Porphyrobacter sp.D22F的降解特性及其在石油降解菌群中的生态位

为揭示多环芳烃(Polycyclic aromatic hydrocarbons,PAHs)降解微生物资源的多样性和石油降解菌群的优势菌,研究了从南海沉积物中分离得到的一株PAHs降解菌D22F的降解特性及其在石油降解菌群D22-1中的生态位.对菌株D22F进行16S rRNA基因同源性分析及透射电镜观察以初步确定其种属,通过培养法、气相色谱质谱联用(GC-MS)测定其多环芳烃降解范围和降解率,通过简并引物PCR扩增其PAHs双加氧酶大亚基基因片段并进行系统发育分析,采用变性梯度凝胶电泳(DGGE)监测石油降解菌群中的优势菌.结果表明,与菌株D22F的16S rRNA基因相似度最高的模式株为产卟啉杆菌属Porphyrobacter tepidarius DSM 10594T(AF465839;98.55%).该菌株能降解萘、甲基萘、苊、硫芴、菲、蒽等;对初始浓度为0.2 g/L菲10 d后的降解率可达90%以上.从其基因组DNA中克隆到的PAHs起始双加氧酶大亚基基因phnAc与Novosphingobium aromaticivorans DSM 12444中的质粒pNL1(CP000676)上的bphA1f基因相似度最高,达到99.41%.DGGE谱图显示,菌株D22F是石油降解菌群中的3种优势菌之一,在传代菌群中可稳定存在.Porphyrobacter sp.D22F为产卟啉杆菌属(Porphyrobacter)中首株以低分子量PAHs为唯一碳源和能源的菌株,是石油降解菌群的优势菌.     

焦化厂污染土壤中多环芳烃降解菌的分离及降解特性

分别以芴(3环)、荧蒽(4环)和苯并[b]荧蒽(5环)为唯一碳源(1 mg/L),采用平板划线法对某焦化厂污染土壤中的多环芳烃降解菌进行分离.通过自制的呼吸器,研究所得多环芳烃降解菌对14C-菲(5μL/100 mL 40~60 mCi/mmol)的矿化情况;通过序批试验,以煤焦油为碳源(1μL/mL),研究这些菌对19种多环芳烃的降解情况.多次划分后,得到4种菌,经鉴定命名为博特氏菌L1、苍白杆菌L1、微杆菌L1和赤红球菌L1.经过3周的矿化实验,微杆菌L1可以将14C-菲全部矿化成14CO2,赤红球菌L1可将大约60%的14C-菲矿化成14CO2,而博德特氏菌L1和苍白杆菌L1对14C-菲无矿化作用.经过5周的降解实验,博德特氏菌L1对大多数多环芳烃表现了良好的降解作用,苍白杆菌L1和微杆菌L1对部分多环芳烃有降解作用,而赤红球菌L1培养系统中某些多环芳烃的浓度甚至有增大,这可能与其在代谢过程中产生表面活性物质有关.所得4种菌在焦化厂污染土壤的微生物修复中具有较大的应用潜力.图3表1参27     

石油降解菌株G5 16S rDNA全序列的系统学分析

用PCR方法扩增了一株石油降解菌株G5的16S rRNA基因全序列，并对其进行了克隆和测序．对该序列在GenBank中的BLAST结果表明，所有与该序列高度同源的序列都是假单胞菌的16S rRNA基因．其中假单胞菌的代表菌株Pseudomonas aeruginosa，P．fluoroscens，P .putida，P.syringae的16S rRNA基因序列与G5的16S rRNA基因序列同源性分别为93．4％，98．4％，96．3％，97．5％．对G5和其他39株假单胞菌的16S rRNA基因序列进行聚类分析，获得的系统发育树与RDP(Ribosomal Database Project)报道的系统发育树基本一致，其中菌株G5与5株P．chlororaphis聚类在一起．图2参7     

多环芳烃降解菌ZL5分离鉴定及其降解质粒

通过选择性富集培养，从辽河油田石油污染土壤中分离到一株多环芳烃(PAHs)降解菌ZL5．它能以菲和芘为唯一碳源生长，但是不能利用萘．16S rDNA核苷酸序列分析结果表明，ZL5属于变形细菌α亚类中的鞘氨醇单胞菌属．该菌株含有一个大小约为60kb的质粒．丝裂霉素C消除实验表明，随着质粒的丢失，菌株利用菲和芘的能力也丧失．用电转化和氯化铷转化法分别将菌株ZL5的质粒导人大肠杆菌JM109和DH5α中，随着质粒的获得，这些转化子获得了降解菲和芘的能力．本研究结果表明，鞘氨醇单胞菌ZL5降解PAHs的功能和质粒有关。     

