微囊藻毒素导致鲫鱼淋巴细胞凋亡的研究

采用离体细胞培养诱导方法,以鲫鱼(Garassiusauratus)为实验材料,研究了两种微囊藻毒素microcystinLR(MCLR)和microcystinRR(MCRR)在低浓度下(1nmol·L-1,5nmol·L-1和10nmol·L-1)对鲫鱼淋巴细胞的毒性效应.结果表明,鲫鱼淋巴细胞分别经两种微囊藻毒素体外诱导2h后,出现细胞核固缩的典型细胞凋亡形态学特征;琼脂糖凝胶电泳检测到明显的细胞凋亡的生物化学特征梯状DNA(DNAladder);并且两种藻毒素诱导的细胞凋亡呈时间和剂量效应关系.该研究表明微囊藻毒素可导致鱼类淋巴细胞产生凋亡,因而可能影响鱼类免疫功能.     

白鲢罗非鱼对微囊藻毒素急性、亚急性毒性响应

为了探究不同控藻鱼类对产毒微囊藻的适应机制,为生物操纵的鱼种选择提供依据,研究了白鲢和罗非鱼对微囊藻毒素（MC）的生物富集、降解,及两种鱼对毒素的抗性、解毒机制的差异性.结果发现：在喂食微囊藻实验中,白鲢、罗非鱼对MC日摄入量达到10mg/kg,2种鱼均对MC有较强抗性.微囊藻经鱼摄入后,MC总含量在白鲢、罗非鱼粪便中分别下降到71.5%、6.0%,罗非鱼对MC降解能力远高于白鲢.白鲢和罗非鱼的肝系数分别从（1.19±0.21）%、（2.24±0.19）%下降到（0.79±0.06）%、（1.72±0.07）%,均表现出显著差异性下降（P<0.05）.微囊藻毒素在白鲢、罗非鱼肌肉中积累量分别为（1.57±0.31）μg/kg、（10.81±6.52）μg/kg （鲜重）、肝脏中积累量分别为（4.28±1.64）mg/kg、（2.48±0.15）mg/kg （鲜重）.MC在白鲢、罗非鱼肌肉、肝脏中的积累量均存在显著差异性（P<0.05）.罗非鱼肌肉中毒素含量是白鲢的6.9倍.在微囊藻毒素LR （MC-LR）对白鲢和罗非鱼的急性毒性效应实验中,MC-LR对白鲢、罗非鱼的LD₅₀为270和790μg/kg,罗非鱼对毒素有更强耐受性.喂食毒藻和i.p.注射MC均导致白鲢和罗非鱼肝细胞内脂滴大量出现.2种鱼在MC-LR注射后,谷胱甘肽（GSH）含量均表现出6h内明显下降.6h后两种鱼GSH含量均逐步回升,二者差异显著（p<0.05）.实验结果表明,罗非鱼对MC降解能力远高于白鲢.白鲢主要摄食群体微囊藻的群体胶鞘和附着细菌,胞内微囊藻毒素释放量小,白鲢这种摄食机制导致它能以产毒微囊藻为食而受到较轻危害.罗非鱼体内消化酶对微囊藻和MC具较强的消化降解能力;GSH含量及相关酶活性水平高,对体内毒素清除效率高.从食用安全性角度出发,与罗非鱼相比,白鲢是更适合用于控制蓝藻水华的鱼种,可广泛应用于蓝藻水华控制中.     

微囊藻毒素合成机理的研究进展

对于MC的研究目前主要集中在毒理学,生态影响,及监测、检测技术等研究领域之中。由于MC产毒藻种类繁多,再加上多达60几种的异构体的存在,每一MC产毒藻类体内其mcy基因并不完全一致,所以对于MC的产毒合成机理研究非常困难。但近几年对MC的产毒合成机理已经有了突破：三种最主要的MC产毒藻的MC合成过程已经被阐明。     

微囊藻毒素导致鲫鱼淋巴细胞凋亡的研究

采用离体细胞培养诱导方法,以鲫鱼(Garassius auratus)为实验材料,研究了两种微囊藻毒素microcystm-LR(MC-LR)和microcystin-RR(MCRR)在低浓度下(1nmol·L-1,5 nmol·L-1和10 nmol·L-1)对鲫鱼淋巴细胞的毒性效应.结果表明,鲫鱼淋巴细胞分别经两种微囊藻毒素体外诱导2h后,出现细胞核固缩的典型细胞凋亡形态学特征;琼脂糖凝胶电泳检测到明显的细胞凋亡的生物化学特征梯状DNA(DNA ladder);并且两种藻毒素诱导的细胞凋亡呈时间和剂量效应关系.该研究表明微囊藻毒素可导致鱼类淋巴细胞产生凋亡,因而可能影响鱼类免疫功能.     

