不同碳源条件下草菇内切型纤维素酶基因(egl)转录表达的分析

利用Northern blot方法分析了不同碳源条件下草菇內切型纤维素酶基因(eg1)的表达.结果发现,在含有纤维素的液体培养基中生长10 d,eg1在草菇菌丝中有高效表达;纤维二糖、α-乳糖、β-乳糖,也能诱导eg1的表达,但和纤维素相比,eg1的表达量相对较低,并且它们的诱导效应在加入这类糖12 h后迅速减弱;槐糖和龙胆二糖的诱导作用非常弱.在天然稻草为基质的固体栽培料生长时,草菇eg1的表达和草菇菌丝生长与出菇相对应,在菌丝生长期(d 8)可见eg1的表达,d 12时菌丝已长满,表达减弱,在出菇及菇体的分化及增大期,eg1的表达量逐渐增强,在成熟期达到最高水平;表明在草菇菇体发育中需要更多碳源及能源的补充,eg1在这方面起着非常重要的作用. 图4 参14     

草菇6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶基因可变剪接体克隆与表达分析

6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶(6PGDH)是磷酸戊糖途径的限速酶,影响着细胞生命活动所需要的NADPH的产生.为揭示草菇菌丝生长的分子基础,通过克隆草菇6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶编码基因(6gpdh)的可变剪接体,测序后进行生物信息学分析,利用表达谱和qPCR测定了它们在同核体和异核体菌株的表达量.结果显示,草菇6gpdh序列全长2 315bp,含10个内含子,第6个内含子存在内含子保留的可变剪接.在同核体和异核体菌株中,内含子保留的可变剪接体表达量低,且菌株间没显著差异,而内含子被剪接的剪接体表达量高,且异核体菌株高于同核体菌株.两种可变剪接体具有6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶保守结构域和相似的三维结构.因此,初步分析两个可变剪切体是同工酶,内含子保留是组成型表达,表达量与菌丝生长快慢无关,内含子剪接是主效剪接方式,菌丝生长快的菌株表达量高,生长慢的菌株表达量低.图6表1参26     

苯系物联合暴露仿刺参管足转录组差异表达基因分析

为了分析苯系物(BTEXs)联合暴露后仿刺参(Apostichopus japonicus)管足转录组差异表达基因,采用Illumina Hi SeqTM2000测序技术,对1.0 mg·L~(-1)苯系物(B)联合暴露12 h后和对照组(C)的仿刺参管足组织分别进行转录组测序。经Trinity软件进行de novo组装,获得了145 675条unigenes。利用公共数据库进行同源比对,共注释了35 330条unigenes。对比分析苯系物联合暴露组和对照组的转录组测序结果,获得了2 418个差异表达基因(DEGs)(|Log2Fold changes|≥1且FDR≤0.001),其中,上调表达和下调表达基因分别为1 049和1 369个。GOseq分析结果显示,158个DEGs显著富集在149个GO terms中,包括103个生物学过程、17个细胞组分和29个分子功能(P0.05);KEGG代谢通路分析结果显示994个差异基因映射到268条代谢通路,这些差异表达基因参与的生理过程与其他生物的同源基因参与的信号传导、癌症、外源性化合物的生物降解代谢等过程相类似。上述结果为在转录组水平筛选苯系物的生物标志物,解析苯系物对仿刺参毒性作用的分子机制提供了科学参考。     

奥奈达希瓦氏菌(Shewanella oneidensis) MR-1对氟西汀降解过程的转录组及功能基因分析

该文研究了厌氧条件下奥奈达希瓦氏菌(Shewanella oneidensis)MR-1对氟西汀的降解性能,并从转录组学分析遗传分子代谢机制。结果表明,Shewanella oneidensis MR-1在厌氧条件下可有效降解体系中93.12%的氟西汀,降解速率达0.94 mg·L^-1·h^-1。采用Illumina高通量测序平台对降解氟西汀后的细菌与对照组细菌进行测序,通过基因本体数据库(GO)和京都基因与基因组百科全书数据库(KEGG)富集分析,结合筛选的高表达高上调的差异表达基因,得到了耐受和降解氟西汀的功能基因,其中包膜应激反应膜蛋白基因、ABC转运蛋白基因、噬菌体休克蛋白PspA基因、氧化应激防御蛋白基因等在Shewanella oneidensis MR-1对环境的耐受中起重要作用;细胞色素C基因、硝基还原酶NfsB基因、乳酸利用蛋白基因等在氟西汀的降解转化中起关键作用。该研究从转录组水平分析了氟西汀的降解机制,可为Shewanella oneidensis MR-1在环境修复中的应用提供参考依据。     

