FISH法检测生物膜中硝化细菌流程的建立及优化

通过试验筛检荧光原位杂交（FISH）技术在检测反应器生物膜中硝化细菌时适合的实验条件。结果显示,FISH技术检测生物膜中硝化细菌时．较好的预处理条件和杂交条件为：样品在热固定前不需1xPBS清洗;检测生物膜中硝化细菌的实验条件：①硝酸细菌：杂交温度46℃,杂交时间5h,洗脱液中c（NaCl）为55mmol／L;（爹亚硝酸细菌：杂交温度46℃,杂交时间3h,洗脱液中c（NaCl）为30～40mmol/L。     

FISH技术定量解析亚硝酸盐氧化菌的条件优化

利用基于亚硝酸盐氧化菌(nitrite-oxidizing bacteria,NOB)16S rRNA序列的荧光探针,优化了针对亚硝酸盐氧化菌的FISH技术实验条件.确定了FISH技术定量检测亚硝酸盐氧化菌的具体方法,并优化了样品预处理的实验条件为热固定2h,4%多聚甲醛固定15min,乙醇脱水5min;杂交过程的实验条件为杂交温度46℃,杂交时间3h,洗脱液中NaCl浓度为60mmol·L-1.运用建立的FISH技术检测了7d内亚硝酸盐氧化菌菌群的丰度变化,充分显示了荧光原位杂交技术(Fluorescence in Situ Hybridization,FISH)的快速定性定量检测优势.     

一种新型生物膜法除磷工艺中聚磷菌的富集培养过程

采用挂式尼龙作为生物载体的新型生物膜反应器处理合成废水,探讨短时间内在该常规生物膜上富集培养高浓度聚磷菌的可行性,并从反应器运行效率、除磷速率以及聚磷菌的富集状态等方面进行验证.反应器启动运行10 d后,好氧阶段正磷酸盐去除率稳定在95%以上,COD出水浓度均在50 mg·L~(-1)以下,并在该处理水平稳定运行了50 d.运行培养48 d后,吸磷及释磷速率由相同的3.4 mg·(L·h)-1分别提高到8 mg·(L·h)-1和6 mg·(L·h)-1,好氧和厌氧周期由相同的6 h分别缩短到2 h和3 h.运行培养50 d经荧光原位杂交法(FISH)测定,污泥中聚磷菌的丰度从原泥的48.96%提高到70%,杂交图中的聚磷菌以大块团聚态出现,由直接显微镜法测得生物膜厚度约为28.9μm,证明生物膜上聚磷菌群已处于动力学增长末期即生物膜已经成熟.经过50 d的强化培养,能够在常规尼龙填料上富集占总菌70%的高浓度聚磷菌,使得本反应器能高效去除污水中的磷与有机物.     

基于秸秆厌氧干发酵的FISH预处理条件优化

优化了荧光原位杂交技术(FISH)定量测定秸秆厌氧干发酵基质中微生物的样品预处理条件,并在最优条件下做了验证性实验。结果表明:使用无水乙醇作为清洗液,FISH样品的荧光信号强度和丰度比用PBS清洗液(磷酸缓冲盐溶液)时有显著提高;样品预处理过程中加无菌玻璃珠震荡能提高微生物的分散度,从而提高FISH技术对秸秆厌氧发酵基质中微生物定量的准确性;采用离心转速为13 000 r/min时,微生物菌体收集率提高,而且还能保证完好的细胞形态,为后续的FISH杂交奠定基础。     

聚磷菌透射电镜超薄切片样品制备过程的优化

透射电镜样品的制备条件与步骤会对聚磷菌(phosphorus accumulating organisms,PAOs)细胞内超微结构的观察产生影响。以纯培养、混合培养条件下生长的聚磷菌为观测对象,在常规的透射电镜制样方法的基础上,采用新的清洗、固定、染色策略,进而提出一种适合不同生长条件下聚磷菌的透射电镜制样新方法。实验结果表明,新方法比常规方法更简便有效;并且采用新方法制备样品,不同培养条件下生长的PAOs体内聚磷(poly-Ps)颗粒在采用透射电镜观察时超微结构清晰、反差效果较好。     

微丝菌(Microthrix parvicella)原位荧光杂交(FISH)定量过程的条件优化

微丝菌(Microthrix parvicella)是世界范围内诱发活性污泥膨胀现象的主要丝状菌之一,它在活性污泥中准确的原位定量解析对污泥膨胀现象及控制策略研究具有非常重要的意义.由于微丝菌自身的特殊生理生化性质(如表面高疏水性及较厚细胞壁)易导致常规荧光原位杂交(FISH)过程中定量结果偏低.本研究针对FISH过程中存在的探针渗透率低、荧光信号偏弱等现象,从活性污泥样品前处理、杂交过程条件等方面对Microthrix parvicella的FISH定量过程进行了优化.结果表明,在前处理使用溶菌酶(浓度为36 000 U·m L~(-1)),探针浓度为4.5 ng·μL~(-1),杂交时间延长至4 h的条件下,Microthrix parvicella的FISH定量结果可从1.12%提高至96.70%,并与定量PCR(q-PCR)结果和EikelboomJenkins法(镜检观察)定量结果更为趋近一致.     

