微生物介导厌氧甲烷氧化反硝化过程及其反应机制探讨

微生物进行的厌氧甲烷氧化反硝化过程是减少自然环境中甲烷这一温室气体排放的重要生物途径,即反硝化型甲烷厌氧氧化(denitrifying anaerobic methane oxidation,DAMO)。反硝化型甲烷厌氧氧化是指在厌氧条件下以甲烷作为电子供体,NO2-/NO3-作为电子受体的反硝化过程。Candidatus Methylomirabilis oxyfera细菌和Candidatus Methanoperedens nitroreducens古菌是参与DAMO过程的2类主要功能微生物。深入了解微生物介导的DAMO的发生机理以及影响因素,有助于更好地理解碳氮耦合在生物地球化学循环中发生的重要作用,为DAMO工艺的开发与应用提供理论依据。本文从功能微生物的富集、影响因素、生理特性、生物代谢与反应机制等方面对DAMO的最新进展进行阐述,并探讨了DAMO未来的研究方向与应用前景。     

反硝化型甲烷厌氧氧化(DAMO)系统温度耦合模型研究

对Anammox-DAMO系统、Nitrite-DAMO系统、Nitrate-DAMO系统进行基质降解动力学研究,建立了3个DAMO系统温度耦合模型,并对建立的温度耦合模型进行拟合分析.结果表明,二级基质降解动力学能更好地描述Anammox-DAMO系统脱氮动力学行为,半级基质降解动力学能更好地描述Nitrite-DAMO系统和Nitrate-DAMO系统脱氮动力学过程.在15～50℃条件下,3个系统脱氮效率均在35℃时达到最高,对脱氮动力学的评估表明,3个系统反应动力学均符合Arrhenius方程.根据动力学模拟得出,Anammox-DAMO系统受高温影响更明显,而另外两个系统则受低温影响更明显.     

氨氮对反硝化型甲烷厌氧氧化细菌的影响机理研究

反硝化型甲烷厌氧氧化(Denitrifying Anaerobic Methane Oxidation,DAMO)是以甲烷为电子供体和唯一碳源,以硝酸盐或亚硝酸盐为电子受体的一种氧化还原反应,可用于废水脱氮,而氨氮是含氮废水中存在的主要形式.目前的研究认为主导DAMO过程的微生物主要有DAMO细菌和DAMO古菌.本文以DAMO细菌为优势菌种的系统为研究对象,通过短期和长期试验,从宏观和微观上研究了氨氮对该系统短期和长期的影响,并比较了不同pH体系下影响效果差异,揭示了相关影响机理.短期试验研究表明,氨氮对该系统的安全浓度为250 mg·L~(-1).当氨氮浓度为500 mg·L~(-1)时,对该系统的脱氮效率造成明显的抑制作用,并且随着浓度、时间的增加,氨氮对其的抑制效果增强;不同pH条件下抑制效果的差异对比发现,在碱性条件下,真正起抑制作用的是氨氮的质子化形式FA(Free Ammonia),在中性及酸性条件下,真正起抑制作用的抑制因子是离子化的NH_4~+.通过扫描电镜对系统中絮状污泥分析发现,在氨氮的短期抑制后,系统内的微生物出现了明显皱缩,丝状菌的数量增加;采用高通量测序技术分析了长期氨氮抑制后的系统,结果显示,系统内菌群结构发生较大改变,物种的多样性和丰度都大大降低.通过菌属分析认为,系统脱氮效率的降低是由于Methylomonas(甲基单胞菌属)数量的减少引起的.     

