应用绿色荧光蛋白基因标记细菌进行生物膜结构定量化新方法

绿色荧光蛋白基因pEGFP经CaCl₂转化法标记E.coli JM109菌株,获得的标记菌株作为模式细菌接种含50μg/mL氨苄的LB培养基,在摇瓶中与火山岩颗粒共混培养挂膜(37℃,120r/min,16h).用激光共聚焦扫描显微镜摄取获得火山岩填料生物膜250μm×250μm区域不同层面的图片堆,所获图片堆经COMSTAT程序处理可以获得相关的定量化参数,如16h生物膜平均厚度为0.120844μm,生物膜最大厚度为10.5μm,生物膜体积为0.136986μm³/μm²,生物膜表面积21338.1μm²,生物膜比表面积为3.36854μm²/μm³.该方法也可以扩展至其他绿色荧光蛋白基因标记细菌的生物膜结构定量化.     

环境因素对大肠杆菌REP-PCR指纹图谱稳定性影响研究

大肠杆菌作为粪便污染指示生物,其DNA指纹图谱稳定性是制约微生物污染源识别技术发展的瓶颈之一.本研究采用绿色荧光蛋白基因(GFP)标记后的Escherichia coli K12(K12GFP)为受试菌株,利用REP-PCR方法,对大肠杆菌在不同温度、光照、盐度条件下其DNA指纹图谱的稳定性进行了研究.结果表明,绿色荧...     

利用绿色荧光蛋白标记革兰氏阴性细菌的研究

构建了具有不同抗性且能够组成型表达绿色荧光蛋白的一系列转座子质粒pTnMod-OCm-G、pTnMod-OTc-G、pTnMod-OKm3-G和pTnMod-OGm-G,并通过三亲本杂交的方法,成功地将荧光蛋白基因分别插入到多环芳烃降解菌株Sphingomonas sp.12A和Pseudomonas sp.12B的基...     

绿色荧光蛋白标记阿特拉津降解基因工程菌的特性

通过转化绿色荧光蛋白基因质粒,对阿特拉津降解基因工程菌进行标记.转化后,绿色荧光蛋白在细胞内表达情况良好.在含抗生素的LB培养基中,绿色荧光蛋白的表达水平高于LB培养基和基础培养基.在细胞生长的稳定期,绿色荧光蛋白表达水平高于停滞期和对数生长期.绿色荧光蛋白基因质粒转化和表达,不会对基因工程菌原有的降解能力产生影响,而且绿色荧光蛋白的表达水平和降解活性存在接近线形的正相关关系.荧光蛋白标记细胞投加到反应器活性污泥中,会以2种状态存在:游离态和附着态,而且初期游离态细胞的数量大于附着态细胞的数量.     

绿色荧光蛋白基因在根际优势菌株中的高效表达

从人工模拟污染土壤中的黄麻根际分离得到两株优势菌株。通过PCR技术对增强绿色荧光蛋白基因与质粒载体pTnMod Ocm进行体外重组构建新的质粒 ,并转化分离得到的优势菌株。结果表明增强绿色荧光蛋白基因在黄麻根际优势菌株中高效表达     

用于废水处理系统中目标酵母动态解析的绿色荧光蛋白基因质粒构建

绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)可用于研究复合微生物体系中特定目标功能菌的特性及动态变化,本研究为确立用于解析酵母细胞在混合酵母废水处理系统中的动态特性的GFP技术体系奠定了基础.将gfp基因克隆到酵母载体pACT-URA3中,再用构建的重组质粒转化宿主菌大肠杆菌(Escherichia coli JMl09),扩增得到含gfp的重组质粒,荧光显微镜照片显示gfp基因在大肠杆菌内得到了表达,但表达程度不高;电泳图谱及聚合酶链反应结果表明,含gfp基因的质粒不是以游离的形式存在,而可能是以某种特殊的形式和细胞染色体发生了相互作用.     

腺病毒气溶胶的实时荧光定量PCR检测和绿色荧光蛋白活细胞检测

将带有绿色荧光蛋白的复制缺陷型重组腺病毒,作为模拟病毒建立一种检测病毒侵袭力的方法.在钢化玻璃箱中通过TK-3型微生物气溶胶发生器将腺病毒形成气溶胶,用FA-1型多级撞击式空气微生物采样器进行气溶胶采样,对采样样品分别进行实时荧光定量PCR检测和表达了绿色荧光蛋白的PK15活细胞定时检测.实时荧光定量PCR检测可测定病毒在大气中存在的相对基因拷贝数,通过在荧光显微镜下计数带绿色荧光的PK15细胞数可直观检测病毒的感染力及活力.结果表明,重组腺病毒气溶胶主要分布在采样器第五级,腺病毒气溶胶与病毒粒子相比较大.     

