费氏中华根瘤菌lrp基因的克隆、突变与功能

通过分子克隆技术,从费氏中华根瘤菌(Sinorhizobium fredii)HN01基因组文库中克降到一个lrp基因.该基因与已报道的苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)1021的lrp基因在核苷酸水平上有89%相似性,在氨基酸水平上有99%相似性.利用自杀质粒pK18mob构建含有lrp基因部分片段的重组质粒,通过三亲本结合后导入原始菌株HN01中,经过同源单交换,获得发生正向插入突变的突变株GXHNLTA和反向插入突变的突变株GXHNLTB.将lrp基因ORF连接到载体pLAFR3上,获得用于互补的质粒pGXHNL100,将该质粒通过三亲本接合导入突变株中,获得互补株GXHNWA、GXHNWB.对野生型菌株、突变株、互补株进一步研究发现,在以脯氨酸、亮氨酸、丝氨酸等氨基酸为唯一碳、氮源的MM培养基中培养时,突变体GXHNLTA、GXHNLTB的生长均滞后于出发菌株HN01.植株试验表明,突变菌株GXHNLTA、GXHNLB比野生菌株HN01开始结瘤的时间提前1 d,在结瘤效率、单株瘤数、瘤重、固氮酶活性方面并无显著差别.     

费氏中华根瘤菌HN01的putA基因克隆

从快生型大豆根瘤菌费氏中华根瘤菌HN01的基因组文库中克隆到一个putA(脯氨酸脱氢酶)基因,该基因与已报道的苜蓿中华根瘤菌1021中putA基因在核苷酸和氨基酸水平上分别有82%和86%相似性.利用自杀性质粒pK18mob构建含有putA基因部分片段的重组质粒,通过三亲本结合导入出发菌株HN01中,获得正向插入的极性突变体GXHNPA和反向插入非极性突变体GXHNPB.将putA基因完整的ORF连接到广宿主载体pLAFRJ上,获得用于互补的质粒pGXHN37,通过三亲接合,将pLAFRJ导入GXHNPA和GXHNPB获得互补菌株GXHNPHA和GXHNPHB.对出发菌株、突变菌株、互补菌株进一步的研究发现,以脯氨酸为唯一C、N源的MM培养基中培养时,突变体均不能生长,互补菌株和野生型HN01没有差异,而在完全培养基YMB中培养时,突变菌株生长不受影响.植株实验发现,突变体均能有效结瘤,但是固氮酶活与出发菌株相比有所下降,结瘤时间延迟1d,竞争结瘤能力下降,而互补菌株与野生型HN01没有明显的差异.     

利用细菌表面展示技术构建镉耐受性的重组根瘤菌

通过细菌表面展示功能基因InaXN、猴金属硫蛋白α亚基四聚体MT4α和两种启动子PnifH及Plac元件,分别构建两个重组质粒pTNIM和pBLIM.进一步通过三亲本杂交,将重组质粒分别导入费氏中华根瘤菌HN01,分别构建获得诱导表达型重组菌HN01(pTNIM)和组成表达型重组菌HN01(pBLIM).在培养条件下比较测定重组菌和出发菌对镉的吸附能力和耐受性,结果表明,组成表达型重组菌HN01(pBLIM)在上述两个方面的能力得到明显增强,对镉的吸附富集能力提高了2倍.研究还发现重组根瘤菌也具有很好的静态吸附效果.盆栽实验结果表明,接种诱导表达型重组菌HN01(pTNIM)的大豆根瘤和根中Cd2+的富集量均明显高于野生菌株HN01.本实验为后续探索重组根瘤菌与宿主植物共生体系在Cd2+污染土壤修复中的应用前景奠定了基础.     

含发光酶基因的转座子质粒载体的改造及向根瘤菌HN01的转座

将从自杀性重组质粒pDB30上分离的3．6kb含卡那霉素抗性基因和发光酶基因（luxAB）的BglⅡ酶切片段，克隆到小Mr的高拷贝质粒pIJ2925上，构成新的质粒，pHNLX1011；然后将pHNLX1011经BglⅡ部分酶切，酶连在含蔗糖酶基因（sacB）的自杀性重组质粒载体pMH1701上，载体分别采用BglⅡ酶切和BamHⅠ酶切．连接转化后共得到4种重组质粒类型的菌株，它们具有不同发光活性；将它们分别与快生型大豆根瘤菌HN01进行三亲本杂交，发现它们的转座频率均较pDB30高．对经转座标记后的根瘤菌进行发光活性检测，只有pHNC3质粒所转座的根瘤菌浇具有较强发光活性．所得发光根瘤菌衍生菌株能在野大豆和栽培大豆黑农39根际形成正常根瘤，能用X光片记录下根瘤的发光活性．     