厌氧污泥颗粒化中微生态形成过程表征

采用荧光原位杂交（FISH）和聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳（PCR-DGGE）技术,表征了厌氧污泥颗粒化过程中微生物种群多样性及群落相似性的变化,解析了关键微生物中产氢产乙酸菌、耗氢产乙酸菌及产甲烷菌的动态演替,初步探讨了颗粒污泥微生态群落的形成过程.结果表明,正常启动的厌氧反应器中,颗粒污泥生长周期超过180 d...     

生物除磷系统中聚磷菌检测常用技术

作为生物除磷系统中的主要功能菌,对聚磷菌菌群进行定性、定量分析是深入理解生物除磷系统、提高除磷效率的必然趋势。目前常用于检测聚磷菌的方法主要有生物化学法和分子生物学法,文章主要阐述了荧光原位杂交技术、聚合酶链反应技术、变性梯度凝胶电泳技术以及多技术结合使用的特点及应用情况,并在此基础上提出了改进措施以及聚磷菌检测技术的发展方向。     

厌氧颗粒污泥中微生物种群变化的分子生物学解析

荧光定量-聚合酶链式反应(RTQ-PCR)与荧光原位杂交(FISH)技术对厌氧反应器内不同状态下颗粒污泥中微生物种群的数量变化与空间分布进行研究.结果发现,颗粒污泥中真细菌明显多于古细菌,但随着厌氧反应器有机负荷的提高,古细菌明显增加,其中产甲烷丝菌也明显增加;真细菌多分布生长在颗粒污泥的外层,而对环境条件敏感的古细菌多分布生长在内层,且随着反应器有机负荷的提高,这种层状分布的特点更为明显.     

AOA-SBR系统运行效能及高效聚磷菌的特性研究

为获得聚磷能力突出且抗逆性强的菌株,进一步扩大生物除磷的应用范围,在实验室条件下完成AOA-SBR反应器的启动及运行,基于Illumina Miseq高通量测序技术对反应器各运行阶段样品中的细菌群落结构进行解析,从稳定运行的SBR反应器中分离得到聚磷菌,分别进行菌株的鉴定及其生长聚磷特性研究.结果表明:①反应器的启动及运行后期,各项出水水质指标均达到GB 18918—2002《城镇污水处理厂污染物排放标准》一级A水平,系统的除磷率稳定在95%以上.②反应器对于除磷微生物的定向富集作用较强,变形菌门中的不动杆菌属为优势菌群.③共分离得到5株高效聚磷菌,暂命名为LXP1~LXP5,经鉴定分别为假单孢菌属（Pseudomonas）、不动杆菌属（Acinetobacter）、红球菌属（Rhodococcus）、大头茶属（Gordonia）及脂肪杆菌属（Pimelobacter）.④LXP1~LXP5都具有典型的生长曲线和较短的生长周期,生长周期范围为24~36 h;各菌株在好氧条件下的吸磷量均在10 mg/L以上,最大可达30 mg/L.研究显示,实验室条件下AOA-SBR反应器的启动及运行可较好地实现对活性污泥中的除磷微生物定向富集的目的,该试验分离得到5株高效聚磷菌并经鉴定分属5种不同的菌属范畴,其中Rhodococcus、Gordonia及Pimelobacter的菌株为近年来鲜有的从活性污泥中筛选得到的具有较好聚磷特性的菌株.      

