泸型酒酒醅与窖泥中乳酸菌群落结构差异

乳酸菌对泸型酒风味品质的发酵形成具有重要作用.为促进对酒醅和窖泥中乳酸菌群落物种组成、发酵演替规律以及表型差异的深入认识,采用分子生态学技术,在种水平上对比和揭示同一窖池酒醅和窖泥中乳酸菌群落的结构差异和演替规律,并运用BugBase预测酒醅和窖泥乳酸菌群落主要表型的差异.结果显示,窖池中共检出6科16属乳酸菌.酒醅发酵过程中乳酸菌平均丰度为65.21%±29.47%,而窖泥中乳酸菌仅占细菌总量的4.06%±4.24%. 0-3 d酒醅中优势乳酸菌是乳杆菌属(Lactobacillus,占乳酸菌丰度44.01%)、魏氏菌属(Weissella,27.33%),其后乳杆菌属丰度维持在91.06%以上,窖泥中优势乳酸菌为乳杆菌属(95.67%±9.17%). OTU0和OTU3是窖池中乳杆菌属的优势物种,其丰度占乳酸菌总量的76.08%±29.21%.酒醅与窖泥乳酸菌需氧类型不同,发酵初期(0-5 d)的酒醅中好氧乳酸菌相对丰度显著高于后期酒醅和窖泥样品(P 0.01),窖泥中兼性厌氧乳酸菌的丰度高于酒醅样品.综上所述,酒醅和窖泥中乳酸菌群落存在时空异质性,可能影响酒醅和窖泥对泸型酒风味的贡献.(图4参34)     

镇江香醋醋酸发酵阶段产乳酸功能细菌的物种多样性

乳酸是传统食醋中主要的不挥发性有机酸,具有柔和食醋酸感、增强风味品质等作用,但是目前对于醋酸发酵过程中乳酸形成的微生物机理尚缺少深入研究.首先分析了镇江香醋醋醅中D-乳酸和L-乳酸含量;继而采用宏基因组和宏转录组测序分析了醋醅中L-乳酸脱氢酶(L-LDH)和D-乳酸脱氢酶(D-LDH)基因的相对表达水平;最后利用兼并引物扩增和扩增子测序方法分析了L-LDH和D-LDH基因的物种多样性.结果表明,参与L-LDH和D-LDH合成的微生物均主要分布在Lactobacillus,其相对丰度均占到80%以上;其中与D-LDH相关的微生物主要为Lactobacillus reuteri(67.9%),Lactobacilluspontis(10.2%),Lactobacillusfermentum(4.1%),Lactobacillushelveticus(1.3%),而与L-LDH相关的微生物主要为Lactobacillus helveticus(70.3%),Lactococcus lactis(9.2%),Lactobacillus pontis(8.0%),Lactobacilluscasei(1.3%).因此,镇江香醋醋酸发酵阶段乳酸主要由Lactobacillus菌群代谢丙酮酸产生,但D-乳酸和L-乳酸的产量则受到具体菌株的调控,其中D-乳酸可能主要由L. reuteri产生,L-乳酸可能主要由Lactobacillus helveticus产生.本研究结果可为解析醋酸发酵过程中乳酸的生物合成途径提供理论基础.(图7表1参30)     

四川蔬菜尾菜可培养乳酸菌多样性及优良菌株筛选

为了解四川地区蔬菜尾菜中乳酸菌(Lactic acid bacteria,LAB)的多样性,筛选适用于尾菜青贮发酵的高效乳酸菌菌株,运用纯培养法、16S rRNA-RFLP和系统发育分析对乳酸菌遗传多样性进行研究,并对分离菌株的产酸能力、耐酸能力、耐高温能力和抗菌能力等4个指标进行测定.结果显示,分离得到的120株乳酸菌中,有18株(占总分离菌株的15.0%)产酸能力较强,10株(8.3%)能耐受50℃高温,11株(9.2%)耐酸能力较强(pH=2.5),13株(10.8%)表现出较强的抗菌能力,而菌株C20(Lactobacillus plantarum)综合发酵特性最优.基于16S rRNA-RFLP聚类图选取10株代表菌株进行16S rRNA基因测序和系统发育分析,发现120株乳酸菌分属于明串珠菌属(Leuconostoc)、片球菌属(Pediococcus)、乳杆菌属(Lactobacillus)和肠球菌属(Enterococcus)4个属,其中明串珠菌属为优势菌.综上,四川地区蔬菜尾菜中蕴含着较为丰富多样的乳酸菌资源,这些乳酸菌在蔬菜尾菜的青贮饲料化利用方面表现出潜在价值.(图2表2参30)     