高氯酸盐降解菌的分离鉴定及特性研究

研究降解高氯酸盐环境污染物微生物的形态特征、分子系统特征、生长特性和降解活性。利用PCA选择性培养基富集分离高氯酸根降解菌,观察其形态,进行生理生化测定,用分子克隆技术获得菌株的16SrDNA基因并测序,并对菌株的16S rDNA基因序列进行比对和系统发育分析,并用培养技术和离子色谱法检测菌株对底物的利用和降解情况。从镇江江滨和镇江新区污水处理厂的活性污泥中分别分离到一株能降解高氯酸根的菌株JD14和JD125。此菌株在24～30℃条件下较快地降解底物高氯酸盐,其中在24℃下,15d内可以将初始质量浓度为1600mg·kg-1的高氯酸根降解（86±6.5）%。对两菌株的16S rDNA基因进行了克隆和测序,并进行系统发育分析,结果表明菌株JD14和Dechloromonas sp.SIUL相似度高达100%,JD125和Dechlorospirillum相似度达97%,最后鉴定JD14和JD125属于高氯酸盐降解菌。此前国内并无降解高氯酸根微生物的报道,对今后在环境污染防治中开发利用此类细菌具有指导意义。     

菲在土壤中的微生物降解研究

研究了不同条件土壤中多环芳烃菲的降解动态。结果表明：温度和底物浓度对土壤中菲的降解有较大影响,未灭菌土壤中菲的降解半衰期为5.1d;从污染土壤中分离到一株高效降解菲的菌株,经16S rDNA鉴定为产碱杆菌属（Alcaligenes bacterium LBM.）,同源性高达99%;随着优势菌接种量增加,基础培养基中菲降解速率逐渐加快;Fe3＋、Co2＋和Cu2＋对优势菌降解菲能力均有不同程度影响,其中以Fe3＋影响最明显。     

发酵牛粪和造纸干粉对土壤中多环芳烃降解的影响

运用泥浆反应法研究添加发酵牛粪和造纸干粉对土壤中多环芳烃(PAHs)降解的影响.试验按水土比2:1制成泥浆反应器,设置对照、添加2.5%发酵牛粪和添加2.5%造纸干粉等3个处理,25～28℃摇床培养,分别于10、20、30 d采样测定土壤中多环芳烃降解菌的数量和多环芳烃含量.结果发现,所有处理土壤中多环芳烃的含量均随培养时间的延长而逐渐降低,而添加发酵牛粪和造纸干粉均有利于提高土壤中多环芳烃降解菌的数量,在培养30 d后土壤中多环芳烃的降解率分别从对照处理的19%显著提高到37%和35%(P<0.05).结果还发现,多环芳烃分环降解率随苯环数增加而下降,培养30 d后土壤中2环多环芳烃的降解率达95%以上,3环多环芳烃的降解率为50%左右,对照处理4～6环多环芳烃的降解率为7%～13%,而添加发酵牛粪和造纸干粉处理土壤中4～6环多环芳烃的降解率显著提高到21%～28%(P<0.05),但对2～3环多环芳烃的降解无明显影响,表明这两种物质对土壤中多环芳烃降解的影响关键在于促进高环多环芳烃降解菌的生长繁殖及降解活性.     

4株多环芳烃降解菌的分离及鉴定

以多环芳烃(PAHs)为筛选培养基,从石油污染土壤和石油废水中筛选到4株能够降解PAHs的高效微生物菌株,分别定名为3-28、NF、EW和EY;并对其进行了形态学观察、生理生化指标测定及分子生物学鉴定.16S rDNA序列分析显示,这4株细菌分别有581、582、1209和1230个碱基,与Microbacterium、Cellulosimicrobium、Chelatococcus和Sphingopyxis等4个属有较高的序列同源性,分别为100%、97.8%、98.2%和99.0%.结合表型特征和16S rDNA序列分析,用DNAMAN构建系统发育树,并用Bootstraping法对其评价,初步将3-28、NF、EW和EY这4株PAHs降解菌分别归属于Microbacterium sp.、Cellulosimicrobium sp.、Chelatococcus sp.和Sphingopyxis sp..图3表1参22     

水-硅油双相体系对多环芳烃降解菌的筛选及鉴定

选用水-硅油双相体系驯化筛选降解多环芳烃的优势菌株。筛选体系为：50mL无机盐溶液＋10mL硅油。从74瓶富集液中,对降解效果明显的富集液进行多环芳烃降解率的液相色谱定量测定。对蒽的降解率最高为45%;对荧蒽的降解率最高为99%,几乎全部降解,对苯并[a]芘的降解率为27%。筛选到一株能够高效降解蒽、菲、芘、荧蒽的菌株,编号LD29,鉴定结果为矢野口鞘氨醇杆菌LD29（Sphingobium yanoikuyae LD29）。富集液Y12对5种多环芳烃的降解效果同样很明显。     

苯酚降解菌UW7的鉴定及对苯酚的降解作用

从焦化厂污水处理曝气池泥样中分离出具有降解苯酚能力的UW7菌株,根据形态、生理生化性状初步鉴定为不动杆菌属(Acinetobacter).该菌16S rRNA基因序列(在GenBank中的登录号为GU083586)与多株鲁氏不动杆菌(A.lowffii)的相似性在99%以上.结合形态、生理生化特性,鉴定UW7菌株为鲁氏不动杆菌(A.lowffii UW7),该种细菌具有降解苯酚的特性尚未见报道.该菌株降解苯酚的最适温度为30℃,最适生长pH 7.0,对2.5 g/L浓度的苯酚能够有效降解,对3.5～4.0 g/L浓度的苯酚有较强的耐受能力,是处理高浓度苯酚废水的良好菌种资源.