稳定混合菌协同降解咔唑研究

以咔唑(Carbazole,CAR)作为唯一碳源和氮源,从某炼油厂废水中筛选获得稳定的咔唑降解混合菌株.对该混合菌株进行分离和纯化,获得两株细菌,经生物化学和分子进化特征分析后,初步鉴定为Chryseobacterium sp.NCY和Achromobacter sp.NCW.扫描电镜显示,两株菌在含咔唑的无机盐培养基和肉膏培养基上生长时,细胞形态发生显著的变化.这两株细菌形成的稳定复合体存24 h内对咔唑(500 mg L-1)的降解率为80%,64 h内降解率可达到99%以上,并释放出氨氮22.69 mg L-1.纯化后的两株细菌单独以咔唑为唯一碳源和氮源,均不能生长,推测两株菌通过协同代谢作用降解咔唑.     

一株具有氢自养能力的固氮粘质沙雷氏菌的分离鉴定、代谢特征与功能基因检测

氢氧化细菌（HOB）是能利用氧气氧化氢气供能以固定二氧化碳进行自养生长的一类细菌,但是目前对能够固氮的HOB研究甚少.在自然界中部分HOB常作为植物根际促生细菌（PGPR）存在,而固氮是可能的促生机制,有望从功能菌群中得到更多的固氮HOB,是否存在氢自养且可固氮的沙雷氏菌未知.从固氮氢氧化混合菌群中分离出一株产色素的固氮菌NF-HOB1,经16S rRNA基因测序鉴定为粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）(GenBank:OQ625884),通过碳源或氮源限制培养实验验证其具有异养固氮生长、氢自养固碳生长能力,氢气氧化速率为0.187 5 mmol/d.聚合酶链式反应（PCR）扩增发现其质粒DNA编码固氮酶铁蛋白结构基因nifH,基因组编码种特异性的核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶（Rubisco）和氢化酶3的结构基因.基因组框架图测序进一步揭示了菌株的基因组特征,基因组长4 919 531 bp,蛋白编码基因4 778个.注释到氢化酶2、碳酸酐酶、GlnK型PII蛋白等,提示存在二氧化碳浓缩机制和以NtrB-GlnK-amtB/nifA为特征的全局氮调控机制.基因本体论...     

乳酸杆菌食品级表达系统的构建与鉴定

以LacF为选择标记,构建了乳杆菌食品级表达系统.首先克隆了Latobacillus caseiATCC393乳糖操作子LacF和LacG基因片段,将LacF克隆至载体pRV300上后,利用T4DNA聚合酶消除了LacF片段的SphI位点,构建LacF基因编码区移码突变的质粒pRV△lacf随后将LacG片段与质粒pRV△lacf接后获得了质粒pRvg△lacf.同时将没有移码突变的LacF和LacG基因片段克隆至载体pRV300上,构建了整合型载体pRVgf.将质粒pRVg△lacf电导入L.casei ATCC393中,筛选到不能在乳糖平板上生长的突变菌株.经PcR分析表明,该菌株的LacF基因被移码突变基因Lac△F取代,命名为L.casei MBL25(LacF).为了鉴定此系统的可行性,将豆豉溶栓酶基因成熟肽编码片段插入到整合型载体pRVgf中,成功构建了质粒pRVgf-badfe,将其导L.casei MBL25(LacP)后,筛选LacF 菌株.PcR分析结果显示,豆豉溶栓酶基因已经整合到L.casei染色体巾并且表型已经得到恢复.表明MBL25(LacF-)中LacF基因的功能能被pRVgf-bafe上的LacF基因互补.经0.5%乳糖过夜诱导后,SDS-PAGE电泳显示成功表达了相对分子质量(M)28x103大小的特异蛋白.图3参22     

萘降解质粒pND6的分离和鉴定

从工业废水中分离的假单胞菌 (Pseudomonassp .)ND6菌株 ,能以萘为唯一碳源生长 ,使无机盐培养基(MM)中 2g/L的萘在 48h内降解 98% .该菌株含有一个 115kb的大质粒pND6 .DNA杂交实验表明 ,pND6质粒含有与恶臭假单胞菌 (P .putida)G7菌株的NAH7质粒同源的萘降解基因 .图 3表 1参 14     