气相色谱及气相色谱-质谱联用研究窖泥微生物

通过传统分离方法从浓香型白酒窖泥中筛选出5株芽孢杆菌,经气相色谱结合MIDI-Sherlock系统分析,分别为地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、泛酸枝芽孢杆菌、萎缩芽孢杆菌.采用固相萃取技术结合GC-MS技术分析其发酵产物,发现5株菌产风味物质能力都较强且种类丰富,主要有醇类、酮类等化合物,其中3-羟基-2-丁酮(乙偶姻)含量较高,而其代谢产物中的醇类、酮类及愈创木酚等物质对白酒风味的形成起着助香的作用.     

不同培养条件对罗非鱼肠道乳酸菌分离的影响

为了解罗非鱼肠道乳酸菌群多样性和优势菌种,促进乳酸菌在罗非鱼养殖中的应用,采用MRS、M17、TPY、Elliker四种培养基,分别在有氧、厌氧以及30℃、37℃和45℃温度条件下分离罗非鱼肠道乳酸菌,分析不同培养基、培养温度、有氧和厌氧条件对罗非鱼肠道乳酸菌分离的影响;并对分离到的菌株进行分子鉴定和16S r RNA序列分析,构建系统发育树,比较不同分离条件下分离肠道乳酸菌的遗传多样性.结果表明,不同培养基对罗非鱼肠道乳酸菌的分离效果有一定的差异,其中MRS培养基的分离效果最好,且遗传多样性最高;37℃较30℃对乳酸菌的分离更加有利,45℃未分离到乳酸菌;有氧条件下共分离出8种33株乳酸菌,主要为杆菌;厌氧条件下得到10种24株乳酸菌,主要为球菌.共分离到植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)29株,可能是罗非鱼肠道优势乳酸菌种.本研究可为开发水产养殖肠道乳酸菌提供依据,并推广到其他种类的鱼肠道乳酸菌的分离和鉴定.     

添加乙酸对干玉米秸秆与白菜废弃物混贮品质的影响

为促进干秸秆的跨季节贮存及尾菜资源化利用,利用青贮原理将干玉米秸秆与白菜废弃物进行混合贮存发酵,探讨不同添加量乙酸对二者混贮发酵品质的影响,并通过Miseq高通量测序技术解析发酵过程中的微生物多样性.设置ME组(无乙酸添加)为对照组,AA组(添加量0.3%)和AB组(添加量0.6%)为2个乙酸处理组,18±1℃恒温密闭混贮60 d,间隔30 d分析其化学组分、发酵品质及微生物多样性.结果表明,AA组贮存60 d时的干物质、可溶性碳水化合物和粗蛋白含量均显著高于ME组,酸性洗涤纤维和酸性洗涤木质素含量显著下降,半纤维素、纤维素和综纤维素含量显著增加. AB组在30 d和60 d时pH均显著低于ME组,乳酸含量在30 d时显著增加,60 d时显著降低.AA组和AB组中乳酸/乙酸、乳酸/总有机酸及氨氮/总氮值均低于ME组.混贮发酵期间ME组、AA组和AB组的门水平细菌主要为Proteobacteria和Firmicutes,属水平细菌包括Lactobacillus、Paralactobacillus、Enterobacter、Pediococcus、Flavobacterium、Chryseobacterium、Pedobacter、Sphingomonadaceae、Erwinia等,其中Lactobacillus、Paralactobacillus和Enterobacter为优势菌.与ME组相比,AA组和AB组中腐败菌Enterobacter丰度呈下降趋势;2个乙酸处理组的总乳酸菌丰度高于ME组,但乳酸菌多样性较ME组有所减少,主要包括Lactobacillus、Paralactobacillus和Pediococcus等乳酸菌属.总之,干玉米秸秆与白菜废弃物能以适宜比例混贮60 d不变质,尽管添加乙酸后的乳酸发酵强度有所抑制,但低剂量乙酸更有助于保存干物质、可溶性碳水化合物、粗蛋白、综纤维素等有机组分,建议乙酸添加量为0.3%.     

