四川地区结瘤大豆根际土壤中紫云英、苜蓿和三叶草根瘤菌的多样性分析

为了解四川地区结瘤大豆根际土壤是否存在与紫云英、苜蓿和三叶草共生结瘤的根瘤菌及其多样性,从四川盆地采集不同种植模式下结瘤大豆根际土壤样品31份,利用紫云英、苜蓿和三叶草进行盆栽捕获试验以获得共生根瘤,从根瘤中分离纯化出根瘤菌,对其进行表型和分子鉴定;并将根瘤菌回接到紫云英、苜蓿、三叶草和大豆根际以检测根瘤菌的寄主范围.在捕获实验中,苜蓿和三叶草分别在6个土壤样品中共生结瘤,而紫云英只在2个土样中共生结瘤,并从共生根瘤中分离出14株根瘤菌;16S r DNA基因序列的相似性分析表明这14株根瘤菌均属于根瘤菌属(Rhizobium),且16S r DNA基因的系统发育树揭示它们分属于根瘤菌属的不同种;这14株根瘤菌在回接实验中都只能让捕获豆科植物结瘤,而不能让其他3种豆科植物结瘤.本研究结果表明,四川地区结瘤大豆根际土壤中的紫云英根瘤菌(Rhizobium astragali)、苜蓿根瘤菌(R.meliloti)和三叶草根瘤菌(R.leguminosarum var.trifolii)资源较少,其与大豆根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum)分属于不同的属,且根瘤菌的回接实验进一步证明了根瘤菌的寄主专一性.     

用celB基因检测慢生花生根瘤菌竞争性的可行性

采用大肠杆菌和根瘤菌接合的方法，将celB标记基因分别导入了两株慢生型花生根瘤菌Spr3-5和Spr4-5中，对出发菌株和标记菌株的代时测定结果表明，二者之间没有显著差异．在标记菌株与出发菌株等量接种的前提下，比较了二者的竞争结瘤能力；结果显示，标记菌株形成的根瘤（蓝瘤）的占瘤率与50％相比，差异不显著，为了研究标记菌株与出发菌株的固氮有效性，测定了标记菌株与出发菌株各自共生植株的干重、全氮和叶绿素含量；结果表明，标记菌株与出发菌株的这3项指标之间没有显著差异．说明利用celB基因研究慢生花生根瘤菌的竞争结瘤能力是可行的，表5参7     

从水稻种子表面分离的紫云英根瘤菌与不同水稻品种亲合性的研究

采用紫云英琼脂管结瘤试验，在10个供试的不同水稻品种中，仅从“汕优63”和“珍A一代”2个品种的种子表面各分离筛选到在紫云英上结瘤较早且较多的1个菌株，分别命名为SY63－4和SA1D－3。采用无菌盆栽试验分别将这2个菌株接种于4个不同水稻品种“汕优63”、“珍A一代”、“马协63”及“博湛优19”，发现菌株ZA1D－3对4种水稻均表现出显著的促生作用，SY63－4仅对“汕优63”和“珍A一代”表现出明显的促生作用。利用MPN法检测不同水稻品种根内外根瘤菌ZA1D－3和SY63－4的数量，发现ZA1D－3和SY63－4在4种水稻根部的定殖数量也不相同。SY63－4在“汕优63”根部定殖的数量log(ncfumFW^-1/g^-1)为5．20，比在其余3种水稻根部高出2个数量级；ZA1D－3在“珍A一代”根部定殖的最大数量log(ncfumFW^-1/g^-1)为4．54，比在其余3种水稻根部高出1个数量级。这说明SY63－4与“汕优63”，ZA1D－3与“珍A一代”间存在着一定的亲和性。图1表2参12     

