抗生素抗性基因在典型行业和市政污水中的污染特征及消减研究进展

抗生素在养殖、制药及医疗卫生行业中的广泛使用导致环境中的抗性细菌(Antibiotic resistance bacteria,ARB)及抗性基因(Antibiotic resistance genes,ARGs)浓度日益增加,甚至已经威胁到人体健康.本文在总结大量文献的基础上,阐述了ARB和ARGs在抗生素典型行业(包括养殖业、制药业和医疗卫生业)和市政污水中的污染特征,重点介绍了污水处理系统(Wastewater treatment plants,WWTPs)不同处理工艺对抗性细菌和抗性基因消长的影响及机制,最后针对污水处理系统中抗性基因的消减提出了新的见解,并对今后研究方向进行了展望.     

甲基对硫磷降解菌DLL-1的发光酶基因标记及在土壤中的变化

采用三亲接合法成功地将携带有发光酶基因的pTR1 0 2转入了甲基对硫磷降解菌Pseudomonassp .DLL -1菌株中。获得的接合子在液体培养、固体培养过程中以及在土壤中其标记质粒非常稳定。标记质粒并没有给受体细胞的生长、降解甲基对硫磷的能力带来严重的影响。因此 ,将标记菌株DLL -1-B用于土壤生态研究是可行的。在土壤中 ,DLL -1 -B的数量在接种后最初 2天下降幅度较小 ,随后下降速度较快 ,但当下降到 1 0 3～ 1 0 4 g- 1时趋于稳定。DLL -1 -B在水中下降速度更快 ,存活时间更短。DLL -1 -B在旱地土壤中的移动性较差 ,大多存在于 0～ 1 0cm土壤中。在水田中 ,DLL -1 -B的移动性较好 ,2周后 ,2 0～ 3 0cm土壤中测得DLL -1 -B为 2× 1 0 2 g- 1。     

石油烃厌氧降解关键基因masD和bamA的实时荧光定量PCR检测方法与应用

masD和bamA是控制石油烃厌氧降解的关键基因,利用实时荧光定量PCR技术检测masD和bamA基因具有简便快速和易操作等优点.但目前所用方法存在扩增效率低,方法灵敏度较差的问题.本文根据引物设计原则,利用Allele ID6软件重新设计了扩增masD和bamA的实时荧光定量PCR引物,将质粒DNA进行8次10倍梯度稀释后构建实时荧光定量PCR标准曲线.优化后的体系（20μL）为：FastStart Essential DNA Green Master 10.0μL,上下游引物各0.4μL,RNase-Free Water 4.2μL,5.0μL DNA模板.利用新设计的引物扩增masD和bamA基因的最适退火温度分别为61℃和57℃.优化后的检测方法扩增效率提高至97.5%和71.2%,比文献报道的方法提高了7.6%—44.5%,具有更高的重复性和灵敏度.利用设计的引物对陕北5个地区石油污染土壤中的masD和bamA基因进行定量检测结果表明,石油污染土壤中普遍存在着控制石油烃厌氧降解的关键基因,所测定的土壤中bamA降解基因的拷贝数远高于masD降解基因.     

芜菁花叶病毒杭州株P1基因的克隆和在大肠杆菌中的表达

通过反转录ＰＣＲ，克隆得到１．２ｋｂ的ＴｕＭＶＨ１的Ｐ１片段，并在大肠杆菌表达载体ｐＧＥＭＥＸ－１中得以表达，表达产物为可融性融合蛋白，Ｍｒ≈６×１０４．     

拟南芥SHI基因在烟草中的表达和矮化、延迟开花的烟草植株的获得

利用聚合酶链式反应(PCR)从拟南芥基因组DNA中克隆了拟南芥SHOTINTERNODS(SHI)基因,并进行了序列测定.以载体pBI121为基本骨架构建了SHI的植物表达载体,并导入根癌农杆菌EHA105.通过农杆菌介导的叶盘法将拟南芥SHI基因转入烟草.PCR和RT-PCR检测证明,拟南芥SHI基因已整合到烟草基因组中并得以表达,获得了矮化、延迟开花的烟草植株.图5参12     

