对生态系统中分离获得的菌种进行优势种群测定的方法学探讨：一株优势纤维分解菌的确定

两年内７次从同一个以杨木木屑为原料的厌氧发酵罐的高稀释度发酵液中分离出一株中温纤维分解菌，即新种阿氏梭状芽孢杆菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍａｌｄｒｉｃｈｉｉ）。从细菌计数高且能反复分离获得这两个特点，可以断定阿氏梭状芽孢杆菌在该生态系统中曾是一个优势种群。经菌落及菌体形态学观察，以及用首次分离的菌株所作的多价抗血清酶联免疫吸附试验（ＥＬＩＳＡ），确定７次分离菌株为同一菌种，从而证实阿氏梭状芽孢杆菌在１９８６年９月至１９８８年８月间，曾是该厌氧发酵罐中每毫升含菌高达１０６─１０７的优势纤维分解菌。     

绿色荧光蛋白基因标记内生枯草芽孢杆菌

用枯草芽孢杆菌168菌株rpsD基因的启动子替换质粒pGFP4412中蜡状芽孢杆菌4412启动子,从而构建了能在枯草芽孢杆菌中表达绿色荧光蛋白基因gfpmut3a的载体pS4GFP,将其导入具有内生、防病、促生作用的野生型枯草芽孢杆菌BS-2菌株中,筛选获得遗传稳定性好且具有良好发光表型的标记菌株BS-2-gfp.该标记菌株在小白菜体内的定殖研究结果表明,该菌株能够在小白菜根际及根、茎、叶内定殖和传导,接菌50d后仍能在其体内分离到标记菌株.图5参17     

一株抑制油菜核盘菌菌核形成的解淀粉芽孢杆菌

检测了从不同土壤中分离的17株芽孢杆菌对油菜核盘菌的抑制效果，发现4株菌株具有不同程度的抑制菌丝生长的能力，其中地衣芽孢杆菌菌株AJH-1和解淀粉芽孢杆菌菌株CH-2的抑菌效果最好．CH-2菌株不仅能抑制菌丝的生长，而且能抑制菌核的形成．CH-2菌株培养液经硫酸铵沉淀后具有抑制核盘菌生长的效果，且稀释10倍后仍具有抗菌活性．初步认为CH-2菌株的抑菌活性可能是抗菌蛋白或多肽的作用．图1表5参12     

利用枯草芽孢杆菌株间原生质体融合进行差异表型遗传重组分析的研究

枯草芽孢杆菌D100和枯草芽孢菌TN179同为枯草芽孢杆菌Ki－2－132的两个不同菌株，具有明显的表型差异．它们的融合子D279兼有两亲本的遗传性状，能够在常规培养条件下稳定遗传．但经过EMS处理后，即产生形状与各自亲本相似，且伴随菌落颜色、菌体形状和一些生理变化的分离物．从这些分离物的表型改变，得出了基因及连锁的一些遗传值息．     

利用枯草芽孢杆菌株间原生质体融合进行差异表型遗传重组…

枯草芽杆菌Ｄ１００和枯草芽孢杆菌ＴＮ１７９同为枯草芽孢杆菌Ｋｉ－２－１３２的两个不同菌株，具有明显的表型差异－它们的融合子Ｄ２７９兼有两亲本的遗传性状，能够在常规培养条件下稳定遗传，但经过ＥＭＳ处理后，即产生形状与各自亲本相似，且伴随菌落颜色，菌体形状和一些主要变化的分离物，从这些分离物的表型改变，得出了基因及连锁的一些遗传信息。     

近海养虾场底泥中产芽孢细菌的生态特征

通过对近海养虾场底泥中的细菌数量和类群的调查，发现有超过50％的细菌生物量是产芽孢细菌，因此对底泥中的产芽孢细菌进行了分离和纯化，通过对细胞形态、生理生化等特征的研究和对部分菌株的16S rRNA基因的ARDRA分型、序列分析等，鉴定了67株产芽孢细菌，其中62株属于芽孢杆菌属，5株属于短芽孢杆菌属．进一步对62株芽孢杆菌属的细菌在底泥不同深度的分布进行研究，结果表明，巨大芽孢杆菌主要分布在底泥深度0～6cm左右的区域，海洋芽孢杆菌、短小芽孢杆菌和蜡状芽孢杆菌主要分布于底泥6cm以下的区域，与坚强芽孢杆菌性状相近的菌分布在底泥2～8cm深度；与耐碱芽孢杆菌性状相近的芽孢菌广泛分布在0～12cm区域．讨论认为，应用这些产芽孢细菌资源在修复海洋环境和开发海水养殖微生态制剂方面具有一定可能性．图3表3参15     