不同根瘤菌中突变cysDN基因对硫酸盐同化途径的影响

硫是生物体必须的元素,根瘤菌结瘤因子的硫化修饰与其宿主范围和识别效率有着重要关系,实验室前期研究中突变费氏中华根瘤菌的cys DN基因后,突变体不能利用硫酸盐生长,这与Sinorhizobium sp.BR816的cys D基因突变后的现象不同,两株菌的硫酸盐同化途径中可能存在差异.为探讨不同根瘤菌cys DN基因对硫酸盐同化途径的影响,本研究利用同源交换的方法构建费氏中华根瘤菌WGF03、费氏中华根瘤菌HN01、苜蓿中华根瘤菌14500及大豆慢生根瘤菌15606的cys DN突变体,Δcys DN-WGF03、Δcys DN-HN01、Δcys DN-14500和cys NR-15606,对突变体的硫源利用情况和植株结瘤情况进行研究.结果发现,Δcys DN-WGF03和Δcys DN-HN01失去利用硫酸盐的能力;Δcys DN-14500能微弱地利用硫酸盐生长,生长量约为野生菌株的1/3左右;cys NR-15606对硫酸盐的利用与野生菌株相比无明显差别.植株实验结果显示,Δcys DN-WGF03、Δcys DN-HN01和Δcys DN-14500在平均瘤数、平均瘤重、平均植株干重和固氮酶活性方面均表现出显著降低,而突变体的回补体能够恢复硫酸盐的利用能力及与植株的共生固氮能力.这说明cys DN基因在费氏中华根瘤菌WGF03、费氏中华根瘤菌HN01和苜蓿中华根瘤菌14500硫酸盐同化途径中起着关键影响,而该基因在大豆慢生根瘤菌15606的影响并不明显.本研究表明,cys DN基因在不同根瘤菌中所起的作用不同,不同根瘤菌的硫酸盐同化方式也存在差异.     

好氧同时硝化-反硝化菌的分离鉴定及系统发育分析

从土壤中分离到一株好氧同时硝化-反硝化菌,编号为SDN,该菌株革兰氏染色呈阳性,球状或杆状,菌落颜色橙红色.该菌株以硝酸钠为氮源时能进行好氧反硝化作用;以乙酸钠和硫酸铵分别为碳源和氮源能进行异养硝化作用,能以乙酰胺为唯一碳源和氮源进行生长.部分长度的16S rDNA序列分析表明,分离菌株SDN与Rhodococcusruber的16SrDNA序列具有99%相似性.并用PHYLIPS程序将该菌株与报道的相关微生物进行了系统发育分析.图4表1参13     

红球菌Chr-9降解吡啶和苯酚的特性

研究了红球菌(Rhodococcus)Chr-9菌株在基础盐培养基中降解吡啶和苯酚的特性,分析了菌株降解苯酚和吡啶间的差异.结果表明,菌株Chr-9能够在72 h内将基础盐培养基中的吡啶(200 mg L-1)和苯酚(200 mg L-1)完全降解,同时利用吡啶和苯酚进行生长.菌株降解吡啶的最适温度为35℃,最适pH为8.0.菌株降解吡啶和苯酚的速度与底物的初始浓度呈负相关;在无其它氮源的基础盐培养基中,菌株能够利用吡啶和苯酚协同生长.图7参12     

1株贫营养好氧反硝化菌的分离鉴定及其脱氮特性

从水库底泥样品中,以硝酸盐为唯一氮源进行驯化、分离筛选出1株能在贫营养及好氧条件下进行高效反硝化的菌株PY8,经过电镜形态学观察、生理生化和16S rDNA序列分析,并基于16SrDNA序列结果,构建了该菌株的系统发育树,最终确定菌株PY8为根瘤菌Rhizobiumsp.。考察了初始pH值、温度、C/N、初始硝酸钠质量浓度、投菌量对菌株PY8硝酸盐还原活性的影响,以及该菌株的异养硝化性能。结果表明,在pH6.0～10.0,温度25～30℃,C/N1.0～9.0,初始硝酸钠质量浓度0.01～0.50g·L-1,投菌量1%～15%时,菌株PY8培养72h后的硝氮去除率可达到95%以上。另外,该菌株具有同时硝化-反硝化作用,在培养过程中氨氮去除率可达到58%左右。实验结果表明,菌株PY8在微污染水体生物脱氮领域中具有很大的应用潜力。     

