基于转录组的‘黄花2号’水仙ARF基因家族分析

生长素反应因子(Auxin response factors,ARFs)在植物生长发育过程调节生长素响应基因表达中发挥着重要的作用.为了解多花水仙ARF家族,基于转录组数据,通过NR、NT、Swiss-Prot和PFAM 4个数据库、NCBI网站和在线软件SMART的注释筛选,利用ExPASy-ProtParam tool、SOPMA、Prot Comp、MEME、MAGA和Heml软件进行氨基酸理化性质、蛋白二级结构、亚细胞定位、保守基序、系统进化树和小鳞茎萌发不同时期的表达模式分析.共筛选得到21个ARF家族基因,生物信息学分析12个全长基因蛋白长度在193-1 096 aa之间,预测的分子量(Mr)为20.46-122.2,等电点为5.19-7.97,全部为不稳定的亲水蛋白,亚细胞定位预测均位于细胞核中.进化树和基序分析表明,21个NtARF蛋白分为3个大组,GlassⅢ进一步被分为3个亚组,分支相近的ARF转录因子具有相同或相近的基序. NtARF8、NtARF13、NtARF15、NtARF17和NtARF21都展现较高的表达模式,可能是通过正向调节生长素的含量来促进小鳞茎的萌发.本研究表明,NtARF家族可能在多花水仙扦插繁殖过程中发挥着重要作用,结果可为将来深入研究多花水仙ARF基因家族的功能奠定基础.(图6表2参29)     

基于苋菜转录组的ARF基因家族鉴定及表达

ARFs(auxin response factors)是重要的生长素响应因子,在植物的生长发育过程中起着关键的作用.基于'大红'苋菜转录组数据,通过在线分析软件SMART和NCBI-Blastp的注释筛选苋菜ARF基因家族成员(AtrARF);利用生物信息学分析软件,对AtrARFs蛋白的理化性质、二级结构、亚细胞定...     

基于多花黄精转录组的HIPPs/HPPs基因家族鉴定与表达调控

PcHIPPs/PcHPPs是一类细胞内可溶性金属结合蛋白,在调节植物重金属稳态、解毒机制、重金属耐受等方面发挥重要作用,目前关于HIPPs/HPPs基因家族在多花黄精中还未有人研究.基于多花黄精不同转录组数据,采用生物信息学进行理化性质分析、亚细胞定位和保守基序及系统进化树分析,并对其功能进行初步分析,研究HIPPs/HPPs基因在不同铅处理下的表达情况.结果表明：从多花黄精中鉴定出68个PcHIPPs和43个PcHPPs基因;PcHIPPs基因家族的氨基酸数为134-501,分子量介于15.53-53.09 ku之间,等电点介于5.12-9.88;PcHPPs基因的氨基酸数为101-352,分子量介于11.46-38.23 ku,等电点介于5.58-10.41;亚细胞定位预测表明,PcHIPPs/PcHPPs基因有73个分布在细胞核内;通过KEGG分析发现PcHPP3、PcHIPP28-5、PcHIPP28-6、PcHPP1-5参与到代谢过程;PcHIPPs/PcHPPs基因在多花黄精根状茎中主要发挥作用,在盐胁迫处理48 h下大部分PcHIPPs/PcHPPs基因表现出明显的下调...     

茶树黄化种‘天山黄芽’的广泛靶向及靶向代谢组学分析

茶树黄化品种具有较高的营养价值和观赏性,是茶树特色新品种选育的重要目标.为探究两份新黄化茶树的特征代谢物,采用广泛靶向及靶向代谢组学测定‘天山黄芽1号’‘天山黄芽2号’以及‘福鼎大白茶’芽叶的主要生化成分和代谢物.结果显示,在‘天山黄芽1号’‘天山黄芽2号’和‘福鼎大白茶’中鉴定出791种代谢物,其中52.34%-54.23%的代谢物在不同茶树中存在显著差异.KEGG富集分析表明,差异代谢物主要被富集在与氨基酸和黄酮生物合成等相关途径上.‘福鼎大白茶’‘天山黄芽1号’和‘天山黄芽2号’的氨基酸总量分别为46.29±1.72、73.91±1.55和81.36±1.45 mg/g,儿茶素总量分别为101.99±8.50、94.06±9.94和74.43±4.84 mg/g.与对照种‘福鼎大白茶’相比,‘天山黄芽1号’和‘天山黄芽2号’黄酮含量较低,氨基酸含量高,尤其是茶氨酸含量高达52.34 mg/g和53.99 mg/g.综上,‘天山黄芽1号’和‘天山黄芽2号’属于高茶氨酸茶树资源;结果可为其选育利用提供数据支撑.（图5表1参30）     