CANNED工艺细菌种群结构变化的FISH研究

采用电镜观察和荧光原位杂交技术（FISH）,对亚硝化/电化学生物反硝化全自养脱氮（CANNED）工艺在不同游离氨（FA）质量浓度下反应器内细菌形态和种群结构进行了研究. 结果表明:在亚硝化段,ρ（FA）为0.5 mg/L时,氨氧化菌（AOB）和亚硝酸盐氧化菌（NOB）分别占总菌数的0.9%和2.8%;ρ（FA）为12.4～48.6 mg/L时,AOB和NOB分别占33.6%～47.4%和1.0%～2.9%,能够实现短程硝化. 在电化学生物反硝化段,当ρ（FA）为0.5～12.4 mg/L时,脱氮硫杆菌、厌氧氨氧化菌和真细菌分别占总菌数的7.2%～15.3%,7.2%～10.3%和9.1%～14.3%;当ρ（FA）增加到48.6 mg/L时,上述3种细菌所占比例分别增加到总菌数的34.5%,44.2%和60.8%,表明随着ρ（FA）的增加,提高ρ（FA）有利于上述3种菌的生长,与SEM结果一致.      

土壤细菌荧光原位杂交对比染色技术的构建

荧光原位杂交技术(FISH)已经成为研究海洋、湖泊及河流沉积物微生物特征的重要手段,但对土壤的应用尚存在局限性。研究以土壤和堆肥为材料,筛选了FISH对比染色荧光剂,并对其染色条件进行了分析。研究结果表明,1/200稀释SYBR Green(ISGI)可用于FISH的对比染色。其染色时间为1 min,封片试剂为无荧光浸镜油。     

土壤中胡敏酸提取方法的优化

以国际腐殖质协会(IHSS)推荐的胡敏酸提取方法为基础,以去有机质土壤中添加胡敏酸所配制的土壤为研究对象,引入超声作为胡敏酸提取的辅助条件,采用批次试验优化了土壤中胡敏酸的提取方法。结果表明,基于胡敏酸提取回收率和精密度,在室温下获得的优化提取方法为:液土比为8:1、提取次数为3次、Na OH溶液浓度为0.05 mol/L、超声功率为120 W、超声时间为30 min;在此优化条件下,胡敏酸的回收率为94.73%±1.50%,显著大于IHSS推荐方法的回收率64.76%±0.28%,变异系数CV为1.59%、小于10%。相对于IHSS提取法,此优化提取法具有胡敏酸提取回收率高、资源节约、胡敏酸变性小、提取时间短等优点。     

新型移动床膜生物反应器处理PVA废水的实验研究

将移动床生物膜反应器（MBBR）与膜生物反应器（MBR）有机结合,形成一体化式新型移动床膜生物反应器（M—MBBR）。采用M—MBBR对PVA废水的处理效果进行了研究,介绍了反应器的结构,并考察了水力停留时间、COD容积负荷及曝气量等操作条件对处理效果的影响。实验结果表明,在水力停留时间8h,气水比为120：1,COD容积负荷在1．4—2．8kg／（m^3·d）范围内变化时处理效果最佳且出水保持稳定。在此操作条件下,M—MBBR对PVA和COD的去除率可分别达到54％和69％左右。     

固相微萃取-气相色谱法联用测定水中氯苯系化合物

采用顶空固相微萃取与气相色谱联用技术对水中九种氯苯进行测定。优化了SPME的萃取条件,选用65μmPDMS—DVB萃取涂层,在加入1．5gNaCl,温度为20℃的条件下萃取15min,280％解吸4min。该方法的相对标准偏差小于8％,相关系数大于0．9988。将该方法应用于湘江水中氯苯的测定,回收率分别为79．4％-99．9％,证明了访方法对痕量氯苯分析的可行性与可靠性。     

MCMP制剂与生物膜法联合处理垃圾渗滤液的试验研究

采用单因素试验分析了多功能复合微生物制剂MCMP处理垃圾渗滤液的反应条件,结果表明：投加MCMP能促进渗滤液COD、NH3-N、TP的去除,在反应时间72 h,间歇曝气36h,接种量（VMCMP：V水）为1/8000,进水pH值8时处理效果较好,去除率分别达到37.56%、72.74%、51.56%。MCMP技术与生物膜法联合处理垃圾渗滤液的试验表明：同单纯使用MCMP菌处理渗滤液相比,以陶粒为填料的MCMP生物膜系统,对TP的去除效果有明显提高,去除率达到65.23%,对COD和NH3-N去除率影响不显著。     

荧光原位杂交法在活性污泥硝化细菌检测中的应用

采用荧光原位杂交(FISH)法对活性污泥样品中的硝化细菌进行了检测研究。与传统方法相比,FISH法具有快速便捷的特点,可原位检测出活性污泥菌胶团上的硝化细菌的分布情况,结合稀释的方法,可对环境样品中的硝化细菌进行定量分析。此法既可定性,又可对环境中的硝化细菌进行直接计数,为研究硝化细菌类群的空间和数量分布提供有效的检测工具。