利用枯草芽孢杆菌株间原生质体融合进行差异表型遗传重组分析的研究

枯草芽孢杆菌D100和枯草芽孢菌TN179同为枯草芽孢杆菌Ki－2－132的两个不同菌株，具有明显的表型差异．它们的融合子D279兼有两亲本的遗传性状，能够在常规培养条件下稳定遗传．但经过EMS处理后，即产生形状与各自亲本相似，且伴随菌落颜色、菌体形状和一些生理变化的分离物．从这些分离物的表型改变，得出了基因及连锁的一些遗传值息．     

绿色荧光蛋白基因标记内生枯草芽孢杆菌

用枯草芽孢杆菌168菌株rpsD基因的启动子替换质粒pGFP4412中蜡状芽孢杆菌4412启动子,从而构建了能在枯草芽孢杆菌中表达绿色荧光蛋白基因gfpmut3a的载体pS4GFP,将其导入具有内生、防病、促生作用的野生型枯草芽孢杆菌BS-2菌株中,筛选获得遗传稳定性好且具有良好发光表型的标记菌株BS-2-gfp.该标记菌株在小白菜体内的定殖研究结果表明,该菌株能够在小白菜根际及根、茎、叶内定殖和传导,接菌50d后仍能在其体内分离到标记菌株.图5参17     

喹诺酮类与磺胺类药物对枯草芽孢杆菌与大肠杆菌的联合毒性及其机制初探

以枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis 168)与大肠杆菌(Escherichia coli K12 MG-1655)为实验材料,以3种喹诺酮类药物及典型磺胺类药物为研究对象,分别测定了喹诺酮类药物与磺胺类药物对枯草芽孢杆菌与大肠杆菌的单一毒性及两类药物的联合效应,并对其毒性机制进行初步探讨.研究结果表示,磺胺类药物与喹诺酮类药物对枯草芽孢杆菌的毒性比对大肠杆菌的毒性小,可能是因为枯草芽孢杆菌的细胞壁较厚且富含肽聚糖,导致磺胺类药物与喹诺酮类药物较难进入枯草芽孢杆菌,毒性较低;同时大部分磺胺类药物与枯草芽孢杆菌的靶蛋白的结合能力低于其与大肠杆菌的靶蛋白的结合能力也是磺胺类药物对枯草芽孢杆菌的毒性比对大肠杆菌的毒性小的另一原因.喹诺酮类药物与磺胺类药物对枯草芽孢杆菌的联合效应表现为拮抗,而对大肠杆菌的联合效应则表现为相加.这两类药物有不同的联合效应,可能是由于枯草芽孢杆菌能够在磺胺类药物的作用下产生芽孢这一抗逆性构造,减弱喹诺酮类药物的杀菌作用.     

短叶对齿藓可培养内生细菌的分离及其发酵产物对宿主植物的影响

采用传统培养法分离内蒙古黄土丘陵区生物结皮的藓类植物优势种——短叶对齿藓(Didymodon tectorum)的内生细菌,并观察代表菌株的发酵产物对宿主植物孢子萌发及原丝体生长的影响.共分离出68株内生细菌,基于16S r DNA序列同源性分析及构建的系统发育树显示,它们分属于芽孢杆菌属(Bacillus)下的7个种,其中优势种为枯草芽孢杆菌(B.subtilis).枯草芽孢杆菌菌株DT-1和蜡样芽孢杆菌菌株DT-9的石油醚相、乙酸乙酯相和正丁醇相萃取物在1μg/m L、10μg/m L及100μg/m L三种浓度下对孢子萌发均无显著影响;石油醚相萃取物在3种浓度下不同程度地抑制原丝体生长;而乙酸乙酯相和正丁醇相萃取物则促进原丝体的生长.本研究表明苔藓植物原丝体阶段的生长发育与内生细菌的次生代谢物密切相关,可为干旱、半干旱区藓类生物结皮人工促建提供参考资料和实验依据.     