过表达分支酸歧化酶编码基因ARO7对酿酒酵母抑制物耐受性的影响

利用纤维素原料生产乙醇一直是国内外研究的热点,但纤维素预处理过程产生的弱酸、酚类和糠醛等抑制物对酿酒酵母细胞生长和乙醇发酵具有抑制作用,因此,提高酿酒酵母细胞的环境胁迫耐受性是提高纤维素乙醇发酵效率的重要手段之一.对芳香族氨基酸代谢途径中分支酸歧化酶基因ARO7的过表达对酿酒酵母在胁迫条件下细胞生长和乙醇发酵性能的影响进行研究.结果显示,过表达ARO7的重组菌株在含有5.0 g/L乙酸的平板中生长优于对照菌株;在含有5.0 g/L乙酸的发酵培养基中进行乙醇发酵,过表达ARO7的重组菌株的发酵效率高于对照菌株,在菊芋秸秆水解液中ARO7过表达重组酵母菌株乙醇得率由对照的0.44 g/g提高到0.47 g/g葡萄糖,乙醇生产强度提高了22.38%.以上表明,ARO7的过表达可提高酿酒酵母在抑制物存在条件下纤维素乙醇的发酵效率.     

枸杞种植废弃物固态发酵生物饲料条件优化及其微生物群落

枸杞种植废弃物（Lycium barbarum planting waste,LBPW）饲料化是其资源化利用的重要方式之一,也是枸杞种植产业可持续发展的重要环节.发酵是饲料化处理枸杞种植废弃物的核心技术,为提高枸杞种植废弃物的发酵品质和饲用价值,开展固态发酵枸杞种植废弃物为生物饲料的条件优化试验,并探索枸杞种植废弃物发酵产物品质与微生物群落结构之间的联系,以期获得枸杞种植废弃物饲料化技术的关键信息.条件优化试验结果显示,固态发酵枸杞种植废弃物的最佳条件为50%的含水量、25℃的发酵温度、比例为15%的枸杞加工废弃物添加量、80 u/g的纤维素酶添加量,且发酵菌株接种量为3%、酵母菌和乳酸菌的体积比例为3:7,发酵周期为20 d.发酵条件优化后,枸杞种植废弃物发酵产物的品质较未优化前显著提升（P <0.05）.微生物群落分析结果显示,枸杞种植废弃物发酵产物的品质与参与发酵的微生物之间存在密切联系：发酵产物品质好,样品中Lactobacillus丰度高而Devosia丰度低;反之发酵产物品质差,样品中Lactobacillus丰度低而Devosia丰度高.此外,发酵产物的品质越好,发...     

接种异常毕赤酵母对干玉米秸秆与废弃白菜混贮品质的动态影响及微生物群落结构分析

为提升干玉米秸秆与废弃白菜的混贮品质,研究接种异常毕赤酵母(Pichia anomala)对干玉米秸秆与废弃白菜混贮发酵品质的动态影响.试验设置无添加剂对照组(ME)和微生物处理组(PA),连续恒温贮存发酵170 d,间隔一定时间分析感官质量、有机组分和发酵品质,并利用高通量测序技术考察发酵过程中细菌群落的动态变化.结果显示:与ME组相比,贮存170 d期间PA组中的干物质、粗蛋白、可溶性碳水化合物和乳酸含量显著增加(P 0.05),p H值、中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维含量显著降低(P 0.05),乳酸/乙酸和乳酸/总有机酸比值得到优化.细菌群落结构显示:PA组中门水平优势菌为厚壁菌(Firmicutes)和变形菌(Proteobacteria),属水平优势菌为乳杆菌(Lactobacillus)和类乳杆菌(Paralactobacillu).接种异常毕赤酵母能使肠杆菌(Enterobacter)、假单胞菌(Pseudomonas)和黄杆菌(Flavobacterium)等腐败菌的相对丰度逐步降低,130 d时肠杆菌消失,有益乳酸菌的总丰度始终保持在50%以上.本研究表明接种异常毕赤酵母能改善干玉米秸秆与白菜的混贮发酵品质,使干秸秆能保质贮存近半年时间,结果可为其资源化利用提供原料保障.(图5表5参38)     