食蚊鱼(Gambusia afinis)cat、gapdh和gst基因的克隆及其在生态毒理学中的应用

根据Ensembl、Genbank登录的鱼类cat、gapdh和gst基因的CDS序列设计普通PCR扩增引物,寻找食蚊鱼的cat、gapdh和gst基因的c DNA片段,并根据定量引物设计要求设计出相应的SYBR Green I荧光定量RT-q PCR引物,建立了食蚊鱼cat、gapdh和gst基因的SYBR Green I荧光定量RT-q PCR方法。该方法在104~108数量级范围内有良好线性关系(R=0.999~1.000);熔解曲线显示扩增产物特异性良好,均为单一峰值;质粒标准品最高浓度与最低浓度的批内试验变异系数与批间试验变异系数均低于2%。利用该方法监测和评价环境污染物对水生生物的影响,选择了水体中常见典型药物污染物——双氯芬酸,研究其对食蚊鱼抗氧化基因表达的影响。结果表明,雌性食蚊鱼暴露在不同浓度双氯芬酸钠(0.005、0.05、0.5和5 mg·L-1)24 h后,其肝脏cat、gapdh和gst的mRNA呈现显著变化,相对于对照组,在低浓度0.005 mg·L-1时,cat与gst mRNA的表达量均有极显著上升(p0.01),而其它浓度均极显著下降(p0.01)。试验表明该方法具有快速、精确、灵敏度高的优点,可为利用该类小型鱼类的原位污染物的生物监测和生态毒理评价提供有力的技术支持。     

5种化学品对丽斑麻蜥和日本鹌鹑的毒性研究

目前,在化学品生态风险评价体系中对爬行动物的毒性效应研究较少。本研究参考鸟类急性经口毒性试验建立了我国本土爬行动物——丽斑麻蜥(Eremias argus)的急性毒性测试方法,来评价化学品对爬行动物和鸟类的毒性效应之间的差异。选择异氰酸酯、1,2-苯并异噻唑-3-酮、2,4-二氯苯酚、苯并噻唑和二苯甲酮5种化学品分别对丽斑麻蜥进行暴露实验,并与鸟类模式物种——日本鹌鹑(Coturnix japonica)的急性毒性结果进行比较。结果发现异氰酸酯和苯并噻唑对丽斑麻蜥7 d的半数致死剂量(7 d-LD50)分别为125 mg·kg~(-1)和500 mg·kg~(-1),而对日本鹌鹑的7 d-LD50值分别为27 mg·kg~(-1)和37 mg·kg~(-1);1,2-苯并异噻唑-3-酮、2,4-二氯苯酚和二苯甲酮对丽斑麻蜥的7 d-LD50值分别为909 mg·kg~(-1)、787 mg·kg~(-1)和528 mg·kg~(-1),而对日本鹌鹑7 d-LD50值均大于剂量上限1 000 mg·kg~(-1)。结果表明,丽斑麻蜥和日本鹌鹑对相同化学品的毒性敏感性是存在差异的,用鸟类来评价化学品对爬行动物的潜在风险可能不够准确,应该重视化学品对爬行动物的毒性效应研究。同时,以本土爬行动物的代表物种丽斑麻蜥作为化学品环境风险评价的模式生物,对保护我国本土物种及其多样性、维持生态平衡具有重要意义。     

双酚A诱导下双齿围沙蚕实时荧光定量P CR内参基因的筛选

为了筛选出在双酚A诱导下双齿围沙蚕(Perinereis aibuhitensis)体壁组织中最适内参基因,以不同浓度双酚A诱导下双齿围沙蚕互补脱氧核糖核酸(cDNA)为模板进行实时荧光定量PCR,利用Ge Norm、Norm Finder和Bestkeeper三个软件对肌动蛋白(beta-actin, Actin)、核糖体蛋白5(ribosomal protein L5, RPL5)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)、微管蛋白(β-tubulin, Tub)、琥珀酸脱氢酶(succinate dehydrogenase complex flavoprotein subunit A, SDHA)和组蛋白(Histone Cluster 1 H_2A Family Member A, HH_2A)这6个备选内参基因的表达量进行分析,筛选出稳定表达的内参基因。结果表明6个内参基因的基因表达量由大到小为ActinGAPDHSDHAHH_2ATubRPL5,Bestkeeper软件分析得到6种内参基因稳定性排名为ActinRPL5SDHATubHH_2AGAPDH,Ge Norm软件分析得出6种内参基因的稳定性排名为SDHARPL5ActinTubHH_2AGAPDH,Normfinder分析的结果为ActinSDHARPL5TubHH_2AGAPDH。综合以上结果确定双酚A诱导下双齿围沙蚕最优内参基因为Actin,不推荐GAPDH作为内参基因使用。推荐同时选取多对内参基因进行实验,可以进一步减少误差。     