耐高温α-淀粉酶在溶源性枯草杆菌表达系统中的高效表达

构建了高效表达耐高温α-淀粉酶的枯草芽孢杆菌表达系统,并研究了该表达系统的主要特点.通过PCR扩增由地衣芽孢杆菌的基因组DNA分离高温淀粉酶基因后,将其克隆到质粒pSG703中.然后用pSG703质粒转化含温和性噬菌体φ105MU331的枯草芽孢杆菌,通过同源重组使高温淀粉酶基因插入到溶源性枯草芽孢杆菌的染色体上,并处于φ105MU331的强启动子下游.由于高温淀粉酶基因处于噬菌体的强启动子下游,在热诱导后可以实现高温淀粉酶的高效表达,诱导后8h内分泌到培养液中的高温淀粉酶活性可以达到9.58×103u/mL.本文构建的重组高温淀粉酶表达系统具有稳定、高效和杂蛋白分泌少的特点.图5参16     

气相色谱及气相色谱-质谱联用研究窖泥微生物

通过传统分离方法从浓香型白酒窖泥中筛选出5株芽孢杆菌,经气相色谱结合MIDI-Sherlock系统分析,分别为地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、泛酸枝芽孢杆菌、萎缩芽孢杆菌.采用固相萃取技术结合GC-MS技术分析其发酵产物,发现5株菌产风味物质能力都较强且种类丰富,主要有醇类、酮类等化合物,其中3-羟基-2-丁酮(乙偶姻)含量较高,而其代谢产物中的醇类、酮类及愈创木酚等物质对白酒风味的形成起着助香的作用.     

产碱性果胶酶的枯草芽孢杆菌ZGL14原生质体制备与再生条件

原生质体融合技术是一种重要的微生物育种方法.以能产碱性果胶酶的枯草芽孢杆菌ZGL14为出发菌株,探讨影响其原生质体制备和再生的主要因素.通过研究菌龄、溶菌酶浓度、酶解时间、酶解温度、渗透压稳定剂的p H值、再生培养基类型和培养方式等对枯草芽孢杆菌ZGL14原生质体制备与再生的影响,确定其最优化条件.结果显示:枯草芽孢杆菌ZGL14原生质体制备的最优条件为菌龄9 h,溶菌酶浓度0.2 mg/m L,酶解时间10 min,酶解温度32℃,渗透压稳定剂的p H值7.0.在此条件下,枯草芽孢杆菌ZGL14原生质体的形成率为98%,再生率达30%.枯草芽孢杆菌ZGL14原生质体再生培养基以琥珀酸钠作为渗透压稳定剂并结合Ca~(2+)再生效果较好,再生方式以单层培养较好.本研究获得了枯草芽孢杆菌ZGL14原生质体制备和再生的最佳条件,可为实现其融合育种提供技术支持.     

黄酮醇类化合物的合成与抗菌活性

以邻羟基苯乙酮和苯甲醛为原料,采用Algar-Flynn-Oyamada(AFO)反应,通过一锅法和分步法合成化合物;进一步用牛津杯法以甲氧西林为细菌阳性试验对照、DMSO为阴性对照,检测合成化合物对枯草芽孢杆菌、酿酒酵母菌、黑曲霉菌的抑菌能力.共合成20种黄酮醇类化合物,其中包括1个新化合物;合成化合物对酿酒酵母菌和黑曲霉菌并无明显抑制效果(d9 mm),而对枯草芽孢杆菌具有不同程度的抑制作用,其中含卤素取代的黄酮醇对枯草芽孢杆菌具有显著的抑制作用(d15 mm).构效关系研究表明,黄酮醇类化合物能有效对枯草芽孢杆菌形成抑制作用,且黄酮醇骨架上含有卤素取代(化合物7、8、17、19、20)表现出较好的抑菌作用;5-甲氧基取代黄酮醇(11、12、13、14)类化合物尽管不是活性最好的,但与相应的5位无取代的黄酮醇比较,如12 vs 2、13 vs 3、14 vs 1,活性有所提高.本研究获得了一些具有较好抗菌活性的黄酮醇化合物,可为药物发现和合成提供结构依据.     

