4%,比产氢率达到150.8mL(H2)/g(COD).以牛肉膏、蛋白胨、尿素为氮源时,E.harbineseB49产氢量提高较小.图4表2参16     

螺孢菌ZG9901的筛选及其产碱性果胶酶发酵条件研究

用筛选培养基从芦苇土壤中筛选到７株碱性果胶酶产生菌株,经初筛选和复筛得到产酶活性较高的一株菌株ＺＧ９９０１,初步鉴定为螺孢菌属Ｓｐｉｒｉｌｌｏｓｐｏｒａ ｓｐｐ．最适摇瓶产酶条件是：果胶２０ｇ／Ｌ,乳糖２０ｇ／Ｌ,蛋白胨３ｇ／Ｌ,酵母膏４ｇ／Ｌ,ＫＨ２ＰＯ４１ｇ／Ｌ,ＭｇＳＯ４．７Ｈ２Ｏ０．０４ｇ／Ｌ,ＭｇＣｌ２０．２ｇ／Ｌ,ｐＨ９．０,３２℃培养３６ｈ达到产酶高峰。     

华重楼内生菌Iun35的分离及其抗菌蛋白的性质

从华重楼(Paris polyphylla Smith var.chinensis)块茎中分离纯化得到一株具有较强抑菌活性的内生细菌Iun35,经形态特征、生理生化特性及16S rDNA鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis).将分离得到的Iun35菌株发酵培养,培养液上清经硫酸铵分级沉淀、Sephadex G-75凝胶柱层析和DEAE-32纤维素柱层析分离纯化出一种抗菌蛋白UD35.用该蛋白对多种植物病原菌进行拮抗测定,结果显示,UD35对玉米纹枯病菌(Rhizoctonia solani Kuha)、小麦赤霉病菌[Gibberelle zeae(Schw.)]等多种菌有强烈抑制作用.测定其相对分子质量约为55 000,氨基酸分析结果表明其由17种氨基酸组成.图3表4参16     

Clostridium papyrosolvens厌氧发酵产氢研究

采用分批培养研究了从高浓度厌氧产氢活性污泥中筛选的优势菌种Clostridium papyrosolvens的发酵产氢能力.结果表明:该菌有较强的高糖耐受性和耐酸性,当葡萄糖浓度为30 g/L、pH阶段性控制在4.5时,发酵44 h葡萄糖消耗率为83.7%,总产气量达到3 081.3 mL/L,最高产气率为187.5 mL L-1 h-1,氢气含量为67.5%,比产氢率达1.06 mol(H2)/mol(葡萄糖).研究中选用了廉价的发酵产氢培养基,以玉米浆为氮源,以还原铁粉作氧化还原电位控制剂,省去了牛肉膏、蛋白胨等昂贵氮源以及L-半胱氨酸、维生素、无机离子等高成本组分,显著降低了纯菌发酵的培养基成本,获得了较好的产氢效果.图5表2参23     

深黄伞形霉(Umbelopsis isabellina)华2-1产油发酵培养条件优化

为开发微生物油脂资源,从富含油脂的土样中分离获得一株产油脂微生物——深黄伞形霉(Umbelopsisisabellina)华2-1,油脂含量达48.60%.采用单因素和正交实验方法,对深黄伞形霉华2-1的发酵培养条件进行优化研究.优化的培养条件为:葡萄糖100 g/L,酵母粉3 g/L,接种量为20%,初始pH值为5.0～6.0,MgSO4.7H2O和KH2PO4的添加浓度分别为0.5 g/L和2 g/L,培养温度为31℃,最佳发酵培养时间为168 h.华2-1在优化发酵条件下可获得菌体生物量、油脂产量和油脂含量分别为45.86 g/L、24.47 g/L和59.53%,较优化前分别提高了21.48%、33.42%和22.49%.因此,深黄伞形霉华2-1作为微生物油脂生产的新资源具有广阔的应用前景.     