纤维素酶对干玉米秸秆/白菜废弃物混贮品质的影响及细菌群落解析

为实现干秸秆的跨季节保质贮存,并改善其湿法贮存品质,研究纤维素酶添加量对干玉米秸秆(DMS)与白菜废弃物(CW)混贮发酵品质的影响,解析贮存过程中细菌菌群的动态演替规律.设置对照组(ME,无酶添加)、低剂量组(CA,添加量0.1%)和高剂量组(CB,添加量0.3%),18±1℃恒温密闭贮存170 d,间隔一定时间分析有机组分含量和发酵品质,并利用Miseq高通量测序技术研究细菌多样性的动态变化.结果表明,与ME组相比,CA组和CB组在贮存170 d期间的可溶性碳水化合物含量显著升高,酸性洗涤纤维、中性洗涤纤维、纤维素、综纤维素含量及p H值均显著下降;30-60 d期间CA组和CB组的氨氮/总氮值显著下降,90 d后有升高趋势.贮存170 d期间CA组和CB组中乳酸含量显著增加,乳酸/乙酸比值和乳酸/总有机酸比值得到优化,提高了乳酸发酵程度,改善了发酵品质.细菌群落分析显示,DMS与CW两种废弃物原料有乳酸菌互补性,有利于混贮发酵反应快速启动;加入纤维素酶后的CA组和CB组中门水平优势菌Firmicutes和Proteobacteria及属水平优势菌Paralactobacillus和Lactobacillus相对丰度提高,Enterobacter等腐败细菌于130 d时消失,有益乳酸菌的总丰度始终保持50%以上(除90d的CA组).总之,干玉米秸秆和白菜废弃物密闭混贮能确保干秸秆贮存近半年不变质,添加纤维素酶效果更佳,结合酶成本等因素,生产实践中推荐添加量为0.1%(原料鲜重的0.1%).     

接种不同乳酸菌对干玉米秸秆与白菜废弃物混贮品质的影响

动态研究植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum,LP)和布氏乳杆菌(Lactoacillus buchneri,LB)对干玉米秸秆与白菜废弃物连续混贮170 d期间品质变化的影响,利用Mi Seq高通量测序平台考察细菌多样性.无添加剂设为对照组(ME组),定期分析感官品质、有机化学组分、发酵品质和细菌多样性.结果表明,与ME组相比,30 d时LB和LP组干物质(DM)含量均显著(P0.05)下降,之后分别于60 d和90 d显著(P0.05)增加,且LB组始终高于LP组.贮存170 d期间LP和LB组中可溶性碳水化合物(WSC)含量显著(P0.05)高于ME组,且LB组始终高于LP组(除130 d).30-90 d期间LP和LB组pH显著(P0.05)低于ME组,且LP组始终低于LB组,LP组乳酸(LA)含量显著(P0.05)增加,氨态氮/总氮(AN/TN)显著(P0.05)降低.130-170 d期间LP和LB组中乳酸/乙酸(LA/AA)和乳酸/总有机酸(LA/TOA)均明显低于ME组,乳酸发酵程度变弱.3个处理组中厚壁菌(Firmicutes)和变形菌(Proteobacteria)为门水平优势类群;乳杆菌(Lactobacillus)始终为属水平优势菌;2种乳酸菌剂均能使肠杆菌(Enterobacter)、假单胞菌(Pseudomonas)和黄杆菌(Flavobacterium)等腐败菌丰度显著(P0.05)降低,130 d时Enterobacter消失.总之,L.plantarum有助于改善混贮中前期(90 d)发酵品质,能有效保存纤维素、半纤维素和综纤维素等能源组分,L.buchneri有利于170 d贮存期间的DM和WSC保存;建议实际生产中根据贮存周期长短来选择适宜的乳酸菌,以便获得最佳贮存品质.     