厌氧氨氧化细菌和反硝化厌氧甲烷氧化细菌在岸边带土壤中的分布规律

厌氧氨氧化(anaerobic ammonium oxidation,anammox)和反硝化厌氧甲烷氧化(nitrite-dependent anaerobic methane oxidation,n-damo)的发现打破了人们长久以来对生物氮、碳循环的传统认识.厌氧氨氧化细菌(anammox bacteria)和反硝化厌氧甲烷氧化细菌(n-damo bacteria)在水生态系统均有分布,并且在全球氮、碳循环中发挥重要作用.但它们在岸边带土壤中的存在和分布还不甚清楚.因此,本文对湖泊岸边带土壤中厌氧氨氧化细菌和反硝化厌氧甲烷氧化细菌的存在和分布进行了研究.基于厌氧氨氧化细菌hzs B基因(联氨合成酶关键基因)和M.oxyfera-like细菌16S rRNA基因的序列分析,分别证明了厌氧氨氧化细菌和M.oxyfera-like细菌在白洋淀湖泊岸边带深层土壤中的共同存在.厌氧氨氧化细菌hzs B基因定量PCR结果显示,其主要分布在地下水位附近及以下部分(40~100 cm),而在表层(0~40 cm)土壤中未被检测到.M.oxyfera-like细菌16S rRNA基因定量PCR结果显示,不同深度的土壤均有M.oxyfera-like细菌分布,并且其丰度随着土壤深度的增加而递增.这些结果说明厌氧氨氧化细菌和M.oxyfera-like细菌在湖泊岸边带深层土壤中共同存在,并且有不同的分布规律.     

浑河底泥反硝化厌氧甲烷氧化菌群落结构时空特征

为了解在反硝化厌氧甲烷氧化反应过程中起主要作用的微生物——Candidatus Methylomirabilis oxyfera(M. oxyfera)在河流底泥环境中的时空变化特征,利用克隆文库及实时荧光定量PCR技术考察了浑河流域部分底泥中M. oxyfera-like的16S rRNA和pmoA功能基因的多样性及丰度. 结果表明:从浑河上游至下游丰水期各采样点底泥中M. oxyfera-like的16S rRNA的多样性无明显地域性差异,其OTU(operational taxonomic unit,独立操作单元)数变幅不大;pmoA功能基因的多样性则存在较为明显的地域性差异,上游采样点A(章党大桥)底泥中OTU数为5,下游采样点E(三岔河大桥)底泥中仅为1. 采样点A底泥中M. oxyfera-like的16S rRNA和pmoA功能基因的多样性均存在一定的季节性差异,平水期16S rRNA和pmoA功能基因的Shannon-Wiener多样性指数分别为1.48和2.19,在各期中最高;而枯水期时二者均最低,分别为0.83和1.26. 丰度分析结果显示,所有采样点底泥中M. oxyfera-like的16S rRNA丰度均表现为平水期(2.42×106~1.74×107 copies/g)(以干质量计)最高、枯水期(2.87×104~4.19×106 copies/g)居中、丰水期(1.29×103~2.04×104 copies/g)最低,说明浑河底泥中M. oxyfera-like的丰度亦存在一定的季节性差异.      

微氧条件下以甲烷为碳源的反硝化实验研究

为探清微氧条件下以甲烷为碳源的反硝化是甲烷好氧氧化偶联反硝化(AME-D),还是甲烷厌氧氧化偶联反硝化(ANME-D),本研究以污水处理厂厌氧污泥为接种物,在微氧条件下以甲烷为碳源进行硝酸盐和亚硝酸盐反硝化的富集培养,考察硝酸盐和亚硝酸盐的反硝化速率,并对富集培养物的微生物群落和甲烷单加氧酶功能基因进行分析.结果表明:微氧条件下硝氮/亚硝氮的还原主要以AME-D过程为主,稳定阶段硝氮和亚硝氮的平均去除速率分别为3.69 mg·L~(-1)·d~(-1)(以N计)和18.04 mg·L~(-1)·d~(-1)(以N计),富集培养物中的优势微生物为甲基球菌科(Methylococcaceae)中的甲基单胞菌属(Methylomonas),相对含量为21.86%.     