产二羰基醛酮还原酶的1株嗜麦芽寡养单胞菌研究

用含甲基乙二醛的LB培养基平板筛选到1株能代谢甲基乙二醛的细菌,通过对克隆到的16S rDNA基因序列比对及生理生化实验,将其鉴定为嗜麦芽寡养单胞菌,命名为Stenotrophomonas maltophilia YL.破碎该菌细胞后提取粗酶,以甲基乙二醛作反应底物,在还原性辅酶Ⅰ存在条件下,紫外光谱和HPLC的分析表明,该菌能代谢甲基乙二醛;并对其产酶条件进行了研究.紫外分光光度法测得酶活力表明,该菌有较强的醛酮还原酶活力;并对温度和pH值对酶活力的影响作了分析.图5表1参17     

Production of an antimicrobial cytochalasan by an endophytic Chaetomium globosum HYML55 from Hypericum mysorense and its RNA secondary structure analysis

The mutualistic benefits and disadvantages of non-clavicipitaceous endophytes for their hosts are not well studied and are postulated as being distinct from free-living or pathogenic counterparts. The defensive metabolites and antioxidants produced by endophytes are postulated to be the benefits offered for the hosts. Therefore, the antimicrobial and free-radical-scavenging activities of a foliar endophyte Chaetomium globosum HYML55 isolated from Hypericum mysorense of Western Ghats, India were studied. RNA secondary structure analysis refuted the unique biotope postulation because strain HYML55 was more similar to a coprophilous strain than to endophytic strains. Ethyl acetate extract of the fungus inhibited bacteria and fungi. The extract also quenched 98.65% 1,1-diphenyl- 2-picrylhydrazyl radicals with total antioxidant capacity of 13.62 mg ascorbic acid equivalent/g. A yellow amorphous antimicrobial compound purified from the extract was identified as chaetoglobosin F, which had a minimum inhibitory concentration of 7.8–15.6 μg/mL, except against Pseudomonas aeruginosa. This is the first report on the antimicrobial activity of chaetoglobosin F and other bioactivities of any endophytes from H. mysorense. The study emphasises the inter-habitat cycling of endophytes and possible benefits of C. globosum for the host. Chaetoglobosin F is an anti-inflammatory and anti-neoplastic compound, and C. globosum HYML55 could be exploited for the industrial production of this compound.     

一株耐盐嗜热菌Aneurinibacillus thermoaerophilus H7的分离及其油脂降解特性

针对高盐、高油餐厨垃圾高温堆肥功能菌株缺乏的问题,以大豆油为唯一碳源,通过测定生物量、脂肪酶活性和油脂降解率,从餐厨垃圾堆积处的土壤样品中分离筛选出一株嗜热油脂降解菌H7.通过形态特征、生理生化特征和16SrDNA序列分析,对筛选的菌株进行鉴定,考察其耐盐能力、油脂降解和生长特性.结果表明,菌株H7为嗜热嗜气解硫胺素芽孢杆菌(Aneurinibacillus thermoaerophilus),最高耐盐浓度为30 g/L.菌株H7在油脂浓度为15 g/L的发酵培养基中发酵72 h,油脂降解率为60.11%,菌体浓度OD600为1.88,脂肪酶活性为11.65 U/mL.菌株H7可生长的温度为40-60℃,pH值为5-8,摇床转速为120-240 r/min,最适生长的温度为50℃,pH值为6,摇床转速为220 r/min.本研究获得了具有耐盐性和能降解高浓度油脂的嗜热菌株H7,可为高盐高油脂含量的餐厨垃圾堆肥提供微生物菌种资源.(图8表2参34)     

一株能产生聚乙烯醇降解酶的委内瑞拉链霉菌

以聚乙烯醇(PVA)为唯一碳源,从土壤中筛选到1株能产生胞外PVA降解酶的放线菌GY1.根据扩增出的该菌株的16SrDNA全序列在GenBank中的比较结果,结合生理生化实验、细胞化学成分及菌落形态分析,确定该菌为委内瑞拉链霉菌(Stretopmycesvenezuelae).GY1菌株以PVA为唯一碳源时,产生的PVA降解酶活性达到120UL-1,是以葡萄糖或可溶性淀粉为唯一碳源时的10倍.当在PVA培养基中添加1gL-1至3gL-1的葡萄糖时,该菌株细胞量和PVA降解酶总酶活随着葡萄糖添加量的增加而增加,最大细胞量是未添加葡萄糖时的2.4倍,最高总酶活是未添加葡萄糖时的2.6倍,而单位质量细胞产生PVA降解酶的能力提高不大.但当添加的葡萄糖浓度从3gL-1增至10gL-1时,总酶活随着细胞量的增加出现下降趋势,同时单位质量细胞产生PVA降解酶的能力也大大降低.在相同PVA聚合度下,高醇解度PVA比低醇解度PVA更有利于GY1菌株的生长及产生PVA降解酶.图5表1参16