滏阳河河流水体中重金属污染特征及其对青海弧菌和斜生栅藻的毒性效应

为调查滏阳河水系的重金属污染状况,研究河流重金属污染对水生生物的毒性,根据河流结构、水文条件、排污口分布并考虑空间分布的均匀性,选取66个采样位点,采集河水及对应的表层沉积物样品,分析了样品中的重金属含量。用斜生栅藻和青海弧菌Q67作为模式生物,根据滏阳河水重金属污染较严重的邯郸近郊2号采样点采集水样的重金属含量配制系列重金属浓度的模拟河水进行重金属污染河水的生态毒性测试。结果表明,在全部66个采样点中,29个采样点河水重金属含量超过国家地表水III类水体重金属含量标准,主要污染元素是Hg、Pb、Cr、Zn。几乎所有采样点河水Mn和Fe含量都大大高于国家集中式生活饮用水地表水源地补充项目规定的标准限值。根据2号采样点河水样品中的重金属含量配成的模拟河水对青海弧菌Q67的EC₅₀值为6.65%,为毒性极强的污染物。模拟河水样品对斜生栅藻的抑制作用较小,在实验的最高浓度下(1000倍河水重金属含量)暴露4 d尚未引起半数藻细胞死亡。随河水重金属浓度上升,斜生栅藻超氧化物歧化酶(SOD)活性总体上呈现先升高后降低的趋势,丙二醛(MDA)含量变化则与此相反,反映河水重金属污染可引起藻细胞的氧化损伤。叶绿素a和b含量则随暴露浓度的提高逐渐降低。在重金属浓度达到2号采样点河水的10%时,斜生栅藻叶绿素a含量已有显著降低,MDA含量显著升高,海河流域重金属污染对生态系统的影响应予以重视。河水发光菌Q67的生长抑制率、斜生栅藻的叶绿素a和MDA含量可以作为评估河流重金属污染生态危害的指标。     

滏阳河河流水体中重金属污染特征及其对青海弧菌和斜生栅藻的毒性效应

为调查滏阳河水系的重金属污染状况,研究河流重金属污染对水生生物的毒性,根据河流结构、水文条件、排污口分布并考虑空间分布的均匀性,选取66个采样位点,采集河水及对应的表层沉积物样品,分析了样品中的重金属含量。用斜生栅藻和青海弧菌Q67作为模式生物,根据滏阳河水重金属污染较严重的邯郸近郊2号采样点采集水样的重金属含量配制系列重金属浓度的模拟河水进行重金属污染河水的生态毒性测试。结果表明,在全部66个采样点中,29个采样点河水重金属含量超过国家地表水III类水体重金属含量标准,主要污染元素是Hg、Pb、Cr、Zn。几乎所有采样点河水Mn和Fe含量都大大高于国家集中式生活饮用水地表水源地补充项目规定的标准限值。根据2号采样点河水样品中的重金属含量配成的模拟河水对青海弧菌Q67的EC_(50)值为6.65%,为毒性极强的污染物。模拟河水样品对斜生栅藻的抑制作用较小,在实验的最高浓度下(1 000倍河水重金属含量)暴露4 d尚未引起半数藻细胞死亡。随河水重金属浓度上升,斜生栅藻超氧化物歧化酶(SOD)活性总体上呈现先升高后降低的趋势,丙二醛(MDA)含量变化则与此相反,反映河水重金属污染可引起藻细胞的氧化损伤。叶绿素a和b含量则随暴露浓度的提高逐渐降低。在重金属浓度达到2号采样点河水的10%时,斜生栅藻叶绿素a含量已有显著降低,MDA含量显著升高,海河流域重金属污染对生态系统的影响应予以重视。河水发光菌Q67的生长抑制率、斜生栅藻的叶绿素a和MDA含量可以作为评估河流重金属污染生态危害的指标。     

