降解-示踪质粒的构建及性能评价研究

在生物强化中采用报告基因技术对降解质粒进行标记,可实现对基因工程菌和降解基因的原位监测。通过基因克隆技术,将绿色荧光蛋白基因(gfp)和阿特拉津脱氯水解酶基因(atzA)重组,构建降解-示踪功能质粒,实现对阿特拉津降解质粒的示踪标记,并对转化获得的基因工程菌绿色荧光蛋白表达及阿特拉津降解能力进行评价。结果表明将gfp和atzA基因克隆至质粒载体pUC18所获得的重组质粒,经检测含有atzA基因,具有氨苄青霉素抗性,并可表达绿色荧光蛋白。携带重组质粒的基因工程菌具有阿特拉津降解活性;且在活性污泥中产生绿色荧光现象,可通过原位观察进行监测。     

工程菌及其固定化细胞对有机磷农药的降解

用抗性库蚊酯酶基因,引入原核表达载体pRL439,转化大肠杆菌HB101细胞,获得表达.通过酶切、Southern杂交鉴定重组质粒.研究了重组菌酯酶的活性,重组质粒pRL-B1表达的酯酶具有高酶活并能高效降解酯酶的特异性底物a-乙酸萘酯(a-NA)和β-乙酸萘酯(β-NA);经对重组菌进行细胞固定化后降解有机磷农药对硫磷(1605),反应时间短,降解效率高.     

绿色荧光蛋白标记阿特拉津降解基因工程菌的特性

通过转化绿色荧光蛋白基因质粒,对阿特拉津降解基因工程菌进行标记.转化后,绿色荧光蛋白在细胞内表达情况良好.在含抗生素的LB培养基中,绿色荧光蛋白的表达水平高于LB培养基和基础培养基.在细胞生长的稳定期,绿色荧光蛋白表达水平高于停滞期和对数生长期.绿色荧光蛋白基因质粒转化和表达,不会对基因工程菌原有的降解能力产生影响,而且绿色荧光蛋白的表达水平和降解活性存在接近线形的正相关关系.荧光蛋白标记细胞投加到反应器活性污泥中,会以2种状态存在:游离态和附着态,而且初期游离态细胞的数量大于附着态细胞的数量.     

基于荧光传感器Frex的特性检测水质环境中生物毒性物质

发光菌作为水环境生物毒性监控的有效手段,近年来越来越得到重视.本实验利用基因工程技术,将Frex荧光蛋白重组到大肠杆菌中,并通过测定菌体内NADH水平所引起的荧光强度变化,来监测水体中有毒物质对微生物代谢的影响,从而实现实时毒性监控.实验完成了Frex荧光蛋白在大肠杆菌中的正确表达,研究了培养温度、诱导时间及IPTG浓度等不同条件对Frex融合蛋白表达量和荧光活性的影响.将此重组荧光发光菌初步应用于环境水体中有毒物质的检测研究,选取氯化汞、苯酚、重铬酸钾、硫酸锌等4种国际荧光发光菌生物毒性检测标准物质进行检测,结果表明毒性物质均能对菌体的荧光产生一定的催灭作用.该毒物测试手段分别具有反应速度快和灵敏度高等特性.同时,实验优化了该重组菌应用于生物毒性检测试验的条件,为后续的应用研究提供了一定的实验基础,拓展了荧光发光菌在其他方面的适用范围.     