硅酸盐细菌解钾兼拮抗活性菌株的筛选

从紫色土壤中分离筛选出具有解钾拮抗双重活性的硅酸盐细菌CS1和CS29菌株。接菌处理,其水溶性钾分别增加75％和65％,转化率达0．82％和0．72％。两株菌对革兰氏阳性的蜡样芽孢杆菌,金黄色葡萄球菌,藤黄八叠球菌等和革兰氏阴性的大肠杆菌均有较强的抑菌活性。筛选菌株中91．2％具有解钾活性,但拮抗活性菌株只占总数的11．6％,表明二性状之间无相关关系。表4参7     

甲基营养型芽孢杆菌的分离鉴定及在防蝇产蛆环境防治中的应用

从华南农业大学试验基地土壤筛选芽孢杆菌,得到17株芽孢杆菌,结合插入序列指纹图谱对分离获得的芽孢杆菌进行聚类分析,共分为3个类群;测定各类群代表菌株的16S rDNA序列,分析其系统发育,结果表明类群Ⅰ代表菌株RF2与甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus CBMB 205~T)相似性为99.48%;类群Ⅱ代表菌株RF10与好氧芽孢杆菌(Bacillus aerophilus 28K~T)相似性为99.61%;类群Ⅲ代表菌株RF16与蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus ATCC14579~T)相似性为99.87%.餐厨垃圾试验表明类群Ⅰ RF2具有餐厨垃圾防蝇产蛆效果;并且生理生化、碳源利用以及抗菌谱试验表明菌株RF2在碱性条件下可以将葡萄糖分解成丙酮酸并脱羧氧化生成二乙酰,既能够将氨转化为氨基酸和胞内其他含氮化合物,也利用多种碳源供自身生长,能够拮抗多种植物病原菌(水稻纹枯病、尖刀廉孢菌、香蕉枯萎病).而RF2在含有难溶性的磷酸盐[Ca_3(PO_4)_2]条件下可分泌出有机酸降低pH值,使难溶性磷酸盐溶解供自身利用.因此本研究获得的菌株RF2是一株具有较强促生作用和应用于防蝇产蛆的芽孢杆菌,具有很好的应用前景.     

乐果降解菌LGX1的筛选及其降解特性研究

通过富集培养,从连续施用农药乐果的土壤中分离得到一株具有较强降解有机磷农药乐果能力的细菌菌株LGX1,通过菌落形态观察及细菌的16SrDNA测序,对其进行了鉴定,同时初步研究了其降解性能。结果表明：该菌株为蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus）,在接种量为20%,乐果初始质量浓度为100mg·L-1,外加碳源葡萄糖质量分数为2%,温度为35℃,初始pH值为4时该菌株对乐果的降解能力最强;并且能在以辛硫磷、毒死蜱和三唑磷为唯一碳源的基础盐培养基中生长,且均比在以乐果为唯一碳源的基础盐培养基中生长的OD600值要高,初步推断菌株LGX1对有机磷农药的降解有一定的广谱性。     

短小芽孢杆菌胞外蛋白质组双向电泳分析及碱性胁迫下胞外差异蛋白鉴定

短小芽孢杆菌Bacillus pumillus SCU11是本实验室从富含蛋白质的生活垃圾中分离并诱变得到的具有高碱性蛋白酶活性的菌株,其分泌的碱性蛋白酶具有很好的生皮脱毛效果,在生物制革工业具有良好的应用前景.短小芽孢杆菌胞外蛋白质多达数百种,为了解其组成情况,采用LB培养基培养短小芽孢杆菌SCU11,以三氯乙酸/丙酮法沉淀发酵上清液中的蛋白质,通过双向电泳分析,建立了具有较高分辨率的短小芽孢杆菌胞外蛋白的双向电泳图谱.在此基础上,分析了碱胁迫条件下短小芽孢杆菌胞外蛋白质的双向电泳图谱,利用液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)鉴定了10个差异蛋白点,其中有5种为胞外分泌蛋白,包含2种胞外蛋白酶.本研究结果表明与呼吸作用及运动相关的蛋白可能参与了短小芽孢杆菌碱胁迫的应答反应.     