西湖底泥中的反硝化型甲烷厌氧氧化菌的分子生物学检测

反硝化型甲烷厌氧氧化反应(Denitrifying anaerobic methane oxidation,DAMO)是一种最新发现的生物反应,该反应能够偶联反硝化和甲烷的厌氧氧化.催化DAMO反应的微生物是NC10门中一种被命名为“Candidatus Methylomirabilis oxyfera”的细菌.本研究采用基因克隆文库技术考察了西湖淡水底泥中DAMO微生物的分布与种群多样性状况.16S rRNA基因系统发育分析表明,西湖底泥中存在NC10门细菌,与已知的M.oxyfera的16S rRNA基因相似度为93％～98％.DAMO微生物功能基因(pmoA)的系统发育分析进一步证实了西湖底泥中分布有此类微生物,与已知的Moxyfera的pmoA基因相似度为86％ ～ 95％.实时定量PCR结果表明,西湖底泥中DAMO微生物的16S rRNA基因的拷贝数为2.15 ×105 copies·g-1(以干重计).     

基于好氧甲烷氧化菌的反硝化效能及微生物群落研究

采用气体循环序批式生物膜反应器（gcSBBR）,构建反硝化型甲烷好氧氧化（AME-D）系统.考察了进水氮负荷的影响,发现氮负荷为0.075kg/（m³·d）时,硝酸盐氮去除率达到98.93%,其反硝化速率为74.25mg/（L·d）,系统的甲烷日平均消耗量为35.91%（初期为50%）;扫描电子显微镜（SEM）分析结果显示,系统中的微生物主要以短杆菌（12~18 μm）为主,并存在少量的丝状菌（长150~200μm）;16S rRNA高通量测序结果显示,该系统中的甲烷氧化菌为Methylocaldum、Methylomonas、Methylococcus和Methylococcaceae_unclassified,反硝化菌为Denitratisoma、Hydrogenophaga、Azoarcus、Thiobacillus和Rhodobacter,其中主要的功能微生物为Methylocaldum、Denitratisoma和Hydrogenophaga,系统对氮的去除是由好氧甲烷氧化菌与反硝化菌协同实现.此外,系统中存在大量以甲醇和甲基胺类物质为生长基质的Methylophilaceae_uncultured（30.4%）.     

典型抗生素对湿地反硝化甲烷厌氧氧化的影响

选取甲烷排放通量较高并且受喹诺酮类抗生素(QNs)污染较严重的白洋淀湿地为研究对象,通过开展¹³C标记的微宇宙实验,研究典型QNs包括:氧氟沙星(OFL)、诺氟沙星(NOR)和氟甲喹(FLU)对白洋淀湿地DAMO过程的短期影响.结果表明:3种QNs均促进了微生物DAMO过程,且对DAMO的促进效果表现为OFL>NOR>FLU;除添加2ng/g的OFL对DAMO反应速率潜势的影响基本可以忽略外,添加其他浓度(20,200,2000ng/g)的OFL均促进了白洋淀湿地的DAMO过程,并且这种促进作用总体呈现出剂量效应;进一步分析QNs对NO₂^-,NO₃^-分别驱动的DAMO的影响发现,200ng/g的NOR抑制了由细菌驱动的以NO₂^-为电子受体的DAMO过程(nitrite-DAMO),但更大程度地促进了由古菌驱动的以NO₃^-为电子受体的DAMO过程(nitrate-DAMO),最终表...     

EGSB-BAF集成系统实现厌氧氨氧化、甲烷化和短程硝化反硝化

将膨胀颗粒污泥床(EGSB)和曝气生物滤池(BAF)集成,EGSB出水进入BAF进行短程硝化,BAF出水外回流至EGSB反应器为后者提供亚硝态氮,在不需外部投加亚硝态氮的条件下,实现厌氧氨氧化、甲烷化和短程硝化反硝化的耦合, 系统地处理ρ(氨氮)为50 mg/L和ρ(COD_Cr)为500 mg/L的合成废水.结果表明:当外回流比为200%时,系统CODCr,氨氮和总氮的去除率分别为92.4%,97.4%和80.6%;出水ρ(氨氮),ρ(亚硝态氮),ρ(硝态氮)和ρ(COD_Cr)分别为1.05,4.30,2.56和35.3 mg/L;COD_Cr,总氮和氨氮的去除负荷速率分别为1.770,0.137和0.164 kg/(m3·d). 与传统的活性污泥过程相比,EGSB-BAF集成系统回收甲烷1.03 　L/d,占系统COD_Cr去除量的37.0%;在系统总氮的去除过程中,厌氧氨氧化途径占35.9%,短程反硝化途径占47.4%,全程反硝化途径占16.7%.      