酵母双杂交技术构建重组雌激素受体相关受体(ERR)基因酵母

应用酵母双杂交技术构建了重组雌激素受体相关受体(ERR)基因酵母,用以筛选环境中具有ERR干扰活性的化合物.实验先提取并纯化含有ERR3,基因的酵母表达质粒pGBT9一ERRγ,称为诱饵质粒;再提取并纯化含有ERRγ协同激活因子GRIP1基因的酵母表达质粒,形成靶质粒pGAD424-GRIP1,然后将诱饵质粒和靶质粒同...     

pUCD-recA重组发光菌构建及对遗传毒性污染物响应作用

基因重组发光菌在水质毒性的评价中具有重要的作用,本研究从分析污染物毒性损伤的机制出发,构建新型pUCD-recA基因重组发光菌. 用PCR法从大肠杆菌W3110中扩增recA基因,将其与pGEM-T easy载体连接后测序.测序正确的recA片段及pUCD615载体均用BamHⅠ、EcoRⅠ双酶切,连接后电转化导入宿主菌JM109.挑取克隆,提取质粒用PCR鉴定,阳性克隆再进行测序.将构建成功的pUCD-recA载体转化入大肠杆菌RFM443,加入相应的遗传毒性污染物,观察发光响应作用.结果表明,recA基因PCR扩增出的片段为293　bp,测序结果与GenBank中的recA序列进行BLAST比对,同源性为99％,表明扩增序列正确.与pUCD615载体连接后的测序结果表明,recA基因已正确地插入到pUCD615的多克隆位点,方向和读码框正确,重组发光菌载体构建成功.将构建好的重组载体转化入RFM443宿主菌,加入遗传毒性污染物观察响应效果.丝裂霉素C（MMC）对pUCDrecA重组发光菌诱导效果最好,0.01 mg/L即可有很好的响应曲线;N′-甲基N′-硝基亚硝基胍（MNNG）则在50～100 mg/L时可发挥最佳响应作用.     

绿色荧光蛋白标记的大肠杆菌海水中稳定性研究

用绿色荧光蛋白基因( GFP) 标记大肠杆菌K12(K12GFP),检测其在海水中的存活及稳定性.研究结果表明,K12与K12GFP微生物学特性差异不显著,而且两者在高压灭菌海水中的存活曲线也基本一致,说明K12GFP可为进一步研究K12在自然海水中的生态变化提供可靠依据.在高压灭菌海水中,K12GFP存活28 d之久,该菌密度随时间缓慢下降;在过滤海水中,K12GFP存活7 ,该菌密度从107CFU/mL降到102CFU/mL.表明海水的营养成分会对其存活产生较大影响.     

三苯基甲烷类染料氧化酶基因(tpmD)在大肠杆菌中的无诱导表达

为了解决嗜水气单胞菌DN322对鱼类的潜在致病性问题,有必要克隆表达该菌的三苯基甲烷染料脱色酶基因tpmD.通过PCR方法获得该基因,并与脱色希瓦氏菌S12的NAD(P)H脱氢酶基因启动子和用于荧光标记的编码CCPGCC的碱基序列融合,将有启动子和无启动子的融合基因片段分别连接到质粒pMD18-T中,转化大肠杆菌E.coli DH5α和E.coli BL21.结果发现,有启动子的融合基因能被E.coil在不加诱导物IPTG的条件下高效正确表达,脱色酶活性甚至超过基因供体菌DN322.将上述两株大肠杆菌工程菌株在自然水体中进行孔雀石绿污染小试处理,60d内在每个350mL反应体系中累积共投加大于10000mg的孔雀石绿,脱色率一直保持在92%以上;细菌数量最后增加了5～10倍.研究结果证明,基因工程菌在不加营养物的条件下也有很强的脱色活性和长期的存活能力;在tpmD基因3'端加入的用于螯合双砷荧光染料的18bp编码氨基酸碱基序列不影响此基因的表达和酶的脱色活性,这将赋予此工程菌可示踪性.     