慢生花生根瘤菌的遗传多样性研究

用ＲＥＰ１Ｒ１和ＲＥＰ２１ＤＮＡ为引物,对２２株四川土著慢生花生根瘤菌染色体ＤＮＡ的基因外回文重复序列（ＲｅｐｅｔｉｔｉｖｅＥｘｔｒｏｇｅｎｉｃｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃｓｅｑｕｅｎｃｅＲＥＰ）进行了ＰＣＲ扩增和凝胶电泳,并对电泳结果的指纹图型进行了相似性聚类分析．结果表明了四川土著慢生花生根瘤菌的遗传多样性．指纹图形是根瘤菌多样性研究中一种简便而有效的方法     

慢生型大豆根瘤菌的遗传多样性研究

采用选择性扩增片断长度多态性 (简称AFLP)DNA指纹技术对来自泰国北部的 2 45株慢生型大豆根瘤菌进行遗传多样性的研究 .通过AFLP图谱揭示出该地区的慢生型大豆根瘤菌有较显著的遗传多样性 .从 2 45株中选择出 92个代表株用计算机进行的树状图分析结果表明 ,所分析的菌株在 82 %的相似性水平上聚类成 8个群 .对这 92个代表株的部分菌株和慢生型大豆根瘤菌的参比菌株进行多聚酶链反应 (PCR)扩增的 16SrDNA的 4种限制性内切酶长度多态 (简称 16SrDNAPCR RFLP)分析 ,得出 2个不同的 16SrDNAPCR RFLP类型的菌株 ,分别与慢生型大豆根瘤菌的参比菌株Bradyrhizobiumjaponicum和Bradyrhizobiumelkanii相同 .图 1表 2参 14     

紫云英根瘤菌的系统发育多样性

在筛选根瘤菌与不同紫云英品种高效结瘤的基础上,通过16S rRNA基因序列分析,对13株共生结瘤效果好的菌种进行了系统发育研究.结果表明,13株菌属于3个主要聚类群,分别与Mesorhizobium、Agrobacterium和Stenotrophomonas亲缘关系最为接近,种类多样性较为丰富;其中编号为ACCC13065株的菌株与S.rhizophila16S rDNA序列相似性为100%,位于γ-变形菌纲,这是除α-变形亚纲、β-变形亚纲外所发现的一类新的根瘤菌类型.     

含发光酶基因的转座子质粒载体的改造及向根瘤菌HN01的转座

将从自杀性重组质粒pDB30上分离的3．6kb含卡那霉素抗性基因和发光酶基因（luxAB）的BglⅡ酶切片段，克隆到小Mr的高拷贝质粒pIJ2925上，构成新的质粒，pHNLX1011；然后将pHNLX1011经BglⅡ部分酶切，酶连在含蔗糖酶基因（sacB）的自杀性重组质粒载体pMH1701上，载体分别采用BglⅡ酶切和BamHⅠ酶切．连接转化后共得到4种重组质粒类型的菌株，它们具有不同发光活性；将它们分别与快生型大豆根瘤菌HN01进行三亲本杂交，发现它们的转座频率均较pDB30高．对经转座标记后的根瘤菌进行发光活性检测，只有pHNC3质粒所转座的根瘤菌浇具有较强发光活性．所得发光根瘤菌衍生菌株能在野大豆和栽培大豆黑农39根际形成正常根瘤，能用X光片记录下根瘤的发光活性．     

根瘤菌的遗传多样性与系统发育研究进展

根瘤菌 (ｒｈｉｚｏｂｉａ)是一类广泛分布于土壤中的革兰氏阴性细菌。它可以侵染豆科植物根部或茎部形成根瘤和少数茎瘤 ,固定空气中的分子态氮形成氨 ,为植物提供氮素营养 .据估计 ,全球每年生物固氮量达 1.75× 10 8ｔ,为世界工业氮肥产量的4 .37倍[1] .根瘤菌与豆科植物的共生固氮作用是生物固氮中固氮效率最高的体系 .因此 ,根瘤菌与豆科植物的共生固氮作用是实现农业可持续发展的重大研究课题之一 .研究根瘤菌的遗传多样性 ,对于发掘新的根瘤菌种质资源 ,保藏并合理利用根瘤菌基因资源库 ,选育高效菌株直接应用于农业生产有重要意义 .…     