水源水中微囊藻毒素的遗传毒性与健康风险评价

应用美国EPA健康风险评价模型对浙江省101个饮用水源地微囊藻毒素(MC)的健康风险度进行评价,提示水源水中微囊藻毒素-LR(MC-LR)具有较高的非致癌风险.采集MC污染相对严重的A、B 2饮用水源,一部分利用树脂对其中的MC进行浓集,另一部分加入稀释的纯毒素MC-LR模拟水源水中MC释放的情况,同时制备相同浓度的纯毒素序列,利用Ames试验检测藻毒素浓集物、水样中藻毒素和纯毒素对细菌的致突变性,彗星试验检测人外周血淋巴细胞可能产生的DNA损伤,微核试验检测鲤鱼红细胞微核的诱发效应.结果表明,与阴性对照组相比,藻毒素浓集物、纯毒素和藻毒素稀释水样均可引起人外周血淋巴细胞DNA的不同程度损伤(P <0.01),损伤随着染毒剂量的增加而加重,高剂量浓集物、藻毒素稀释水样A和纯毒素可诱导鲤鱼红细胞微核率上升,在本实验条件下尚未观察到藻毒素浓集物、藻毒素稀释水样及纯毒素在Ames试验中具有显著的致突变作用.利用树脂浓集水源水中MC和向水源水中加入稀释的MC-LR模拟MC释放2种方法切实可行,饮用水源水中MC可诱导鲤鱼红细胞微核率上升和淋巴细胞DNA损伤,具有遗传毒性,可能对人体健康产生的远期危害.     

微囊藻毒素在细长聚球藻中的积累及其毒性效应

用 100μg/L 的微囊藻毒素(MC-RR)处理细长聚球藻,研究了 MC-RR 在藻细胞中的积累及其对细长聚球藻的生长和抗氧化系统的影响.结果表明,MC-RR 能在细长聚球藻中迅速积累,而细长聚球藻具有较强的降解 MC-RR 的能力,MC-RR 对细长聚球藻的生长具有显著的抑制作用;MC-RR 处理后,活性氧(ROS)和膜脂过氧化产物丙二醛(MDA)含量明显升高,还原型谷胱甘肽(GSH)含量和谷胱甘肽 S-转移酶(GST)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)活性则有一个先降后升的变化.以上结果说明,细长聚球藻细胞在 MC-RR 处理下,膜脂过氧化加剧,受到氧化胁迫;GSH、GST、GPX 在清除活性氧,抵抗 MC-RR 的毒性伤害中发挥着关键的作用.     

藻毒素复合污染对鱼体的免疫毒性研究

针对水体富营养化问题,通过单一暴露和联合暴露方式研究两种MCs四种暴露剂量（0．1,1,10,100μg／L）下对鱼体的免疫毒效应。结果发现,不同剂量MCLR和MCRR单一暴露都能使鲫鱼淋巴细胞发生死亡,呈现明显的剂量效应和时间效应关系。且MCLR对鱼体的毒性相对McRR要更显著;MCLR和McRR复合暴露对鱼体淋巴细胞的毒性效应表现为协同作用,且随着毒素浓度的增加,其毒性效应差异显著性也随之升高,故而鱼体的免疫系统造成重大的影响,因此应当加强控制藻毒素在水体中的复合污染。     