基于荧光细菌感受器的AgNPs生物有效性研究

采用可表达绿色荧光蛋白的大肠杆菌(lac::GFP)为模型,研究了新鲜的和经氯化钠溶液老化的纳米银(AgNPs)生物有效性。经0、0.5、1、2μg/m L新鲜的AgNPs处理大肠杆菌10 h后,利用酶标仪、荧光显微镜、流式细胞仪和质粒抽提试剂盒检测AgNPs毒性。经不同浓度氯化钠(Cl/Ag摩尔比分别为0、100、500、800)老化12 d后的AgNPs(0、0.5、1、2μg/m L)及其离心后相应上清处理大肠杆菌10 h后,利用紫外可见分光光度计检测AgNPs在Na Cl溶液中吸收光谱,并用酶标仪和流式细胞仪统计细菌GFP抑制率。结果表明:AgNPs抑制大肠杆菌GFP表达,影响重组质粒复制,即有显著的生长抑制作用;氯离子的存在可加速AgNPs溶解,且在老化过程中,随着Cl/Ag比例增大,AgNPs的抑制作用有所下降。     

聚磷激酶基因在假单胞菌中的整合和表达

为了构建高效除磷的微生物,将来源于大肠杆菌的聚磷激酶基因(ppk)插入广宿主载体pBBR1MCS-2多克隆位点区,得到质粒pBBR1MCS-2-ppk.以该质粒为模板,通过PCR扩增出携带有载体启动子和终止子序列的ppk基因,插入自杀型质粒pUTmini-Tn5中得到重组质粒pUTmini-Tn5-ppk.pUTmini-Tn5-ppk经三亲接合作用进入Pseudomonas putidaKT2440,同时mini-Tn5通过转座作用将ppk整合到宿主菌株的染色体DNA中,获得基因工程菌Pseudomonas putidaKT2440-PPK,用于表达ppk.RT-PCR结果显示,ppk基因在KT2440-PPK中得到较高量的表达,而在原始菌株KT2440中表达微弱.人工模拟污水实验结果表明,接种1 h时KT2440-PPK中聚磷含量达到最大,为3.05 mg/g,约是对照菌株KT2440的15倍.测定模拟污水中磷酸盐的含量表明,KT2440-PPK可以去除该模拟污水中90%以上的磷酸盐.     

质粒pJP4水平转移介导生物膜系统强化降解2,4-D效应

以携带质粒pJP4[其上含编码2,4-二氯苯氧基乙酸(2,4-dichlorophenoxyacetic acid,2,4-D)降解功能的基因簇(tfd)]的基因工程菌Pseudomonas putida SM1443::gfp2x(pJP4::dsRed)为供体菌,以生物膜系统为对象,通过半连续流实验研究了质粒pJP4水平转移介导基因强化降解2,4-D效应,考察了目标基因在系统中存在状况及基因强化对系统菌群结构的影响.结果表明,以2,4-D(初始浓度为170 mg/L±10 mg/L)为唯一碳源,向生物膜系统加入携pJP4质粒的基因工程菌对2,4-D的降解具有促进作用,运行初期,促进作用较弱,随着半连续流反应的进行,促进作用显著增强,基因强化系统较对照系统对2,4-D的平均降解速率之差达13.3 mg/(L.h).通过对基因强化系统功能基因片段tfdB基因及报告基因gfp的跟踪检测,证实了在pJP4质粒介导下生物膜系统基因水平转移的发生.PCR-DGGE结果表明基因强化的生物膜系统较对照系统在受到2,4-D冲击条件下保持了相对更加稳定的菌群结构.     

A GFP-based bacterial biosensor with chromosomally integrated sensing cassette for quantitative detection of Hg(II) in environment

A mercury biosensor was constructed by integrating biosensor genetic elements into E. coli JM109 chromosome in a single copy number, using the attP/attB recombination mechanism of λphage. The genetic elements used include a regulatory protein gene (merR) along with operator/promoter (O/P) derived from the mercury resistance operon from pDU1358 plasmid of Serratia marcescens. The expression of reporter gene gfp is also controlled by merR/O/P. Integration of the construct into the chromosome was done to increase the stability and precision of the biosensor. This biosensor could detect Hg(II) ions in the concentration range of 100-1700 nmol/L, and manifest the result as the expression of GFP. The GFP expression was significantly different (P ≤ 0.05) for each concentration of inducing Hg(II) ions in the detection range, which reduces the chances of misinterpretation of results. A model using regression method was also derived for the quantification of the concentration of Hg(II) in water samples.     