绿色荧光蛋白标记在生物修复中的应用

通过对铜绿假单胞菌进行增强型绿色荧光蛋白(EGFP)标记,获得带有EGFP遗传标记的铜绿假单胞菌.该菌株绿色荧光标记性能稳定,通过转化子基因组DNAPCR和斑点杂交检测,证明外源EGFP基因存在于转化子染色体上.转化子30h内将溶液的表面张力由70mN/m降至35mN/m,产生的生物表面活性剂性能良好.     

头孢噻肟钠与重金属对AmpC β-内酰胺酶类抗性基因转移的影响

为探究抗生素和重金属对抗性转移及接合子抗性基因丰度的影响,借助绿色荧光蛋白标记质粒,采用滤膜接合配对方法研究了胁迫条件对细菌接合频率的影响,定量检测了转移后的AmpC β-内酰胺酶类抗性基因丰度的变化.结果表明,头孢噻肟钠及重金属共胁迫促进了AmpC β-内酰胺酶类抗性基因从复杂群落到Escherichia coli BL21的转移.3μg·L~(-1)头孢噻肟钠胁迫下,细菌接合频率为空白组的2.06倍,其中,接合子耐药基因CIT、FOX和EBC的相对丰度分别升高了7.47、4.30和1.60倍.同时,以3μg·L~(-1)头孢噻肟钠胁迫组为对照,研究了重金属汞、铜和锌共胁迫对抗性转移的影响,考虑到头孢噻肟钠的水解特性和接合子克隆性扩增,接合时间定为3 h.结果发现,汞、铜、锌与头孢噻肟钠共胁迫组的细菌接合频率分别比对照组增长了2.57、1.60和1.74倍.汞共胁迫对接合子中7种AmpC β-内酰胺酶类抗性基因丰度无显著影响;铜共胁迫效应因抗生素抗性基因(ARGs)种类不同而不同,其中,对抗性基因EBC相对丰度的影响最大;锌共胁迫效应受锌离子浓度和ARGs种类影响,100 mg·L~(-1)锌共胁迫使得EBC和CIT丰度比对照组分别增加3.56和2.76倍.可见,抗生素与重金属共胁迫条件可促进环境中AmpC β-内酰胺酶类抗性基因的转移,值得关注.     

1株2,4-D降解菌的gfp标记及其在废水生物处理系统中的检测方法

通过mini-Tn7转座子系统将绿色荧光蛋白基因(gfp)插入到2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-dichlorophenoxyacetic acid,2,4-D)降解菌Achromobacter sp.的染色体上,考察了标记前后该菌株的生长、发光及降解污染物特性,并探讨了将其投加到不同废水生物处理系统(活性污泥和颗粒污泥系统)后的定量检测方法.结果表明,Achromobacter sp.标记前后生长和降解2,4-D特性基本不变,在103～112 h内可将初始浓度约为100 mg/L的2,4-D完全降解.标记后菌株在生长和降解2,4-D过程中都能够稳定表达绿色荧光,降解过程荧光强度/D600稳定在4 500左右.向活性污泥系统投加该标记菌,可通过直接测定混合液荧光强度对该标记菌进行定量检测,在标记菌质量分数为0～75%的范围内,绿色荧光蛋白的表达水平与该标记菌的质量分数线性相关(R2=0.995 2).向颗粒污泥系统投加该标记菌,需要对混合液破碎均质化处理后测定荧光强度,在标记菌质量分数为0～42%的范围内,绿色荧光蛋白的表达水平与该标记菌的质量分数线性相关(R2=0.980 1).基于Tn7插入gfp的标记方法可以用来跟踪检测生物处理系统中的特异微生物.     

转聚磷激酶基因的大肠杆菌去除水体中的磷

为探索有效的生物除磷方法,构建了聚磷激酶基因(ppk)的表达载体pET28a(+),并转化大肠杆菌(Escherichiacoli)BL21,获得了可过表达ppk基因的工程菌BL-PPK.RT-PCR结果表明,ppk基因在转化的大肠杆菌中得到了高效表达.聚磷试验结果表明,培养10h后,转化了ppk基因的大肠杆菌细胞内聚磷含量比对照菌株高20倍,而培养液中可溶性磷浓度为对照菌株的约1/9.     

远程氧等离子体灭活大肠杆菌的研究

研究放电等离子体灭活大肠杆菌的效果。采用远程氧等离子体反应器,分别考察探究放电功率、处理时间、氧气流量、远程距离及有机污染物对灭菌效果的影响,并观察灭菌前后大肠杆菌的显微结构。结果表明在100W,60s,40cm3/min条件下,远程氧等离子体的杀菌效果值在距放电区0、20、40cm处分别为3.42、3.38和3.32。有机物浓度升高,灭菌效果急剧下降。结论为氧等离子体在距放电区040cm内均能有效灭活大肠杆菌,但有机污染物影响较大。氧等离子体场中高能粒子的刻蚀作用是导致细菌死亡的主要原因。     