新型己酸菌强化对人工窖泥培养过程中原核微生物群落结构及酸、酯含量的影响

人工窖泥对于浓香型白酒的生产酿造起着至关重要的作用.前期研究中首次分离到能够利用乳酸合成己酸的新型产己酸菌,一种瘤胃梭菌(Clostridium sp. CPC-11,CGMCC No. 9926),该菌属于瘤胃菌科(Ruminococcaceae)中Clostridium cluster Ⅳ的一个新种.在此基础上,通过16S rDNA高通量测序技术(MiSeq)结合有机酸与酯类含量分析研究CPC-11在强化人工窖泥的制作过程中对窖泥微生物群落结构和理化指标的影响.结果显示,经35 d培养,窖泥微生物群落多样性显著降低,表明窖泥中杂菌不断减少,有益菌不断增加.其中,芽孢乳杆菌科(Sporolactobacillaceae)与瘤胃菌科(Ruminococcaceae)成为最主要的优势类群,丰度分别为66.2%和22.8%.窖泥中己酸的含量在前21天不断升高,但在35 d时显著下降(P 0.05);乳酸和乙醇呈不断升高趋势,而乙酸则缓慢下降,丁酸未有显著改变.酯类分析显示,四大酯类(乙酸乙酯、乳酸乙酯、丁酸乙脂和己酸乙酯)积累量均呈不断增加趋势.冗余分析(RDA)结果显示,窖泥中己酸含量与瘤胃梭菌(Clostridium cluster IV)呈正相关,与芽孢乳杆菌呈负相关;乳酸含量与芽孢乳杆菌、乳酸杆菌呈正相关.本研究表明新型己酸菌的强化可以在35 d内使己酸菌的相对丰度保持在22.8%,并显著提高己酸乙酯在窖泥中的累积量,促进窖泥快速成熟;结果可为改进人工窖泥的制作方法和提高人工窖泥的品质提供理论依据.(图5表3参31)     

紫外诱变选育高产丁二酮乳酸菌株及其低成本发酵优化

2,3-丁二酮是一种常用的安全食品添加剂,为了提高微生物发酵中菌株的丁二酮产量,从泡菜水样品中分离筛选出一株野生型高产丁二酮菌株,并进行紫外诱变选育以及发酵条件优化.筛选获得高产丁二酮野生型乳酸菌株(1)-2,产量为67.02 mg/L,经16S r DNA分子鉴定为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum).紫外诱变获得高产丁二酮突变株U13,产量为127.88 mg/L.对突变前后菌株几种丁二酮代谢相关酶酶活变化的比较结果显示,突变株丁二酮产量的提高是因为乳酸脱氢酶减少及乙酰乳酸合成酶增加.正交实验优化突变株U13的最佳丁二酮发酵条件为接种量3%,初始pH 6.6,葡萄糖30 g/L,组合氮源(蛋白胨:酵母粉:牛肉膏=2:1:2)20 g/L,柠檬酸氢二铵3 g/L,乙酸钠2 g/L,吐温-80 1 m L/L,K_2HPO_4 2 g/L,Mg~(2+)2 mmol/L,Mn~(2+)0.7 mmol/L,Cu~(2+)2 mmol/L,温度为37℃.利用廉价碳氮源淀粉及小麦麸皮替代原有碳氮源,淀粉替代率不超过20%、小麦麸皮替代率不超过40%时,丁二酮产量降幅比较低.本研究通过诱变选育和发酵条件优化,提高了菌株丁二酮产量,并通过廉价碳氮源替换降低了成本,可为丁二酮的微生物工业发酵提供参考.