多聚磷酸盐激酶基因在污水生物除磷中的功能

为验证多聚磷酸盐激酶基因(ppk)在污水生物除磷中的功能.采用Red敲除系统,以p KD4质粒为模板,设计同源短臂,扩增外源线性DNA片段,将外源线性DNA片段电转化整合入已导入p KD46的大肠杆菌ATCC25922野生型菌株.获得重组菌E.coli/ppk~-Kan~+.将p CP20导入大肠杆菌E.coli/ppk~-Kan~+以消除卡那霉素抗性基因,通过负抗性筛选及正反向引物验证,构建无抗生素抗性的ppk基因缺失工程菌株E.coli/ppk~-Kan~-.比较工程菌株和野生型菌株的生长特性,并比较两者在缺磷诱导/富磷及多次厌氧/好氧诱导条件下的除磷性能.结果表明采用Red重组系统,通过无痕敲除,成功构建了大肠杆菌ppk基因缺失菌株E.coli/ppk~-Kan~-.敲除后的工程菌株和野生型菌株生长整体没有差异,但是4 h前对数期工程菌株生长快于野生型菌株,8 h后稳定期工程菌株生长慢于野生型菌株,表明ppk影响菌体的生长;缺磷诱导/富磷条件下,工程菌株并未表现出因ppk缺失而影响其除磷能力;经过5次厌氧/好氧诱导,两菌菌体含磷量保持在1%~2%,没有因诱导次数的增加而表现出菌体含磷量增加的趋势,也未发现厌氧有PHB好氧有聚磷颗粒生成,表明ppk基因的缺失并没有引起菌体除磷能力的下降.ppk并未表现出明显的与污水生物除磷相关的功能.     

绿色荧光蛋白基因在根际优势菌株中的高效表达

从人工模拟污染土壤中的黄麻根际分离得到两株优势菌株。通过PCR技术对增强绿色荧光蛋白基因与质粒载体pTnMod Ocm进行体外重组构建新的质粒 ,并转化分离得到的优势菌株。结果表明增强绿色荧光蛋白基因在黄麻根际优势菌株中高效表达     

产毒微囊藻mcyA基因荧光定量PCR方法的建立

针对微囊藻毒素合成酶基因mcyA探索一种适用于自然水样中微囊藻毒素产毒潜能检测的TaqMan实时荧光定量PCR方法.该方法从铜绿微囊藻FACHB-1279中的mcyA基因中扩增出目的基因片段,用TA克隆方法将基因片段插入Allel TA vector (ABP-CETAVEC020)中来制备质粒标准晶.通过不同连续稀释...     

An E. coli SOS-EGFP biosensor for fast and sensitive detection of DNA damaging agents

An E. coli SOS-EGFP biosensor which expresses enhanced green fluorescent protein as a reporter protein under the control of recA gene promoter in SOS response was constructed for detection of DNA damage and evaluation of DNA damaging chemicals. The chemicals that may cause substantial DNA damage will trigger SOS response in the constructed bacterial biosensor, and then the reporter egfp gene under the control of recA promoter is stimulated to express as a fluorescent protein, allowing fast and sensitive fluorescence detection. Interestingly, this biosensor can be simultaneously applied for evaluation of genotoxicity and cytotoxicity. The SOS-EGFP bacterial biosensor provides a sensitive, specific and simple method for detecting known and potential DNA damaging chemicals.     

一种工程菌的高酶活及其固定化细胞对农药的降解

将抗性尖音库蚊五带亚种的执有机磷农药基因—酯酶基因克隆到质粒pRL－439中．经检测,重组质粒中的酯酶基因已得到表达,获得高酶活的工程菌．将工程菌固定化后对两类难降解农药（有机氯、菊酯类）进行降解,结果表明,固定化细胞在1h内对上两类农药可降解90％以上,具有很高的降解效力．