一株能产生聚乙烯醇降解酶的委内瑞拉链霉菌

以聚乙烯醇(PVA)为唯一碳源,从土壤中筛选到1株能产生胞外PVA降解酶的放线菌GY1.根据扩增出的该菌株的16SrDNA全序列在GenBank中的比较结果,结合生理生化实验、细胞化学成分及菌落形态分析,确定该菌为委内瑞拉链霉菌(Stretopmycesvenezuelae).GY1菌株以PVA为唯一碳源时,产生的PVA降解酶活性达到120UL-1,是以葡萄糖或可溶性淀粉为唯一碳源时的10倍.当在PVA培养基中添加1gL-1至3gL-1的葡萄糖时,该菌株细胞量和PVA降解酶总酶活随着葡萄糖添加量的增加而增加,最大细胞量是未添加葡萄糖时的2.4倍,最高总酶活是未添加葡萄糖时的2.6倍,而单位质量细胞产生PVA降解酶的能力提高不大.但当添加的葡萄糖浓度从3gL-1增至10gL-1时,总酶活随着细胞量的增加出现下降趋势,同时单位质量细胞产生PVA降解酶的能力也大大降低.在相同PVA聚合度下,高醇解度PVA比低醇解度PVA更有利于GY1菌株的生长及产生PVA降解酶.图5表1参16     

不同氮浓度下三角褐指藻生长特性和化学组成

三角褐指藻是一类海洋单细胞硅藻,富含多不饱和脂肪酸,可以作为鱼、虾、贝等理想的饵料。而近年该藻曾多次在我国沿海海域发生暴发性增殖,给当地生态环境带来了一定的影响。为了探讨不同氮浓度对三角褐指藻生长特性和化学组成的影响,设置了低氮(44 μ mol.L-1)、中氮(880 μmol.L-1)和高氮(4 400 μmol.L-1)浓度三种处理,着重测定三角褐指藻的细胞密度、比生长率、生物量、可溶性糖、蛋白质含量和叶绿素含量等指标。结果表明,高氮浓度明显地促进了藻细胞的生长繁殖。高氮浓度下的藻细胞密度、比生长率和生物量分别比低氮浓度下的提高了 5.38 倍、0.81 倍和 2.86 倍。藻生长前期,高氮浓度和中氮浓度下的生长曲线相似,呈现一个"S"型的曲线。另外,高氮浓度下的藻细胞可溶性糖、蛋白质和叶绿素a含量分别是低氮浓度下的 2.5 倍、1.5 倍和 15 倍,说明高氮浓度促进了藻细胞化学组成的转化和积累。结果揭示,氮浓度可能是导致三角褐指藻近年在我国沿海海域发生暴发性增殖的重要因素。     

硝基苯降解菌的分离鉴定及降解特性

从化工厂污水处理池污泥中分离到一株能高效降解硝基苯的菌株XY-1,通过形态观察、生理生化特征和16SrDNA序列同源性分析,将该菌株鉴定为假单胞菌属(Pseudomonas sp.).该菌株能以硝基苯为唯一碳源、氮源和能源生长,硝基苯初始浓度为200 mg/L时,20 h降解率可达97%.该菌在温度25～35℃、pH 7.0～9.0范围内均能高效降解硝基苯,并且对对氯硝基苯、对氯苯胺也有良好的降解效果.测序分析表明,克隆到了该菌中的硝基苯还原酶基因,推测该菌的降解途径是硝基苯部分还原途径.图6参19     

一株降解苄嘧磺隆光合细菌的分离鉴定及其降解特性

从农药厂工业废水和污泥中富集分离到一株能降解苄嘧磺隆(Bensulfuron methyl)的光合细菌PSB07-6,根据分离菌株的细胞形态结构、活细胞光吸收特征、生理生化特征以及系统发育分析将该菌初步鉴定为沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris).高效液相色谱法(HPLC)测定该菌降解光合细菌培养基中苄嘧磺隆的能力,在pH为6.5的光合细菌培养基中培养5 d,对350 mg·L-1苄嘧磺隆降解率达25.03%.添加回收率为105%～112%.降解特性研究结果表明,该菌能以苄嘧磺隆为唯一碳源和氮源,降解最佳条件为30℃、pH6.5.     