巢湖和太湖春季微囊藻毒素动态差异及与环境因子的关系

为探究春季巢湖和太湖水体中胞内微囊藻毒素(IMCs)动态变化时空差异及其关键影响因子,于2019年3—5月对两湖不同湖区进行采样分析。结果表明:春季巢湖和太湖的IMCs呈现明显的时空分布特征,IMCs浓度逐月增加,在富营养化水平高的湖区明显高于富营养水平低的湖区;两湖IMCs的异构体均以IMC-LR为主,占比分别为65.10%和58.10%;3—5月两湖IMCs浓度差异明显,巢湖月均IMCs浓度(0.077、0.238、0.632 μg/L)明显高于太湖(0.021、0.031、0.166 μg/L),单位生物量IMCs及其异构体LR的毒性(IMCs/Chla和IMC-LR/Chla)也明显高于太湖。相关性分析表明,总氮(TN)、总磷(TP)浓度和TN/TP是影响IMCs浓度和单位生物量IMCs毒性的关键环境因子,同时产毒藻的丰度和产毒能力也可能是造成此差异的重要原因。     

Caspase-3在微囊藻毒素诱导的细胞凋亡中的作用

在已证实微囊藻毒素LR(MCLR)可以诱导大鼠肾细胞凋亡的基础上,采用荧光染料FAM标记的特异性的caspase-3的抑制剂来检测活细胞中caspase-3的酶活性,探讨caspase-3在MCLR诱导的细胞凋亡中所起的作用.结果表明,MCLR可以诱导caspase-3活性的增强.因此推测caspase-3在MCLR诱导的细胞凋亡中可能起重要作用.     

藻毒素对鱼类肝脏的毒理学效应

以鱼类肝脏为靶器官,研究了藻毒素对鱼类的毒性影响.结果表明,藻毒素在注射和口服两种不同的染毒方式下,均可引起受试鱼类发生急性中毒死亡.对中毒鱼类进行解剖分析发现,受试鱼类的肝/体重比高于对照组.说明无论哪种给药方式,藻毒素都会迅速地、专一地作用于鱼类肝脏,引起鱼类肝脏充血红肿,出现血斑.通过对鱼类肝脏组织碱性磷酸酶(ALP)同功酶谱的分析,可以发现在两种不同染毒条件下藻毒素各剂量组的ALP同功酶谱与对照组相同,均有ALP₁1～ALP₅5条带,只是高剂量组较低剂量组ALP₁～ALP₃ 3条带的着色深,并可使ALP同功酶各组分的相对活性上升.试验结果显示,藻毒素具有极高的细胞选择性和专一生物活性,其在生物机体内所引发的许多细胞学变化主要是对生物体肝脏酶系统的破坏所致,必须引起人们的重视.     

微囊藻毒素的提取和提纯研究

对采自云南滇池水华蓝藻细胞中的微囊藻毒素 (Microcystins,MCs)的提取与提纯方法进行了研究 .结果表明 ,在藻细胞干重浓度为 2 0g·L-1下 ,与不同甲醇浓度提取液相比 ,4 0 %甲醇溶液可以最有效地从藻细胞中提取出MC RR和MC LR .将MCs提取液过Waters固相萃取小柱后 ,用 70 %甲醇溶液洗脱吸附于柱上的MCs ,可以分别获得 7 3%和 3 5 %纯度的MC RR和MC LR .通过观察洗脱液的颜色变化 ,收集蓝绿色和橘黄色后面流出的基本无色的洗脱液 ,可以获得纯度为 2 8 6 %和12 9%的MC RR和MC LR .     

鞘氨醇单胞菌USTB-05对微囊藻毒素的生物降解

研究了云南滇池水华蓝藻细胞中微囊藻毒素(MCs)的分析和鞘氨醇单胞菌USTB-05在细胞水平和酶水平下对MC-YR、RR和LR的生物降解.结果表明,云南滇池水华蓝藻细胞中MC-YR、RR和LR的含量分别为0.16, 0.96, 0.47mg/g.在初始浓度分别为19.5mg/L MC-YR、79.5mg/L MC-RR和43.6mg/L MC-LR下,鞘氨醇单胞菌USTB-05在2d内可将上述3种MCs全部降解,鞘氨醇单胞菌USTB-05粗酶液可以以更快的速率对MC-YR、MC-RR和MC-LR进行高效酶催化降解,在10h内可以将初始浓度分别为14.8mg/L MC-YR、28.4mg/L MC-RR和19.5mg/L MC-LR全部降解.同时发现了MC-YR降解过程中的2个中间和1个最终代谢产物.     