慢生型大豆根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum)聚羟丁酸合成酶基因(phbC)突变体的构建及其特性

通过转座子Tn5诱变和同源重组，构建了Bradyrhizobium japonicum USDA110聚羟丁酸合成酶基因(phbC)突变体．序列测定确定了转座子插入的精确位置，所获得的4个转座子诱变的质粒其Tn5插在phbC基因内两个相距仅9bp的位点．被Southern和PCR证实的突变体菌株仍能产生相当于野生型菌株12．97％—25．10％的PHB，并且在突变体和野生型菌株总DNA杂交图上都呈现出一条约5kb的阳性带，推测在B.japonicum基因组中存在不止一个聚羟丁酸合成酶基因．图3表4参17     

慢生大豆根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum)聚羟丁酸合成酶基因(phbC)的克隆和序列测定

以苜蓿根瘤菌Rm1021的phaC基因突变体菌株Rm11144 (phaCTn5-233)为受体菌,通过功能互补,成功地从构建的Bradyrhizobium japonicum USDA110基因文库中,筛查到能与Rm11144互补,使之恢复在以乙酰乙酸为唯一碳源的M9培养基(M9-AA)平板上5 d形成明显可见菌落,以及在MOPS平板上形成粘液型菌落的表型的重组粘粒pDC2; 经证实,该粘粒带有phbC基因.完成了该基因的全序列测定并已在GenBank登记,登记号为AY077580.B.japonicum phbC基因由1803碱基对组成,GC含量61.8%,AT含量38.2%;编码600个氨基酸,Mr=66.95×103. 图3 表3 参13     

快生型大豆根瘤菌(Rhizobium fredii)内源质粒在培养及共生过程中的稳定性

以湖北洪湖公离的快生型大豆根瘤菌为材料，考察了它们的内源质粒在培养过程及共生过程中的稳定性．结果表明，所有供试菌株的质粒在培养条件下比较稳定，传代50次后没有明显变异．对其中2个菌株与4种不同的大豆宿主共生过程中质粒的稳定性研究，发现HA12－1－12的共生质粒和隐性质粒高度构定，HA7－2－2的质粒却发生了不同程度的变异．质粒检测的结果及RFLP分析表明，HA7－2－2共生质粒的稳定性高于隐性质粒，而且共生质粒上携带的nodDABC和nifHDK基因相当保守，不易受宿主的影响而产生变异．盆栽试验的结果也说明，虽然HA7－2－2的内源质粒在共生过程中发生了遗传重排，但它的共生性状没有明显的变异．     

紫云英根瘤分离菌株质粒多样性的研究

从广东、广西、湖南、湖北、江西、浙江、江苏７省紫云英（ＡｓｔｒａｇａｌｕｓｓｉｎｉｃｕｓＬ．）主要分布区４６个采集点的紫云英根瘤中分离到１０１个菌株．检测发现有１６种不同质粒类型,所含质粒１～４个不等,含两个质粒的菌株占绝大部分,质粒Ｍｒ为３６×１０６～３６４×１０６．用克隆Ｍ．ｈｕａｋｕｉ７６５３Ｒ的ｎｏｄＤＢＣ４．２ｋｂ片段为探针（α３２ｐｄＣＴＰ）进行的分子杂交结果表明,所有这些菌株均含有共生质粒,通常为第一大质粒,但Ｃ、Ｌ、Ｍ、Ｎ和Ｏ型为第二大质粒,共生质粒Ｍｒ在１３１×１０６～３６４×１０６之间．比较质粒类型与１６Ｓ２３ＳｒＤＮＡＩＧＳ（ｐＨｒ,ｐ２３ＳＲ０１）ＰＣＲＲＦＬＰ分析结果表明,ＩＧＳ类型不同,即使在同一植株分离所得的根瘤其质粒类型常不同,但在同一植株上分离菌株的质粒类型相同,则其ＩＧＳ常表现相同．表明质粒的类型是细菌染色体背景和细菌外环境（如共生条件等）共同作用的结果     