南京地区污水厂、自来水厂及长江水域MCR-1和NDM-1携带菌耐药特征

为了研究以多粘菌素耐药基因(MCR-1)和新德里金属β-内酰胺酶-1基因(NDM-1)携带菌为代表的"超级细菌"在地表水中的环境行为,以长江南京段典型水域及邻近城市污水厂和自来水厂为研究对象,考察了MCR-1和NDM-1携带菌的耐药特性及其变化特征。结果发现,污水厂进水和生物处理单元2种细菌耐药能力均处于较高水平,随处理流程呈降低趋势,至消毒出水中不再被检出。长江中MCR-1携带菌耐粘菌素的半抑制浓度(EC50)较高,平均达37.89 mg·L-1,顺水流方向无显著降低。仅在下游朱家山河汇入口和长江大桥附近滨江公园检出较高耐药水平的NDM-1携带菌。2种细菌耐药水平受水体污染程度和人类活动影响较明显。自来水厂MCR-1携带菌数目较少,但其EC50平均可达32.75 mg·L~(-1),常规处理单元中未检出NDM-1携带菌。水处理工艺显著降低了细菌耐药水平,但排泥水中2种细菌均检出,且耐药水平相比进水显著提高。本研究可为评价水介质中超级抗性基因及其携带菌的环境风险提供参考。     

南方典型水源地及水产养殖区抗生素的复合污染特征及生态风险

抗生素作为生长促进剂和疾病预防控制药物在水产养殖领域得到广泛应用,目前在许多环境水体中检测到不同类型的抗生素。环境中抗生素的残留问题也是目前环境研究的热点问题之一。本研究选择南方某市8个水源地和5个典型水产养殖区作为研究对象,采用固相萃取、高效液相色谱串联三重四级杆质谱联用仪方法,调查了32种常用抗生素在水体中的含量水平和空间分布特征,揭示了抗生素的来源,并对其生态风险进行了评价。水源地共检出12种抗生素,浓度范围为0.12～44.6 ng·L~(-1),以磺胺甲噁唑含量最高;水产养殖区检出14种抗生素,浓度范围为0.95～716 ng·L~(-1),以氯四环素检出浓度最高。整体上水产养殖区抗生素的浓度高于水源地。抗生素浓度与环境因子的冗余分析表明,水产养殖和生活污水排放是水体中抗生素的主要来源。对检出的13种抗生素进行生态风险评价,单一抗生素而言,环丙沙星、氧氟沙星、磺胺嘧啶、氯四环素和脱水红霉素的风险商值大于0.01而小于0.1,表现为低风险。总抗生素风险商值加和在大部分水源地大于0.01而小于0.1,表现为低风险;总抗生素风险商值加和在2个水产养殖区大于0.1,表现为中等风险,水产养殖区抗生素的长期生态风险应该引起关注。     

敌草快对藻类和溞类的急性毒性及其水中含量测定

敌草快是一种非选择性、广谱的联吡啶类触杀性除草剂,主要通过干扰植物细胞膜、破坏光合作用而快速发挥效果。为探究敌草快对水生生物的毒性,测定了该化合物对羊角月芽藻和大型溞的急性毒性,并建立了高效液相色谱法测定水中敌草快含量的方法。结果表明:检测方法在1.00×10-2~3.00×10-2mg a.i.·L-1范围内的线性相关系数为0.99995,添加回收率在90.3%~109%之间,相对标准偏差(RSD)为1.10%~10.3%,保留时间在7.2 min左右。按实测浓度和理论浓度分别计算敌草快对羊角月芽藻的72 h的半数效应浓度EyC50(72 h-EyC50),分别为3.16×10-2mg a.i.·L-1和3.32×10-2mg a.i.·L-1,均为高毒;对大型溞48 h的半数效应浓度EC50(48 h-EC50)分别为1.18×10-2mg a.i.·L-1和1.33×10-2mg a.i.·L-1,均为剧毒。     