反硝化型甲烷厌氧氧化(DAMO)系统pH值耦合模型研究

对3个具有不同优势菌种反应器中厌氧氧化(DAMO)过程与pH值进行动力学耦合,结果表明,在25℃,Anammox-DAMO混培系统最大脱氮速率、硝酸盐初始抑制浓度和铵盐初始抑制浓度分别为3.95mg/(L·d),182.63,196.40mg/L;Nitrate-DAMO系统最大脱氮速率、硝酸盐初始抑制浓度分别为4.3...     

亚硝酸盐型甲烷厌氧氧化过程影响因素研究

亚硝酸盐型甲烷厌氧氧化(Nitrite-dependent denitrifying anaerobic methane oxidation,n-damo)是指微生物在厌氧条件下利用甲烷还原亚硝酸盐的过程,该过程的研究可为污水脱氮减排提供技术支持.采用n-damo富集培养物(荧光原位杂交实验结果表明n-damo功能菌丰度可达73%)为研究对象,着重探讨温度(25,35,45℃)、p H值(5.5~9.5)、甲烷分压(0~98 k Pa)和亚硝酸盐初始浓度(0~6.0 mmol·L-1)对n-damo反硝化速率的影响,以获得最优条件,为n-damo过程在污水处理中的应用提供理论依据.结果表明,在本实验条件下n-damo过程进行的最适温度为35℃,最适p H值为7.5,最适甲烷分压为49 k Pa,最适亚硝酸盐初始浓度为2.4~3.42 mmol·L~(-1).     

亚硝酸盐型厌氧甲烷氧化过程强化新视角:排泥及其微生物机制研究

亚硝酸盐型厌氧甲烷氧化(Nitrite-dependent anaerobic methane oxidation, n-DAMO)是微生物在厌氧条件下利用甲烷还原亚硝酸盐的过程.本研究通过排泥的策略对n-DAMO过程进行强化,并比较分析了反应器中微生物的群落结构及功能微生物数量.结果发现,与对照组相比,排泥后实验组反应器的脱氮速率从17.00 mg·L~(-1)·d~(-1)提高到73.10 mg·L~(-1)·d~(-1).排泥后反应器中n-DAMO细菌的相对丰度从38.3%上升到67.7%,功能微生物的基因拷贝数由1.404×10~8 copies·g~(-1)增长到4.854×10~8 copies·g~(-1),污泥比活性提高了2.95倍.与之相反,初始反应器中其余优势微生物Unclassified_GCA004、Unclassified_Rhodocyclaceae、Unclassified_Fimbriimonadaceae与Methylosinu相对丰度分别下降为原来的27.66%、32.65%、4.35%、20.27%.结果表明,排泥可以有效地强化n-DAMO过程,同时促进功能微生物的生长,主要原因在于排泥排出了非目标微生物,使得目标微生物大量生长.本研究为强化n-DAMO过程及加快n-DAMO微生物的富集提供了一条新思路,并为进一步推动n-DAMO过程的工程应用提供了理论基础.     

Correlation of anaerobic ammonium oxidation and denitrification

The feasibility of the nitrous organic wastewater treated was studied in seven anaerobic sequencing batch reactors（ASBRs） （0^#-6^#） which had been run under stable anaerobic ammonium oxidation （Anammox）. By means of monitoring and data analysis of COD, NH4^#-N, NO2^--N, NO3^--N and pH, and of microbial test, the results revealed that the optimal Anammox performance was achieved from 2^# reactor in which COD/NH4^＋ -N was 1.65, Anammox bacteria and denitrification bacteria could coexist, and Anammox reaction and denitrification reaction could occur simultaneously in the reactors. The ratio of NH4^＋-N consumed ： NO2^- -N consumed ： NO3^- -N produced was 1：1.38：0.19 in 0^# reactor which was not added glucose in the wastewater. When different ratio of COD and NH4^＋-N was fed for the reactors, the ratio of NO2^- -N consumed： NH4^＋-N consumed was in the range of 1.51-2.29 and the ratio of NO;-N produced： NH4^＋ -N consumed in the range of 0 -0.05.     