播娘蒿转录因子DsCBF1突变体的构建及其蛋白质的EMSA试验分析

CBF(C-repeat binding factor)是调控植物冷驯化相关基因表达的调控转录激活因子,可与下游冷应答基因启动子的核心序列CBT/DRE元件(CCGAC)特异性地结合,启动耐寒基因的表达,提高植物的抗寒能力.为揭示播娘蒿(Descurainia sophia)的抗寒机制,研究播娘蒿转录因子Ds CBF1蛋白AP2区域编码氨基酸对启动下游抗寒基因表达的作用.首先分析Ds CBF1蛋白AP2区域编码氨基酸的疏水性,设计重叠延伸PCR引物,定点突变Ds CBF1基因;然后构建p ET32a-Ds CBF1突变体原核表达载体,通过冻融法转化入宿主大肠杆菌BL21(DE3)中,进行原核表达,并通过镍离子亲和层析纯化Ds CBF1突变体蛋白;最后利用化学发光法EMSA试验(Electrophoretic mobility shift assay)方法分析Ds CBF1蛋白与含有CRT/DRE元件的DNA探针之间的相互作用.EMSA试验分析显示,播娘蒿Ds CBF1的AP2区域的57位苯丙氨酸F(TTT)和68位缬氨酸V(GTT)分别突变为精氨酸R(CGT)和谷氨酸E(GAA),导致播娘蒿顺式调控因子Ds CBF1蛋白与下游冷响应基因的CRT/DRE元件结合效率出现明显下降趋势,说明播娘蒿Ds CBF1蛋白AP2区域编码氨基酸位点的突变影响了播娘蒿的抗寒能力.本研究表明播娘蒿Ds CBF1的AP2区域的57位苯丙氨酸F(TTT)和68位缬氨酸V(GTT)位点对于播娘蒿的冷驯化具有十分重要的作用.     

杏鲍菇转录组数据SSR位点的生物信息学分析

为了开发杏鲍菇分子标记,利用前期高通量测序技术获得的杏鲍菇转录组数据,采用生物信息学软件Trinity拼接,然后通过MISA软件检索并分析杏鲍菇转录组简单重复序列(Simple sequence repeats,SSR)位点.共获得45 833条unigene,在其中的3 256条unigene中检测到3 811条符合软件参数的SSR序列,发生频率为8.31%.SSR位点平均长度为15 bp,平均分布频率是1/15.91 kb.在杏鲍菇转录组的SSRs中,单核苷酸与三核苷酸重复基元为主要重复类型,分别占总SSRs的45.24%和35.53%.SSR基元的重复次数为5-24次,其中5次或10次重复是发生频率最高的,SSR重复基元共有85个类型,其中A/T是最常见的重复基元,比例为38.97%,其次为AG/CT,比例为8.24%.对3 811个SSR位点设计出3 644对SSR引物,随机选择20对引物进行PCR扩增,其中9对在3个杏鲍菇品种中表现出多态性.本研究表明杏鲍菇转录组SSR位点多态性丰富,具有较高的应用潜力.     

浮萍转录组数据SSR位点的生物信息学分析

为开发浮萍分子标记技术,采用高通量测序技术获得浮萍转录组原始实验数据,经过生物信息学软件Trinity拼接后,获得74 797条unigene.进一步采用生物信息学分析软件MISA对所有的unigene进行SSR位点数据挖掘.共计搜索出14 250个SSR位点,分布在12 707条unigene中,出现频率为19.05%,SSR平均长度为19 bp,平均分布频率是1/6.57 kb.在浮萍转录组的SSRs中,二核苷酸与三核苷酸重复序列为主要重复类型,分别占总SSRs的70.74%和25.37%.浮萍转录组数据中SSR序列共包括185种重复基元类型,二核苷酸重复基元AG/CT和三核苷酸重复基元CCG/CGG是优势重复基元,分别占总SSRs的69.19%和8.84%.综上表明浮萍SSRs位点具有极大的可开发性.     