耐高温α-淀粉酶基因在枯草芽孢杆菌中的高效表达

高温α-淀粉酶是发酵行业用量最大的酶类,为了实现高温α-淀粉酶基因的高效表达,本研究比较了不同启动子对地衣芽孢杆菌的耐高温α-淀粉酶基因在枯草芽孢杆菌中表达的影响.分别用强启动子P43和地衣芽孢杆菌的耐高温α-淀粉酶基因自身启动子构建了表达载体pP43NMK-amy和pUBCl9-amy,并在枯草芽孢杆菌BacillussubtilislA752S中进行表达.结果表明,与地衣芽孢杆菌的耐高温α-淀粉酶基闪自身启动子相比,采用P43启动子的耐高温α-淀粉酶其表达水平提高了8.9倍.而且在枯草芽孢杆菌B.subtilislA752S中分泌表达的α-淀粉酶仍具有耐高温的特性,酶反应的最适温度为90℃,表明酶的热稳定性南蛋白质本身的氨基酸序列决定的.     

对生态系统中分离获得的菌种进行优势种群测定的方法学…

两年内７次从同一个以杨木木屑为原料的厌氧发酵罐的高稀释度发酵淮中分离出一株中温纤维分解菌，即新种阿氏梭状芽孢杆菌。从细菌计数高且能反复分离获得这两个特点，可以断 这下阿氏梭状芽孢杆菌在该生态系统中曾是一个优势种群。经菌落及菌体形态学观察，以及用首次分离的菌株所作的多价抗血清酶联免疫吸附试验（ＥＬＩＳＡ），确定了７次分离菌株为同一菌种，从而证实阿氏梭状芽孢杆菌在１９８６年９月至１９８８年８月间，曾是     

对生态系统中分离获得的菌种进行优势种群测定的方法学探讨：一株优势纤维分解菌的确定

两年内７次从同一个以杨木木屑为原料的厌氧发酵罐的高稀释度发酵液中分离出一株中温纤维分解菌，即新种阿氏梭状芽孢杆菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍａｌｄｒｉｃｈｉｉ）。从细菌计数高且能反复分离获得这两个特点，可以断定阿氏梭状芽孢杆菌在该生态系统中曾是一个优势种群。经菌落及菌体形态学观察，以及用首次分离的菌株所作的多价抗血清酶联免疫吸附试验（ＥＬＩＳＡ），确定７次分离菌株为同一菌种，从而证实阿氏梭状芽孢杆菌在１９８６年９月至１９８８年８月间，曾是该厌氧发酵罐中每毫升含菌高达１０６─１０７的优势纤维分解菌。     

近海养虾场底泥中产芽孢细菌的生态特征

通过对近海养虾场底泥中的细菌数量和类群的调查，发现有超过50％的细菌生物量是产芽孢细菌，因此对底泥中的产芽孢细菌进行了分离和纯化，通过对细胞形态、生理生化等特征的研究和对部分菌株的16S rRNA基因的ARDRA分型、序列分析等，鉴定了67株产芽孢细菌，其中62株属于芽孢杆菌属，5株属于短芽孢杆菌属．进一步对62株芽孢杆菌属的细菌在底泥不同深度的分布进行研究，结果表明，巨大芽孢杆菌主要分布在底泥深度0～6cm左右的区域，海洋芽孢杆菌、短小芽孢杆菌和蜡状芽孢杆菌主要分布于底泥6cm以下的区域，与坚强芽孢杆菌性状相近的菌分布在底泥2～8cm深度；与耐碱芽孢杆菌性状相近的芽孢菌广泛分布在0～12cm区域．讨论认为，应用这些产芽孢细菌资源在修复海洋环境和开发海水养殖微生态制剂方面具有一定可能性．图3表3参15     