硫酸盐对Nitrate-DAMO反应过程影响及动力学特性

反硝化型甲烷厌氧氧化（Nitrate-/nitrite-denitrifying methane anaerobic oxidation,N-DAMO）技术是一种新型的同步脱氮除甲烷技术.我国环境水体和污水中普遍存在硫酸盐,为探明不同浓度硫酸盐对N-DAMO过程的影响,本研究通过短期和长期试验考察了硫酸盐对Nitrate-DAMO系统生物反应过程的影响,并分析了该过程的动力学及化学计量学特性的影响规律.结果表明,不同浓度梯度的硫酸盐（0~3.96 mmol·L^-1）对Nitrate-DAMO系统的短期影响呈先促进后抑制趋势,在浓度为0.42 mmol·L^-1时促进作用最明显;当浓度达到0.83 mmol·L^-1时,开始有明显的抑制作用,且长期和短期试验过程中均未出现硫酸盐消耗现象.0~0.42 mmol·L^-1和0.42~0.83 mmol·L^-1硫酸盐对Nitrate-DAMO系统脱氮性能影响的动力学过程分别符合非底物抑制方程和Haldane方程,通过拟合得出硫酸盐对Nitrate-DAMO系统的初始抑制浓度和令Nitrate-DAMO系统完全失去脱氮性能的硫酸盐浓度分别为0.81和4.06 mmol·L^-1.硫酸盐对Nitrate-DAMO系统甲烷氧化速率影响的动力学过程符合非底物抑制方程,实际的甲烷氧化速率与脱氮速率之比（5.03：8）符合理论值（5：8）.同时,硫酸盐还会影响N-DAMO微生物的生长周期.     

New molecular method to detect denitrifying anaerobic methane oxidation bacteria from different environmental niches

The denitrifying anaerobic methane oxidation is an ecologically important process for reducing the potential methane emission into the atmosphere. The responsible bacterium for this process was Candidatus Methylomirabilis oxyfera belonging to the bacterial phylum of NC10. In this study, a new pair of primers targeting all the five groups of NC10 bacteria was designed to amplify NC10 bacteria from different environmental niches. The results showed that the group A was the dominant NC10 phylum bacteria from the sludges and food waste digestate while in paddy soil samples, group A and group B had nearly the same proportion. Our results also indicated that NC10 bacteria could exist in a high pH environment (pH 9.24) from the food waste treatment facility. The Pearson relationship analysis showed that the pH had a significant positive relationship with the NC10 bacterial diversity (p < 0.05). The redundancy analysis further revealed that the pH, volatile solid and nitrite nitrogen were the most important factors in shaping the NC10 bacterial structure (p = 0.01) based on the variation inflation factors selection and Monte Carlo test (999 times). Results of this study extended the existing molecular tools for studying the NC10 bacterial community structures and provided new information on the ecological distributions of NC10 bacteria.     

厌氧氨氧化耦合脱氮系统中反硝化细菌研究

采用聚合酶链式反应、分子克隆等分子生物学方法,通过构建nirS克隆文库研究了厌氧氨氧化耦合异养反硝化脱氮系统中的反硝化微生物.进行同源性分析和系统发育树构建,结果表明,从nirS克隆文库中随机挑选的100个克隆子中有51个阳性克隆子,共分为12个操作单元.经比对发现这些微生物主要为变形菌门细菌和未知菌类,其中β-proteobacteria占据绝对优势且有较多种类,少部分属于 γ-proteobacteria.