基于山桐子转录组序列的SSR分子标记开发

为研究山桐子遗传多样性,对山桐子转录组数据进行分析,开发SSR分子标记技术.将山桐子高通量转录组测序获得的84 213条Unigene进行简单重复序列(SSR)位点挖掘和分析,并结合引物验证,初步证明其可行性.通过软件分析,共获得含SSR位点的序列数23 077,出现频率为27.40%,涉及序列数量为29 953条,发生频率为35%.SSR序列中包括1 620种重复基元类型,其中单核苷酸、二核苷酸和三核苷酸为优势重复类型,SSR位点数分别为9 782(32.67%)、6 921(23.11%)和5 420(18.10%).单核苷酸中A/T类型比例最高,为9 630(32.15%),二核苷酸和三核苷酸中以类型AG/CT(4 679;15.62%)和AAG/CCT(1 220;1.53%)为主.SSR位点重复次数差别较大,主要是3次(4 748;15.70%),其次为6次(3 707;12.25%)和5次(3 475;11.60%).运用多态性分析的方式初步验证SSR位点在不同地区山桐子标记中的可行性.同时,利用Primer 5.0进行引物设计,随机筛选100对引物进行验证,31对引物可以扩增出条带,19对引物扩增出预期大小的条带,8对引物能特异性区分宜宾、资阳、宁强、成都4个不同地区的山桐子.本研究通过分析山桐子高通量转录组序列的SSR信息,筛选出8对引物验证不同地区山桐子的遗传多样性,将有助于山桐子基因挖掘、分子标记育种和资源保护等后续工作的开展.     

龙眼Hsf基因家族全基因组鉴定及体胚发生过程中的表达分析

基于龙眼基因组数据库对龙眼Hsf(DlHsf)基因家族进行全基因组鉴定,并对其基因结构、启动子作用元件和CpG岛分布情况、编码蛋白的理化性质和进化情况以及它们在不同体胚发生阶段和不同组织器官的表达情况进行研究,同时对靶定DlHsf的miRNA进行预测分析.结果表明:DlHsf基因家族共20个成员,基因结构高度保守.它们编码的蛋白具有典型的DNA结合域(DBD),且均为不含信号肽的不稳定蛋白.启动子分析发现,该基因家族成员的启动子除典型的热激元件(HSE)外,还含有MYB元件等与逆境胁迫及生长发育相关的元件,DlHsfA1d、DlHsfA9a、DlHsfA9b和DlHsfC1启动子存在典型的CpG岛.进化树分析表明DlHsf可分为DlHsfA、DlHsfB和DlHsfC三类. qRT-PCR结果表明,DlHsf在胚性阶段(EC)和球形胚阶段(GE)表达量较高,在不完全胚性紧实结构阶段(ICpEC)表达量较低,在龙眼体胚发育过程中呈现"V"状趋势,表明DlHsf可能主要在EC、GE阶段发挥作用.此外,DlHsf家族成员在花芽和花蕾中表达量较高,其次是在果肉中,推测DlHsfs可能与龙眼花发育等生长过程相关. psRNA Target预测结果表明DlHsf基因家族受到miRNA调控,且调控方式多样.本研究表明DlHsf功能多样,可能在龙眼生长发育、胁迫响应、DNA甲基化、组织器官特异表达等生物学过程中发挥作用.(图8表5参38)     

龙眼BRI1基因家族的全基因组鉴定及光照响应表达

为了解龙眼BRI1基因家族的生物学功能及响应光照机制,对其BRI1基因成员鉴定、基因结构、蛋白保守结构域、启动子顺式作用元件、互作miRNA预测、不同体胚发生阶段和不同组织器官的FPKM值及其响应光照表达模式等进行分析.结果表明:DlBRI1基因家族包含4个成员,分别命名为DlBRI1-1、DlBRI1-2a、DlBRI1-2b和DlBRI1-3.DlBRI1是一种无内含子基因,无内含子基因在转录的过程中不需要经历内含子的剪切步骤,是响应外界因素的一种快速应答基因.龙眼BRI1蛋白家族为植物富亮氨酸重复类受体蛋白激酶的一种,其在植物激素信号转导和非生物胁迫中具有重要调控作用.龙眼BRI1四个家族成员启动子均含有大量的光响应元件、激素应答元件、非生物胁迫响应元件,表明龙眼BRI1家族基因可能是连接光信号转导与激素信号转导的重要纽带. DlBRI1-3为miR390e的靶基因. FPKM值分析表明,DlBRI1-1和DlBRI1-3在体胚发生过程和不同组织部位中均呈现高表达,推测DlBRI1-1和DlBRI1-3可能在龙眼整个生长发育过程中起到更为关键的作用.荧光定量PCR结果推测,蓝光信号使得miR390的表达量显著减少,导致靶基因BRI1-3的表达量增加,从而影响油菜素内脂从属基因BZR1、转录因子PIF4,进而影响龙眼功能性代谢产物积累.本研究表明DlBRI1具有功能多样性,可能在龙眼响应光信号、激素信号、非生物胁迫及代谢调控中发挥作用.(图8表3参46)     