苏云金芽孢杆菌抗东亚飞蝗(Locusta migratoria manilensis)的活性

采用毒力生物测定的方法,测定了600株从我国各地土壤和死虫等样品中分离的苏云金芽孢杆菌对东亚飞蝗的毒力.这些菌株几乎分布于已知的70个H血清型.在600株苏云金芽孢杆菌中,有560株(占93.4%)对东亚飞蝗无毒(死亡率小于20%),只有3株(占0.5%)对东亚飞蝗有较高毒性(死亡率大于70%).同时对筛选出的特异性菌株的杀虫活性进行了进一步研究.图2表2参8     

产表面活性剂降解石油菌株产物性质及降解性能研究

微生物是组成生态系统的重要成员,在污染物去除中发挥着重要作用,是生物修复中的主力,然而在石油污染修复过程中,石油烃的疏水性会限制微生物对石油的降解,但一些微生物的细胞代谢物即生物表面活性剂,它是微生物在一定条件下代谢分泌产生的具有一定表面活性,集亲水基和疏水基结构于一分子的两亲性化合物,可以促进油的乳化,提高油的分散程度,增大菌株和油珠的接触机会,促进对石油烃的吸收和降解。在实验室分离得到了7株产表面活性剂石油降解菌株,经分子鉴定可知菌1和菌2都为粘质沙雷氏菌Serratia marcescens,菌3为居植物柔武氏菌Raoultella planticola,菌4,菌6和菌7都为克雷伯氏菌Klebsiella variicola,菌5为蜡状芽孢杆菌Bacillus cereus。主要研究了它们的生长与表面活性剂物质分泌状况的关系,发现随着时间增加,OD值随之增大,表面张力呈现下降趋势;并对菌株产物进行提取和薄层层析,离子型分析和红外光谱分析,初步判断其产物均为阴离子糖脂类;通过pH,初始油质量浓度,接种量和盐度4个单因素的变化研究菌1粘质沙雷氏菌,菌3居植物柔武士菌,菌5蜡状芽孢杆菌和菌6克雷伯氏菌对石油类物质降解能力,发现菌3居植物柔武氏菌和菌5蜡状芽孢杆菌降解性能较好;通过响应曲面法优化蜡状芽孢杆菌的降解条件,得出其最佳降解条件为pH为5.02,油质量浓度为3 g·L-1,接种量为1199.98μL,盐度为0.5 g·L-1时,在此条件下,菌株对石油的降解率为66.94%。     

具有抑菌促生作用的植物内生细菌的筛选

从168株分离自茄科作物体内的对黄瓜枯萎病菌或番茄青枯病菌有拮抗作用的细菌中，筛选出19株对辣椒疫病菌有较好拮抗作用的菌株，其中2号、13号、20号、TL6、TMS2、TB2和QEL17个菌株对以上3种病原菌都有一定的拮抗作用．从拮抗辣椒疫病菌的菌株中筛选出20号、22号、TL6、TB1、TB2和EPL8共6株对番茄有较好促生作用，对辣椒采后果实疫病有一定控制效果，且能进入番茄和辣椒体内的菌株．试验结果表明，防病作用最佳的TB2菌株菌液喷雾处理后接种病菌，4～10d防治辣椒采后果实疫病的效果达55．56％～100％；促生作用最佳的TB1菌株可使番茄苗鲜重增长105．84％，干重增长66．25％．经鉴定，6株有抑菌、促生的内生细菌均为芽孢杆菌(Bacillus sp．)，其中EPL8和22号菌株鉴定为枯草芽孢杆菌(B．subtilis)．表5参8     