活体及离体条件下微囊藻毒素对鱼蛋白磷酸酶的抑制作用

用鱼组织匀浆液或纯化的酶作为酶源,研究了离体和活体条件下天然有毒物微囊藻毒素对蛋白磷酸酶的抑制作用。结果表明,3种微囊藻毒素LR、YR和RR都对蛋白磷酸酶有极强的抑制作用,毒素浓度对酶相对活力作图呈典型的Ｓ型曲线。在活体致毒时,微囊藻毒素ＬＲ可在极短时间里完全抑制鱼肝脏的蛋白磷酸酶活性。研究结果还证明,离体条件下,微囊藻毒素对鱼蛋白磷酸酶的作用模式和程度与哺乳动物中的一样,活体致毒时,微囊藻毒素对鱼蛋白磷酸酶有专一性的抑制作用。     

有毒蓝藻及藻毒素生物降解的初步研究

采用序批式生物膜反应器,对有毒藻类viridis及藻毒素RR、YR和LR进行了生物降解试验研究。结果表明,好氧生物处理对供试有毒蓝藻及其藻毒素的降解远比缺氧生物处理工艺有效。同时,显微镜观察结果表明,好氧条件下,草履虫对有毒藻类和藻毒素降解起重要作用。研究成果提供了一种有效的富营养化水的生物处理方法,也有助于进一步阐明其处理机理。     

生物质碳对土壤中微囊藻毒素生物有效性的影响

通过向土壤中添加水稻秸秆生物质碳（RSB）、玉米秸秆生物质碳（MSB）和鸡粪生物炭（CMB）来减少微囊藻毒素-LR（MC-LR）在生菜中的富集.结果表明,RSB、MSB和CMB在添加量为2%时,生菜叶片中MC-LR含量较空白分别降低了58.0%、49.5%和70.4%,使得每日估计摄入量降低到WHO的每日允许摄入量限值以下.CMB显著降低了土壤中MC-LR的总含量,而其他处理则无显著影响.3种生物质碳均显著降低了有效态MC-LR含量,且生菜根系和叶片中MC-LR的含量与土壤MC-LR有效态含量均呈显著正相关关系.所有添加生物质碳处理均对生菜生长无负面影响.     

农田土壤中微囊藻毒素污染特征及风险评价

蓝藻水华释放的微囊藻毒素(MCs)通过灌溉、堆肥沤田等途径进入农田土壤造成污染.采用固相萃取-高效液相色谱串联质谱方法(HPLC-MS/MS)研究了滇池周边35个代表性农田土壤样品中3种典型微囊藻毒素(MC-LR、MC-RR、MC-YR)的含量、分布特征及风险水平.结果表明,MCs检出率为85.7%,总含量为n.d.~7.8μg/kg,平均含量为1.6 μg/kg,其中MC-RR检出率(82.9%)和含量(n.d.~5.3μg/kg)最高. 3种MCs的健康风险和生态风险均在可接受范围内,健康风险以MC-YR最大,生态风险以MC-LR最大.儿童以口腔暴露MCs为主,成人以皮肤暴露MCs为主,儿童暴露MCs的健康风险高于成人.     

生物质碳对土壤中微囊藻毒素生物有效性的影响

通过向土壤中添加水稻秸秆生物质碳（RSB）、玉米秸秆生物质碳（MSB）和鸡粪生物炭（CMB）来减少微囊藻毒素-LR（MC-LR）在生菜中的富集.结果表明,RSB、MSB和CMB在添加量为2%时,生菜叶片中MC-LR含量较空白分别降低了58.0%、49.5%和70.4%,使得每日估计摄入量降低到WHO的每日允许摄入量限值以下.CMB显著降低了土壤中MC-LR的总含量,而其他处理则无显著影响.3种生物质碳均显著降低了有效态MC-LR含量,且生菜根系和叶片中MC-LR的含量与土壤MC-LR有效态含量均呈显著正相关关系.所有添加生物质碳处理均对生菜生长无负面影响.