基于饲料酵母二次发酵啤酒糟条件响应面优化研究

为提高发酵啤酒糟高蛋白产量,以一次发酵的黑曲霉和木霉双菌发酵的啤酒糟为原料,粗蛋白含量为指标,对饲料酵母和枯草芽孢杆菌进行二次混菌发酵,其对应的最佳条件为温度33.73℃,接种量16.51%,酵母菌和枯草芽孢杆菌接种量比为5∶1,添加硫酸铵5.00%,尿素添加量2.00%,发酵时间4 d,理论粗蛋白质含量43.38%.表明通过二次混菌发酵能显著提高啤酒糟粗蛋白含量.     

京密引水中天然有机物的形态

用改进的Ｌｅｅｎｈｅｅｒ分离方法，并引入最新的ＸＡＤ－８，ＸＡＤ－４树脂串联技术，将京密引水中有机物定量分离为悬浮和溶解态两大类。后者又进一步分离为憎水有机物、腐殖酸类，ＸＡＤ－４酸和亲水中性有机物等形成。溶解态有机物含量约为３ｍｇＣ／ｌ，其中一半左右为腐殖酸类。ＸＡＤ－４酸占溶解态有机１５－２０％，非极性憎水有机物所占比例很低。     

微生物对土壤和沉积物吸附多环芳烃动力学的影响

以枯草芽孢杆菌为接种微生物,研究微生物对沉积物和湿地土壤吸附菲和苯并[a]芘(BaP)吸附动力学的影响.结果表明:枯草芽孢杆菌对菲与BaP都可进行生物降解,对菲的利用率明显要大于BaP;接种微生物的土壤与沉积物对菲和BaP的吸附动力曲线与仅有微生物吸附的结果相近似,表明多环芳烃的降低主要是由于微生物的利用造成的;接种微生物后沉积物与土壤对菲的吸附量明显增大,而对BaP的吸附却降低.     

降解四氯乙烯厌氧菌的分离和特征

从降解四氯乙烯沼气污泥富集培养物中分离得到4株厌氧菌,其中2株为弧菌（Vibrio）,其细胞弧状,分别端单生,丛生鞭毛;1株是杆菌（Bacillus）,其细胞杆状,G－,无鞭毛和芽孢;1株为甲烷八叠球菌（Methanosarcina）,其细胞球状,成堆排列．4株菌均可以甲醇为碳源,并具有不同强度降解四氯乙烯的活性．     

两株芽孢杆菌降解羽毛比较及抗氧化肽分离

枯草芽孢杆菌UMU4和短小芽孢杆菌SCU11是四川省分子生物学及生物技术重点实验室分离的野生菌株经诱变获得的胞外蛋白酶高产菌株,其分泌的蛋白酶在蛋白废弃物处理方面具有良好的应用前景.为了从这两株芽孢杆菌中筛选出高效利用羽毛的最优菌株,将UMU4和SCU11分别接种到羽毛培养基中并持续发酵6 d,通过每天测试羽毛降解率、可溶性多肽含量、氨基酸含量、蛋白酶活及抗氧化活性等指标来评价这两株菌对羽毛的降解能力.结果发现SCU11能更高效地利用羽毛,其羽毛降解率是UMU4的1.2倍,第5天时约有65%的羽毛转化为可溶性肽和氨基酸;SCU11发酵液的ABTS自由基清除率和还原力均在第3天达到最大值,且显著高于UMU4羽毛发酵液的抗氧化活性;SCU11在第5天所产角蛋白酶和碱性蛋白酶的活性分别是UMU4的1.6和1.2倍.在此基础上,将来自于SCU11的羽毛降解产物经HCl沉淀和疏水层析获得了4个抗氧化肽组分,其中组分F3的抗氧化活性最高.本研究表明芽孢杆菌SCU11较之UMU4具有更高的产酶活性及更强的羽毛降解能力,结果可为家禽羽毛的资源化应用奠定基础.     