青稞β—1，3—葡聚糖酶Ⅱ基因启动子的克隆分析及表达载体的构建

根据本实验室克隆并公布的藏青稞β—1，3—葡聚糖酶Ⅱ(BGH Ⅱ)基因序列，以藏青稞QB09基因组DNA为模板，构建DNA步移文库，并通过步移技术克隆出BGH Ⅱ起始密码子上游调控序列BGHP．鉴定和分析表明，BGHP具备大多数高等植物启动子的保守元件，预测它对BGHⅡ基因的表达具有一定的作用．为鉴定BGHⅡ基因的基本启动子元件，将基因5′侧翼序列做缺失片段分析，利用PCR方法从BGHP中得到3个不同大小两端带有Hind Ⅲ、BamH I酶切位点的片段BGHP1、BGHP2和BGHP3，定向插人载体pMGFP4(pBI221改建，报告基因为GFP)中，取代原有的CaMV35S启动子，构建了由驱动报告基因GFP的植物表达载体BGHPVl、BGHPV2和BGHPV3，用于大麦的遗传转化，为进一步研究其功能奠定了基础．图5表1参15     

豆豉溶栓酶基因在毕赤酵母中的表达及其产物的纯化

将含有和不含前肽的豆豉溶栓酶编码序列在毕赤酵母中分别进行表达研究,发现在含有前肽的豆豉溶栓酶基因转化的毕赤酵母工程菌用甲醇诱导时,其培养液中可检测到较强的溶栓酶活性;而在不含前肽的豆豉溶栓酶基因转化的毕赤酵母菌用甲醇诱导时,培养液中未检测到溶栓酶活性.对毕赤酵母表达和分泌的豆豉溶栓酶进行了分离纯化,并对其纯化产物进行溶栓酶活性、SDS-PAGE电泳、抑制剂作用及免疫印迹分析.结果表明,分泌到培养液中的豆豉溶栓酶已经过剪切加工,其前肽已被切除,重组与天然的豆豉溶栓酶具有相同的溶栓酶活性,其所测定的各理化指标均一致.本研究实现了豆豉溶栓酶在毕赤酵母菌中成功表达,并首次直接证明了前肽对豆豉溶栓酶在毕赤酵母中分泌表达是必须的.图3表1参20     

芜菁花叶病毒杭州株P1基因的克隆和在大肠杆菌中的表达

通过反转录ＰＣＲ，克隆得到１．２ｋｂ的ＴｕＭＶＨ１的Ｐ１片段，并在大肠杆菌表达载体ｐＧＥＭＥＸ－１中得以表达，表达产物为可融性融合蛋白，Ｍｒ≈６×１０４．     

地衣芽孢杆菌2709和 6816碱性蛋白酶基因在大肠杆菌中的克隆、表达及序列分析

用PCR方法从地衣芽孢杆菌 2 70 9和 6 816中扩增了碱性蛋白酶基因 (apr1和apr2 ) ,扩增的DNA片段插入到大肠杆菌载体 pET -2 8a中 ,构建成重组分泌型表达载体pAPR1、pAPR2 .pAPR1、pAPR2中碱性蛋白酶基因在大肠杆菌宿主JM 10 9(DE3)中得到表达 .SDS -PAGE分析显示融合表达产物的分子量均为 30 .5× 10 3 ,同核酸序列测定所推导的值相符 .表达产物分别占细胞总蛋白的 8.0 %和 7.5 % .2 70 9重组菌所得酶活为 12 10u/mL ,6 816重组菌所得酶活为 1175u/mL .研究发现 ,重组的碱性蛋白酶在进入大肠杆菌周质空间时可能存在前肽自动脱落的现象 .同时 ,对地衣芽孢杆菌 2 70 9碱性蛋白酶基因序列进行了测定和比较分析 ,发现与地衣芽孢杆菌 6 816碱性蛋白酶基因的同源性为 98% .图 5参 11