2种烷基多环芳烃对仿刺参CYP450和p53基因表达的影响研究

海洋环境中多环芳烃类(PAHs)主要来源于海洋溢油事故以及沿海石油化工企业的废水排放,国内外大量研究发现海洋中的多环芳烃对海洋生物造成了潜在的生态风险。为了揭示不同浓度多环芳烃类污染物对海参的生态毒理效应,将仿刺参(Apostichopus japonicus)分别暴露于不同浓度的2种烷基多环芳烃3-甲基菲(5、10、100μg·L~(-1))和2-甲基蒽(5、10、50μg·L~(-1))中,检测暴露3 d、7 d和14 d后,3-甲基菲和2-甲基蒽胁迫下仿刺参CYP450和p53基因的相对表达量。结果表明,3-甲基菲和2-甲基蒽胁迫下,仿刺参CYP450和p53基因的表达均对毒物产生了不同程度的响应。与对照组相比,3-甲基菲各处理组对仿刺参CYP450和p53基因的表达均产生显著的抑制作用(P0.05); 2-甲基蒽各处理组对仿刺参CYP450和p53基因的表达影响作用不同,暴露7 d后,2-甲基蒽各处理组对仿刺参CYP450基因的表达表现出抑制作用,对p53基因的表达表现出诱导作用。相同浓度与时间胁迫下,2-甲基蒽对仿刺参CYP450和p53基因表达的影响比3-甲基菲的影响大。上述研究结果表明,3-甲基菲和2-甲基蒽均可不同程度影响仿刺参CYP450和p53基因的表达,且与3-甲基菲相比,2-甲基蒽对仿刺参CYP450和p53基因表达的影响较明显。上述结果为多环芳烃类污染物对仿刺参的生物毒性评价提供了基础数据。     

微囊藻毒素对青菜生长的影响及其在生物体内的累积

蓝藻藻泥好氧堆肥腐熟后还田是其打捞后资源化利用的主要途径。堆肥后仍有一定数量的微囊藻毒素(microcystin,MC)残留,大量还田是否会对作物生长和人类健康产生安全风险尚不明确。将青菜(Brassica chinensis)暴露于不同MC含量的石英砂和菜地土壤,观测植株生长状况及体内MC含量,并观测不同含量的MC在菜地土壤中的降解速率。结果发现:砂培实验结束时,青菜成株的株高和生物量随着MC暴露浓度的增加而显著降低,而植株地上部MC的含量则显著增加。在MC浓度为0.386mg·kg-1的处理中,青菜地上部MC-LR(L为亮氨酸)和MC-RR(R为精氨酸)的浓度分别达到27.45μg·kg-1(鲜质量)和1.35μg·kg-1(鲜质量)。MC-LR和MC-RR在青菜地上部的富集系数都随着砂培基质中MC浓度的增加而显著降低,且前者显著高于后者。土培青菜生长过程中吸收和累积的MC数量显著小于砂培实验。MC在菜地土壤中降解56d后,MC-LR和MC-RR的降解率均达90%以上。按普通有机肥的一般用量(2.5kg·m-2)施用充分腐熟的蓝藻堆肥成品种植青菜,食用后每人每天摄入的MC含量远低于WHO制定的饮用水中MC的指导值。研究为评估现行蓝藻堆肥工艺中残留的MC对作物生长和生物安全风险提供了科学依据。     

不同硬度条件下Cd~(2+)和Cu~(2+)对稀有鮈鲫的急性毒性

为研究水体硬度对稀有鮈鲫Cd~(2+)和Cu~(2+)毒性效应的影响,开展了96 h急性毒性试验。试验结果发现,当水体硬度(以CaCO_3计,下同)为50 mg·L~(-1)、250 mg·L~(-1)、450 mg·L~(-1)时,Cd~(2+)对稀有鮈鲫的96 h半数致死浓度(96 h-LC50)分别为4.30 mg·L-1、12.06 mg·L~(-1)、19.99 mg·L~(-1),对应的安全浓度(SC)依次为0.430 mg·L~(-1)、1.206 mg·L~(-1)、1.999 mg·L~(-1);Cu~(2+)对稀有鮈鲫的96h-LC50分别为0.046 mg·L-1、0.148 mg·L~(-1)、0.228 mg·L~(-1),对应的SC依次为0.0046 mg·L~(-1)、0.0148 mg·L~(-1)、0.0228 mg·L~(-1)。计算得到Cd~(2+)对稀有鮈鲫急性毒性与水体硬度的拟合方程为ln 96 h-LC50=0.687 ln H~(-1).243(r=0.998);Cu~(2+)对稀有鮈鲫急性毒性与水体硬度的拟合方程为ln 96 h-LC50=0.727 ln H-5.923(r=0.999),Cd~(2+)和Cu~(2+)对稀有鮈鲫的硬度斜率分别为0.687和0.727。这些结果表明,水体硬度可有效降低Cd~(2+)和Cu~(2+)对稀有鮈鲫的急性毒性,且稀有鮈鲫的硬度斜率与其他物种差异较大。在评估不同硬度水体下Cd~(2+)和Cu~(2+)的生物毒性及其生态风险时,应根据测试物种特异的硬度斜率而定。