茶树GH1基因家族鉴定及其在茶鲜叶萎凋过程的表达

糖苷水解酶第1家族基因(GH1)在茶叶香气形成中发挥着重要作用.为了解茶树GH1家族成员的进化特性及其在茶鲜叶萎凋过程的表达规律,基于茶树基因组数据库,对GH1基因家族进行全基因组鉴定,并对其编码蛋白的理化性质、亚细胞定位、保守基序及其在不同组织和茶鲜叶萎凋过程的表达模式进行分析.结果显示,茶树GH1基因家族共31个成员,分为5个亚家族,同一亚家族的GH1具有类似的保守基序,保守性较高.GH1基因编码142-871个氨基酸,GH1在细胞中分布很广,包括分泌通路、细胞核、胞浆等.GH1基因表达量从高到低依次为幼嫩茎段、幼根、幼果、成熟叶、嫩叶、顶芽、老叶和花.在茶鲜叶萎凋过程中,大部分GH1基因在鲜叶和萎凋减重10%阶段优势表达,而CsGH1BG6、CsGH1BG7和CsGH1BG26在茶鲜叶萎凋减重20%至60%之间上调表达,这是GH1基因参与白茶加工品质调控的关键时期.本研究表明上调表达的GH1基因对茶鲜叶的失水胁迫调控和萎凋过程香气的形成起到积极的作用,可作为进一步开展茶鲜叶萎凋过程品质形成研究的候选基因;结果可为茶叶加工品质调控奠定基础.(图5表2参30)     

高羊茅中一个DREB类转录因子基因的分离及鉴定分析

为了鉴定草坪草高羊茅(Festucaarundinacea Schreb.)中与低温、高盐和干旱胁迫相关的基因,我们构建了冷诱导(4℃)的高羊茅cDNA文库,并从这个文库中分离得到一个DREB类转录因子基因,FaDREB1A.序列分析表明,FaDREB1A具有一个717bp的开放阅读框和143bp的3’非编码区,推测的氨基酸序列中含有一个高度保守的EREBP/AP2结构域.酵母单杂交结果表明,FaDREB1A蛋白能在体外特异结合DRE元件,并具有转录激活功能.Southern杂交结果显示,FaDREB1A在高羊茅基因组中可能是单拷贝或低拷贝基因.Northern杂交结果发现,FaDREB1A基因受低温、高盐和干旱的诱导表达,对ABA没有反应,说明FaDREB1A基因在高羊茅植株对低温、高盐和干旱的应答反应中起重要作用.图5参30     

三唑酮对大型溞代际影响的转录组学分析

三唑酮是一种普遍使用的唑类杀菌剂,其对水生生物的危害已经引起广泛关注。为探讨三唑酮对无脊椎动物的毒性效应和致毒机理,以大型溞为模式生物,开展多代试验,评估不同浓度(5、12.5、25、50、100和200μg·L^(-1))的三唑酮对大型溞生长和繁殖以及每代时间间隔的影响。结果表明,暴露21 d后,200μg·L(-1))的三唑酮对大型溞生长和繁殖以及每代时间间隔的影响。结果表明,暴露21 d后,200μg·L^(-1)的三唑酮显著降低了大型溞的体长和繁殖能力。转录组分析发现,三唑酮暴露后,F1代和F2代的处理组与对照组的差异表达基因分别为376个和422个,而两代间的差异表达基因共2 604个。通过对差异表达基因的功能富集发现,三唑酮对大型溞F1代影响的主要通路有蛋白质吸收消化、视黄醇新陈代谢、氧化应激和甾类激素生物合成等,对F2代影响的主要通路有抗原处理和呈递、类固醇生物合成和谷胱甘肽代谢等。三唑酮对大型溞可能的毒性作用有氧化应激、内分泌干扰效应、神经毒性和免疫毒性,且可能会存在传代效应。     

中华猕猴桃‘红阳’Alase家族基因的克隆及表达分析

在高等植物中醛糖酸内酯酶(Alase)催化L-半乳糖酸(L-Gal A)形成抗坏血酸(Ascorbic acid,As A)的前体物质L-半乳糖-1,4-内酯(L-Ga IL),是As A合成分支途径D-半乳糖醛酸途径中的关键步骤.基于最新的猕猴桃基因组数据库,分离并克隆到3个Alase家族基因,分别命名为Alase1、Alase2、Alase3,并从基因信息、蛋白质理化性质、二级结构及序列特征方面对其进行预测及分析.结果表明,Alase为亲水性蛋白,二级结构主要以α-螺旋和不规则卷曲为主,3个Alase基因具有高度的相似性.定量RT-PCR分析表明3个Alase家族基因在不同组织中均有表达,且在成熟的叶片中表达量最高.同时在猕猴桃果实发育及成熟过程中,Alase家族基因在幼果中的表达水平较低,而在果实发育后期及果实成熟过程中表达量不断升高.本研究可为Alase家族基因后续功能研究及猕猴桃中As A生物合成和积累分子机制解析奠定基础.     