链格孢菌菌株致病性及其遗传差异性

对分离自紫茎泽兰的19个链格孢菌菌株的致病性进行了比较研究，并对这19个菌株和其它来源的3个菌株的5．8S rDNA及其两侧的ITS1区和ITS2区进行了序列分析．结果显示，链格孢菌菌株的致病性差异明显；21株链格孢菌菌株在5．8SrDNA及其两侧的转录问区（ITS区）的序列无差异，而与百日草链格孢菌（Alternaria zinnine）的序列差异显著，表明21株链格孢菌菌株属种内变异．采用AFLP分子标记技术对21株链格孢菌的DNA扩增片段长度多态性进行了分析，结果表明，链格孢菌自然变异群体内存在很高的遗传多样性．链格孢菌菌株的相似性与菌株的地理来源有一定的相关性，但基于AFLP标记划分的AFLP类群与基于寄主病情指数划分的致病力类群问关系不相一致；起始菌株与变异菌株相似性显著，但二者和致病性的关系不显著．图2表1参18     

不同基模势下luxAB标记的弗氏中华根瘤菌在土壤中的存活能力

经接合转移将luxAB基因插入弗氏中华根瘤菌（Rhizobium fredii)染色体,取可高效结瘤固氮的R fredii lux3菌株用于分子生态学研究,在不同基模势下,研究了lux3在土壤中的存活,基模势为－30和－750kPa时,lux3在灭菌土中的存活能力明显（P＜0．05）高于未灭菌土,当基模势为－1500kPa时,土壤是否灭菌对lux3的存活影响没有差异,不同基模势对lux3活性影响显著,在－1500kPa的未灭菌土中随着饥饿时间的延长,可恢复活性的细菌数量显著下降,比较了测定微生物活性的3种方法（即脱氢酶活性,生物发光和微生物呼吸）,发光值变化与活细胞密度变化一致。     

邻苯二酚1,2-双加氧酶(C12O)基因的定位、克隆和表达

射性同位素标记ｔｆｄＣ基因片段作探针,Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ杂交定位Ｌ１菌株的邻苯二酚１,２双加氧酶基因位于ＰｓｔⅠ的Ｉ片段和ＢａｍＨⅠ的Ｍ和Ｎ片段．低熔点琼脂糖回收ＰｓｔⅠ的Ｉ段,直接克隆至表达载体ｐＫＴ２３０上,获得重组子ｐＫＴ２３０ｐ．重组子转化不具开环酶活性的甲胺磷降解菌Ｐ２,获得高效的Ｃ１２Ｏ酶活     

陕甘宁地区根瘤菌数值分类与DNA同源性分析

在陕甘宁地区根瘤菌资源调查的基础上,选取其中与黄芪、岩黄蓍、木兰、鸡眼草及胡枝子共生的４０株快生根瘤菌和２５株参比菌株,对１３３项表型性状进行聚类分析,在８２％的相似性水平上构成５个不同于已知种的新亚群．对第１、２、３、４亚群ｘ（Ｇ＋Ｃ）／％测定及ＤＮＡ同源性分析结果表明,４个亚群ｘ（Ｇ＋Ｃ）／％含量均处于Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ属范围;各亚群内菌株ＤＮＡ同源性均在７５％以上,每个亚群中心菌株与１３个已知种模式菌株的ＤＮＡ同源性均小于６３％．从而证明,第１、２、３、４亚群为４个独立的快生根瘤菌新种群     

黄芪根瘤菌CA8561和JL84的部分16S rRNA基因序列的测定

报导了黄芪根瘤菌ＣＡ８５６１和ＪＬ８４的部分１６Ｓ ｒＲＮＡ基因序列，测算了它们与已知根瘤菌、茎瘤菌各属模式种之间的遗传距离。结果表明，ＣＡ８５６１和ＪＬ８４均具有独立的进化路线，充分显示了黄芪根瘤菌的遗传多样性。