蜡状芽孢杆菌不同菌株降解有机磷农药的特性分析

筛选分离降解微生物解决有机磷农药残留给水体和土壤环境带来的污染问题是一项可行的生物修复技术。采用富集培养和定时取样分析有机磷农药残留的方法,分离驯化出三株能够降解有机磷农药的细菌,研究了其形态特征和生理生化特性并对其16SrDNA序列进行了分析,同时比较了三菌株对甲基对硫磷（Methyl－parathion）、毒死蜱（Chlorpyrifos）和_二唑磷（Triazophos）的降解特性。结果表明：通过富集培养得到10菌株具有降解甲基对硫磷和毒死蜱的能力,比较确定HY-1、HY-2和HY-4三菌株作为研究对象,经鉴定为蜡状芽孢杆菌（Bacilluscereus）的不同菌株,三菌株在Genbank上的登录号分别为：eu915687、eu915686和eu915688。在甲基对硫磷质量浓度为50mg·L-1时,三菌株72h的降解率分别为91．7％、87．7％与92．4％．降解率无显著性差异（P〉0．05）,当甲基对硫磷质量浓度增加到100mg·L-1时,三菌株对甲基对硫磷的降解率有所下降,其中HY-2对甲基对硫磷的降解率下降最大达23％,且和其他两菌株有显著性差异（P〈0．05o三菌株72h对100mg·L-1毒死蜱的降解率分别达到64．8％、53．7％和56．5％,在不同的毒死蜱初始质量浓度下,HY-1和HY-4两菌株对毒死蜱的降解率无显著性差异（P〉0．05）,HY-2与HY-1、HY-4两菌株有显著性差异（P〈0．05o三菌株对三唑磷的降解率均较低,其中HY-2对初始质量浓度为100mg·L-1三唑磷的降解率最高仅为20．7％,其余两菌株对三唑磷的降解率比HY-2低且无显著性差异（P〉0．05o可以得出本研究分离得到的蜡状芽孢杆菌不同菌株对有机磷农药的降解存在多态性。     

一株产胞外多糖的山药内生细菌Lysinibacillus fusiformis S-1的分离和鉴定

微生物的胞外多糖是重要的生物资源,为获得新型的具有药用价值的胞外多糖产生菌,从山药、地瓜、马铃薯和胡萝卜的根茎组织中分离、筛选到11株能产胞外多糖的植物内生菌,利用苯酚–硫酸法对这11株菌的多糖产量进行了定量分析.对多糖产量最高的S-1菌株,检测其在发酵过程中菌体生长、胞外多糖生成以及发酵过程的pH变化,绘制其胞外多糖发酵代谢曲线.通过形态观察、培养特性观察、生理生化实验和16S rDNA序列分析对该菌株进行了鉴定.结果显示,S-1菌株在产糖培养基中可以产生1.50 g/L的胞外多糖,在11株菌中产量最高.16S rDNA序列分析显示该菌属于赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus),且与纺锤形赖氨酸芽孢杆菌(L.fusiformis)亲缘最近.综合其形态特征、培养特性和生理生化实验结果,将S-1菌株鉴定为纺锤形赖氨酸芽孢杆菌.该菌在胞外多糖产生菌中少有报道,为胞外多糖的进一步研究提供了菌种资源.     

葡萄糖对芽孢杆菌降解水体中4,4'-二溴联苯醚的促进作用

为了探究4,4'二溴联苯醚(BDE-15)在水环境中的生物降解过程及其影响因素,在实验室内利用筛选得到的芽孢杆菌(Bacillus sp.)对BDE-15进行生物降解试验,并研究了外加碳源和高初始浓度BDE-15对微生物降解能力的影响.结果表明,在葡萄糖作为外加碳源条件下芽孢杆菌能降解水体中BDE-15,4d后菌株对BDE-15的降解率为28％,再次添加葡萄糖可提高降解率至55％.高质量浓度(50 mg·L-1)BDE-15能抑制芽孢杆菌生长,并显著影响菌株对BDE-15的降解能力.     

不同补给水源的城市人工湖中异养菌耐药性及耐药菌种属分布研究

为了阐明不同补给水源的城市人工湖中异养菌耐药状况和耐药菌种属分布特征,选取分别以地表水和再生水为补水来源的XQ湖和FQ湖为代表进行研究。从2018年4—11月逐月采集水样,考察了各水样中对氨苄西林(AMP)、磺胺甲恶唑(SMZ)和四环素(TET)这3种不同种类抗生素具有耐药性的异养菌含量,并对分离菌株的耐药表型、耐药菌株的种属分布以及水质理化指标进行了分析。结果表明,2处人工湖中的AMP耐药菌和SMZ耐药菌含量约为10~2～10~4CFU·(100 m L)~(-1),而TET耐药菌含量则约10~1～10~3CFU·(100 m L)~(-1)。分离出的84株耐药菌归属于19个种,其中蜡状芽孢杆菌、大肠埃希氏菌、维氏气单胞菌、豚鼠气单胞菌和鸟氨酸拉乌尔菌为2个湖共有耐药菌。71.4%的耐药菌都是对AMP单一耐药,以蜡状芽孢杆菌为主。由于具有固有耐药性的细菌在分离出的耐药菌中占比很低,获得性耐药很可能在城市人工湖中异养菌耐药性的发展上发挥了主要贡献作用。地表水补水的XQ湖和再生水补水的FQ湖在总异养菌含量、耐药菌含量和检出率上均无显著差异。分离来源对16株耐药性气单胞菌的聚类无明显影响。     