载银活性碳纤维对大肠杆菌吸附作用的研究

以大肠杆菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）为对象，通过细菌吸附实验研究了载银活性碳纤维（ＡＣＦ（Ａｇ））对大肠杆菌的吸附特性．借助扫描电子显微镜（ＳＥＭ）进行细菌分布形态的观察和细菌数量的计算．结果表明，大肠杆菌易分布于ＡＣＦ（Ａｇ）表面的沟槽处；ＡＣＦ（Ａｇ）吸附的细菌数量随银含量、比表面积的增加而增大．此外，细菌吸附量还与ＡＣＦ（Ａｇ）表面银颗粒的大小有关．对吸附细菌的动力学亦进行了研究．     

矿物微尘对大肠杆菌蛋白质合成及酶活性影响

文章对经过矿物微尘处理后大肠杆菌的总蛋白质浓度、SOD(超氧化物歧化酶)同工酶活性和CAT(过氧化氢酶)同工酶活性进行了测定和比较分析。结果表明:矿物微尘对大肠杆菌体内的蛋白质合成有很强的抑制作用,总蛋白质浓度在加入了微尘后表现出明显的下降。但SOD和CAT酶活性随着微尘浓度的增加而提高,表明大肠杆菌对微尘的作用作出了抗逆性反应。     

MTT法测定大肠杆菌活菌数实验研究

实验分析MTT比色法中的工作波长、反应时间、MTT用量、菌龄、二甲基亚砜（DMSO）等因素对大肠杆菌活细菌计数的影响.同时,通过与平板计数对比,确定了MTT细菌计数的可行性.结果表明,当细菌数在107～109cell·mL-1范围内时,双波长MTT法可用于检测大肠杆菌的活菌数量,最佳反应时间为60min,MTT溶液用量...     

高锰酸钾预氧化对大肠杆菌DBPsFP的去除

以大肠杆菌为试验对象,采用高锰酸钾（KMnO₄）预氧化法,研究了不同的高锰酸钾浓度、氯化时间、pH值、预氧化时间及反应温度在氯化消毒过程中对大肠杆菌消毒副产物生成潜能（DBPsFP）的去除影响.研究表明：随着KMnO₄浓度的增加,二氯乙腈（DCAN）、三氯乙腈（TCAN）、1,1,1-三氯丙酮（1,1,1-TCP）及三氯乙醛（CH）浓度先降低,后升高,1,1-二氯丙酮（1,1-DCP）浓度先升高,后降低;三氯甲烷（TCM）浓度逐渐降低.在KMnO₄浓度2mg/L时,DCAN、TCAN、1,1,1-TCP浓度降至最低,对大肠杆菌DBPsFP的氧化去除效果最好;延长氯化时间,TCAN,1,1-DCP浓度逐渐升高,而DCAN,CH和1,1,1-TCP浓度先升高后降低.TCM浓度先升高后趋于稳定;pH值由5升高到9时,1,1,1-TCP、TCAN浓度不断地降低;DCAN浓度先降低,再升高;而1,1-DCP、CH浓度先升高,再降低;延长预氧化时间,TCAN、DCAN、TCM的浓度逐渐降低;1,1-DCP、1,1,1-TCP的浓度先升高,再降低;CH的浓度先升高,之后趋于稳定;随着反应温度的升高,1,1-DCP、DCAN的浓度逐渐升高;1,1,1-TCP浓度则逐渐降低;TCAN、TCM的浓度先升高再降低,而CH浓度则先降低再升高.综上,在KMnO₄浓度2mg/L,氯化时间48h,碱性条件（pH > 8）,预氧化时间30min时最有利于大肠杆菌DBPsFP的去除.     

高选择性基因工程菌E.coli SE5000生物富集水体中的镍离子

利用基因工程菌E．coli SE5000对水体中的镍离子进行富集研究．菌体细胞对Ni^2 的富集速率很快,富集过程满足Langmuir等温线模型．经基因改造的基因工程菌不仅最大镍富集容量与原始宿主菌相比增加了4倍多,而且对pH值的变化呈现出更强的适应性．对离子强度及其它共存重金属离子的影响的实验结果表明：Na^ ,Ca^2 ,Cd^2 ,Pb^2 的影响较小,但Mg^2 ,Hg^2 ,Cr^3 和Cu^2 所引起的负面效应较大．金属螯合剂EDTA的存在对基因工程菌的富集行为影响很大．     

载铜蒙脱石对大肠杆菌K88吸附性能的研究

以蒙脱石(MMT)和硫酸铜为主要原料,制备了载铜蒙脱石(MMT-Cu),并对MMT-Cu吸附大肠杆菌K88的能力进行比较研究.结果表明:MMT和MMT-Cu对大肠杆菌K88均有较强的吸附作用,但载铜后蒙脱石吸附大肠杆菌的能力明显增强.细菌与吸附材料作用90min后可达到吸附平衡.介质pH值、离子强度和吸附温度对MMT和MMT-Cu吸附细菌的能力均有不同程度的影响.