不同氮源对4种海洋微藻生长的影响

采用实验室一次性培养的方法,研究了硝氮、氨氮、尿素和混合氨基酸等4种不同氮源对典型赤潮藻赤潮异弯藻Heterosigma akashiwo、凯伦藻Karenia sp.、球形棕囊藻Phaeocystis globosa和常见浮游植物优势种类角毛藻Chaetoceros sp.生长的影响。结果表明,这4种海洋微藻不仅能利用无机氮硝氮和氨氮,而且也均能利用有机氮尿素和混合氨基酸。赤潮异弯藻、凯伦藻和角毛藻均在以硝氮为唯一氮源时,比生长速率分别达到最大值0.45、0.52和0.70 d-1;而球形棕囊藻在以硝氮和尿素为唯一氮源时,比生长速率均达最大值0.65 d-1。可溶性有机氮库中的重要组成成分尿素和氨基酸均能显著促进4种海洋微藻的生长;相比较而言,赤潮异弯藻和凯伦藻更加喜好有机氮氨基酸,而球形棕囊藻和角毛藻更加喜好尿素。海洋微藻具备利用有机氮源的能力,无疑扩展了其氮营养来源,在无机氮缺乏而有机氮丰富的水体中,它们在浮游植物群落中更具有竞争优势。     

一株降解除草剂膦化麦黄桐(PPT)菌的筛选与鉴定

从喷洒有除草剂的土壤中分离到一株能分解膦化麦黄桐(PPT)的细菌.该菌在以PPT为唯一碳源的培养基上生长,能利用PPT的最高浓度为2. 7g/L.采用常规生理生化鉴定方法,并结合16SrDNA序列分析法对该菌进行鉴定.结果表明,该菌与生癌肠杆菌(Enterobactercancerogenus)序列相似性为99. 3%,在细菌分类学上属于肠杆菌.将它命名为Enterobactersp. PPT. 图4表2参7     

Extracellular amylase(s) production by fungi Botryodiplodia theobromae and Rhizopus oryzae grown on cassava starch residue

The fungi Botryodiplodia theobromae and Rhizopus oryzae produce extracellular amylase when grown on a liquid medium containing 2% (WN) soluble starch or cassava starch residue(CSR) (as starch equivalent), a waste generated after extraction of starch from cassava, as the sole carbon source. Using CSR as the sole carbon source, the highest amylase activity of 3.25 and 3.8 units (mg, glucose released x ml(-1) x h(-1)) were obtained in shake flask cultures during the late stationary phase of growth of B. theobromae and R. oryzae, respectively. These values were slightly lower than the values obtained using soluble starch as the carbon source. Maximum enzyme synthesis in CSR incorporated medium occurred at the growth temperature of 30 degrees C and pH 6.0. Presence of inorganic NH4+ salts like ammonium acetate and ammonium nitrate in culture medium yielded more amylase than the other nitrogen sources. Amylase(s) production in the controlled environment of a Table-Top glass Jar Fermenter (2-L capacity) was 4.8 and 5.1 units for B. theobromae and R. oryzae, respectively using CSR as the carbon substrate. It is concluded that CSR, a cheap agricultural waste obtained after starch extraction from cassava could replace soluble starch as carbon substrate for commercial production of fungal amylase(s).     

铜绿微囊藻、四尾栅藻和小环藻竞争实验培养基的选择

改变培养基的氮源形态和碳源浓度,研究铜绿微囊藻、小环藻和四尾栅藻的单藻增长行为,筛选适宜的培养基作为混藻竞争实验的共培养基。研究表明,铜绿微囊藻和四尾栅藻在氨氮培养基中的最大生物量K和最大比增长速率r均不及以硝态氮为氮源的培养基;添加高浓度HCO3-(NaHCO3 1.410 mmol/L)能够提高铜绿微囊藻和四尾栅藻藻细胞对氨氮的吸收能力;较低碳源浓度(NaCO3 0.0943 mmol/L)的培养基中,四尾栅藻的初始比增长速率及生物量远高于铜绿微囊藻,但其最大比增长速率r低于铜绿微囊藻,在实验的第10天左右铜绿微囊藻的生物量超过四尾栅藻;小环藻不能在较高浓度碳源(NaHCO3 1.504 mmol/L)下存活;铜绿微囊藻、四尾栅藻与小环藻均可在以氨氮(HA)或硝态氮(HN)为氮源的培养基中单独培养并达到实验所需生物量,因此,HN和HA可以作为实验室内这三种藻共培养适宜的培养基,为今后研究藻类种间资源竞争机制提供实验依据。