两株芽孢杆菌降解羽毛比较及抗氧化肽分离

枯草芽孢杆菌UMU4和短小芽孢杆菌SCU11是四川省分子生物学及生物技术重点实验室分离的野生菌株经诱变获得的胞外蛋白酶高产菌株,其分泌的蛋白酶在蛋白废弃物处理方面具有良好的应用前景.为了从这两株芽孢杆菌中筛选出高效利用羽毛的最优菌株,将UMU4和SCU11分别接种到羽毛培养基中并持续发酵6 d,通过每天测试羽毛降解率、可溶性多肽含量、氨基酸含量、蛋白酶活及抗氧化活性等指标来评价这两株菌对羽毛的降解能力.结果发现SCU11能更高效地利用羽毛,其羽毛降解率是UMU4的1.2倍,第5天时约有65%的羽毛转化为可溶性肽和氨基酸;SCU11发酵液的ABTS自由基清除率和还原力均在第3天达到最大值,且显著高于UMU4羽毛发酵液的抗氧化活性;SCU11在第5天所产角蛋白酶和碱性蛋白酶的活性分别是UMU4的1.6和1.2倍.在此基础上,将来自于SCU11的羽毛降解产物经HCl沉淀和疏水层析获得了4个抗氧化肽组分,其中组分F3的抗氧化活性最高.本研究表明芽孢杆菌SCU11较之UMU4具有更高的产酶活性及更强的羽毛降解能力,结果可为家禽羽毛的资源化应用奠定基础.     

一株高效凤眼莲脱胶菌的筛选及鉴定

预处理是生物质能源产品制备中最昂贵、最关键的环节,生物预处理因环境友好和能耗低而受到广泛关注。为获得较好的生物预处理菌株,以脱胶效率为出发点筛选菌株,从凤眼莲(Eichhornia crassipes)生长环境介质中分离菌株,通过富集培养、刚果红平板染色法初筛,获得一株对凤眼莲脱胶效果较好的A_1菌株。在最佳条件下A_1菌株分泌的果胶酶活性、木聚糖酶活性和纤维素酶活性分别为3 925.00、8 331.67和4 883.62 nmol·s~(-1)·mL~(-1);A_1菌株对凤眼莲的1次脱胶减重率为33.37%,3次连续脱胶的累计减重率为49.26%。通过16S rRNA序列鉴定,构建系统发育树分析,该菌株为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)。     

解淀粉芽孢杆菌MY001菌株对几丁质的降解及对芦笋茎枯病菌的拮抗作用

几丁质每年自然总产量高达100亿吨,目前由于工业上缺乏清洁高效的几丁质降解工艺,几丁质资源的利用受到严重制约.以壳聚糖为唯一碳源从土壤中分离筛选出一株具有产壳聚糖酶能力的菌株MY001,发酵上清酶活力约为2.7 U/mg,利用16S rDNA、gyrA及gyrB基因测序的方法将该菌株鉴定为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens).通过分析MY001菌株在不同培养基中的生长曲线特点,结合MY001菌株降解后的几丁质的扫描电镜观察结果,发现该菌株可以直接利用几丁质.另外,发现该菌株对芦笋茎枯病菌[Phomopsis asparagi (Sacc.) Bubak]具有拮抗作用.当胶体几丁质和MY001菌株同时存在时,对芦笋茎枯病菌的抑制更加明显.上述结果表明,解淀粉芽孢杆菌MY001菌株具有降解几丁质和拮抗芦笋茎枯病菌的功能,而且添加几丁质具有拮抗增效作用,因此该菌株有望用于几丁质资源清洁利用和农作物真菌病害生物防治.