基于RNA干扰的家蝇几丁质酶2的幼虫转录组测序

几丁质酶是昆虫几丁质降解过程中的重要酶类,在昆虫整个生长发育过程中发挥着重要作用.为筛选及挖掘与防治有害医学昆虫相关的分子靶标,根据家蝇几丁质酶2(Musca domestica chitinase 2,MdCht2)基因序列设计并合成双链RNA(double-stranded RNA,dsRNA),采用微量注射法向家...     

伸展摇蚊(Chironomus tentans)转录组测序及胰岛素信号通路关键基因序列分析

为了探索基于胰岛素信号通路的无脊椎动物内分泌干扰性基因标志物,以伸展摇蚊(Chironomus tentans)为模式生物,在转录组测序基础上识别胰岛素信号通路中的关键基因,并针对InR、Pdk、Akt、FoxO等上游基因进行了cDNA全长扩增和氨基酸序列的多物种比对。基于该研究获取的cDNA全长序列,伸展摇蚊InR、Pdk、Akt、FoxO基因可分别编码含1 436、522、520、470个氨基酸的蛋白序列,序列同源性比对、系统发育树分析结果验证了其进化保守性。伸展摇蚊Ⅰ～Ⅳ龄幼虫、蛹、雌性成虫、雄性成虫中基因相对表达量的实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测结果表明,InR、Pdk、Akt、FoxO在伸展摇蚊体内的表达趋势相似。Ⅰ龄和Ⅳ龄幼虫的基因表达峰值提示胰岛素信号在Ⅰ龄和Ⅳ龄幼虫中诱导了较快的生长发育速率;雌性成虫InR、Pdk、Akt、FoxO的表达显著高于雄性,这可能与胰岛素信号参与雌性生殖系统发育有关。     

广玉兰新品种‘碧翠’的抗寒性评价及抗寒性指标筛选

为评价广玉兰新品种‘碧翠’的抗寒性以及筛选抗寒性评价指标,通过低温胁迫对‘碧翠’和‘埃克斯茅斯’抗寒性进行对照研究,测定其离体叶片的生理生化指标,对抗寒性进行综合评价及指标筛选.结果表明:随着温度的降低,两者的相对电导率(REC)和丙二醛(MDA)含量均逐渐升高,SOD活性和POD活性无明显变化规律,可溶性蛋白(SP)和游离脯氨酸(Pro)呈现先上升后下降的趋势,半致死温度(LT_(50))均随气温的下降而降低,‘碧翠’LT_(50)为-3.03℃,‘埃克斯茅斯’LT_(50)为-4.28℃,与抗寒性综合分析结果相一致,‘碧翠’‘埃克斯茅斯’.6个抗寒性指标中REC、SP两个生理生化指标是反应抗寒性强弱的较佳指标.     

水稻籼粳杂种雌性不育突变体91FS及其双亲的RAPD分析

以水稻籼粳杂种雌性不育突变体91FS及其双亲籼稻涪江2号和粳稻02428为材料进行RAPD分析.从检测过的100个引物中发现有10个引物扩增出多态性产物,表明91FS既承袭了双亲的遗传物质,又发生了新的变异,这为91FS的水稻籼粳杂种真实性提供了分子水平上的证据。     

泰乐菌素降解菌的分离鉴定及其系统发育分析

发酵法生产泰乐菌素过程中产生的大量废弃药渣,因残留泰乐菌素的存在,会对环境带来不利影响.采用微生物法降解药渣中残留的泰乐菌素.结果表明:从堆放泰乐菌素药渣附近土壤中分离筛选到1株高效降解泰乐菌素的菌株,经16S rDNA鉴定为无丙二酸柠檬酸杆菌(Citrobacter amalonaticus).该菌为好氧型革兰氏阴性杆菌,菌落直径0.5~1.5 mm,可利用多种糖类、醇类和氨基酸作为碳源或氮源,具有较强的耐盐、耐酸、耐碱能力,对温度的适应范围较宽.用该菌株在30℃下处理含50 mg/L泰乐菌素培养基72 h,培养基中未检到泰乐菌素的存在.说明利用微生物法可有效降解药渣中残留的泰乐菌素.