动水条件下沉积物-水界面微生物与铬的相互作用机理

通过沉积物-水相互作用的室内水槽模拟实验,在上覆水Cr(Ⅵ)不断更新条件下,分析了沉积物中Cr(Ⅵ)的吸附还原能力和微生物的生长特征,探讨了微生物作用下沉积物-水界面重金属铬的迁移转化机理。结果表明,在上覆水Cr(Ⅵ)浓度不断增加条件下,沉积物微生物菌落经历了初步适应期、快速增长期、竞争生长期和稳定期4个阶段。在高铬(Cr(Ⅵ)0.1mg·L~(-1))条件下,沉积物表层微生物群落主要是蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)、环状芽孢杆菌(Bacillus annularis)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilison)。在微生物作用下,Cr(Ⅵ)还原率稳定于47.56%左右;由于微生物作用,沉积物对铬的吸附率明显升高,可达53.63%。微生物蜡状芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌释放的还原性酶和还原性离子将沉积物-水界面的六价铬不断还原为三价铬,在弱碱性环境中形成Cr(OH)_3沉淀和络合沉淀,增大了表层沉积物中铬的含量,降低了水环境中铬的含量。研究成果对河流铬污染自净起到了理论指导和科学支撑作用。     

利用味精废水培养枯草芽孢杆菌产γ-聚谷氨酸及初步表征

味精废水是一种高浓度有机废水,具有酸性强、高COD、高BOD、高硫酸根、高菌体含量和低温等特点,其中含有大量的L-谷氨酸、还原糖与氨氮,如果任其排放不仅浪费了宝贵资源,而且会造成严重的环境污染。实验利用味精废水作为培养基,培养枯草芽孢杆菌168得到产物γ-聚谷氨酸,对于探索味精废水的资源化利用途径和降低微生物法合成γ-聚谷氨酸的生产成本具有积极意义。单因素实验研究了培养条件对枯草芽孢杆菌168生长和γ-聚谷氨酸产量的影响,结果表明,味精废水浓度、初始pH、接种量和培养时间对枯草芽孢杆菌168生长和γ-PGA产量具有重要的影响。通过Box-Behnken响应面法进一步优化了枯草芽孢杆菌168的培养条件,优化后的培养条件为:味精废水稀释倍数3.88,培养初始pH 5.84,50 mL味精废水接种量10.55 mL,在37℃、180 r·min~(-1)条件下培养48 h,γ-聚谷氨酸的产量达到(53.51±0.92) g?L~(-1)。茚三酮比色法确定粗产品中γ-聚谷氨酸含量为78.24%(质量分数)。紫外扫描光谱分析显示检测样品中氨基和羧基的特点符合γ-PGA标准图谱特征,γ-聚谷氨酸的聚合键与蛋白质的肽键结构有明显区别,γ-聚谷氨酸是由γ-酰胺键聚合而成。傅立叶红外光谱和核磁共振分析显示,样品中含有酰胺基、羧基、羰基-CH、-CH_2等基团。对紫外光谱、红外光谱和核磁共振结果进行综合分析,可以初步确定样品中存在酰胺键连接的多聚体结构,即γ-聚谷氨酸的结构。研究结果显示,利用味精废水培养枯草芽孢杆菌168得到产物γ-聚谷氨酸在技术上是可行的,为味精废水资源化利用探索出一条可能的途径,且具有降低微生物法合成γ-聚谷氨酸成本的潜力。     

溶剂气浮分离法的基础研究

本文研究了待分离物呈表面活性物系（甲基橙－十六烷基氯化吡啶、十六烷基氯化吡啶）和呈疏水性物系（铜－二乙基二硫代氨基甲酸钠、镍－丁二酮肟）的溶液气浮变化规律。红外光谱分析表明，分离效率的高低与有机相和气浮分离物相互作用的强弱不相关。通过高速摄影及计算证明，水相和有机相两相界面间的稳定的气泡层存在，它一方面使待分离物质在水相中的停留时间在大增加，另一方面又保护了已捕集的待分离物质，从而增加了气泡吸附总