甘蓝型油菜脂肪酸链延长酶基因FAE1的克隆与原核表达

脂肪酸延长酶1(FAE1)是广泛存在于植物中并定位于内质网上的一种能催化脂肪酸碳链延长的酮脂酰CoA合成酶.根据Genbank上已知的植物FAE1基因设计引物,以从甘蓝型油菜叶片中提取的总DNA为模板,进行PCR扩增,获得了1380bp的片段.回收该片段,并连接到pMD18-T载体测序.序列比对结果说明了该片段与植物中已知的FAE1序列有极高的相似性,并且不存在内含子序列.将该片段通过高保真酶扩增,EcoRⅠ酶切消化后定向克隆到pGEX-2T表达载体中,在IPTG诱导下于28℃表达出Mr76×103的蛋白质条带.用兔抗GST多克隆抗体做第一抗体进行Western-blot检测,并获得阳性检测结果.这为甘蓝型油菜脂肪酸链延长酶基因FAE1功能的进一步研究奠定了基础.图4表1参14     

麻疯树酰基载体蛋白的基因克隆、表达分析及原核表达

从麻疯树胚乳cDNA文库中筛选分离了一个编码酰基载体蛋白的cDNA序列,全长为806 bp,其开放读码框(ORF)长度为393 bp.编码130个氨基酸,该序列在GenBanl澄录号为EF179617,命名为JcACP.该基因编码的蛋白质相对分子质量(M)约为14.4×103,等电点为5.2,具有酰基载体蛋白的典型特征--含有4'-磷酸泛酰巯基乙胺辅基的结合位点.RT-PCR试验结果表明,该基因在麻疯树的叶、茎和种子中表达,以种子中的表达量最高,在根中不表达,种子萌发后其表达量随萌发进程递增,在96 h时表达量达到最高.结果表明,JcAcP在种子中的高度表达可能与种子萌发时的代谢活动有关.同时,将其在大肠杆菌中成功进行了原核表达.     

暗处理对油菜子叶类囊体膜色素组成和荧光性质的影响

以蜀杂10号油菜为材料,播种7 d后分别置于自然光照条件和黑暗环境中进行暗处理,未处理油菜在d 5、d7、d 14、d 17、d 21、d 24和d 27时收集子叶,暗处理油菜于播种d 8、d 10、d 12和d 14时收集子叶.制备油菜子叶类囊体膜,分析色素含量,并进行类囊体膜丙酮抽提液窜温吸收光谱、叶绿素荧光发射和激发光谱以及蛋白质内源荧光光谱的分析.结果显示:与未处理油菜相比,暗处理引起油菜子叶类囊体膜光合色素Chl a和Chl b含量急剧减少,Chla/b比值和叶绿素/类胡萝卜素(Chl/Car)比值持续下降,类囊体膜对叶绿素的捕光能力和受激发能力降低,类囊体膜蛋白质内源荧光强度降低,以及色素蛋白复合物降解.上述结果表明,暗处理诱导油菜子叶快速进入衰老阶段,类囊体膜蛋白组成和色素的光合功能均发生了明显的变化.图10参23     

BALB／C鼠睾丸组织中冷诱导RNA结合蛋白的cDNA克隆与序列分析

冷诱导RNA结合蛋白(Cold inducible RNA-binding protein,CIRP)在多种冷应激细胞(包括重组中国仓鼠卵巢细胞)中被发现.迄今为止,冷应激对活体生物基凶表达的影响还未见报道.和细胞相比,生物体具有更加复杂的冷应激调节机制.本研究以冷处理的BALB/C鼠为实验动物,从其睾丸组织巾克隆出了CIRP的cDNA.结果表明,CIRP在生物体中能够被低温诱导,可能防止生物体遭受冷损伤.根据克隆的cDNA所推测的氨基酸序列与GenBank上公布的小鼠、大鼠、人类、牛蛙、美西螈、非洲爪蟾胚胎细胞和卵母细胞的CIRP氨基酸序列同源性分别为100%、99.40%、95.5%、67.4%、58.4%、76.9%和79.1%.这表明CIRP在生物进化过程中是高度保守的,可能具有多种生理功能.因此,这一研究将为探索人类和动物冷应激分子机制创立系统试验模型和奠定新的实践基础.图5参14     

Influence of lead on growth and nutrient accumulation in canola (Brassica napus L.) cultivars

Canola (Brassica napus L.) is commonly used as a hyper-accumulator for phytoextraction of heavy metals from soil and water. Like many other heavy metals, lead (Pb) contaminates soil, water and air and thus it is a great problem. This study was conducted to investigate toxic effects of Pb on growth and nutrient uptake in four canola cultivars. Each of four cultivars of canola (Con-II, Con-III, Legend and Shiralee) was subjected to four levels of Pb (0, 30, 60 and 90 mg Pb kg(-1) of soil) from lead chloride [PbCl2]. Due to Pb toxicity, plant growth was adversely affected and relatively a severe reduction in root biomass (45.7%) was recorded. The Pb accumulation increased both in shoot and root, the highest being in root. The uptake of different nutrients, i.e., N, P, K, Ca, Mg, Zn, Cu and Mn was reduced (38.4, 32.8, 33.1, 49.6, 7.78, 52.0, 42.6 and 45.9%, respectively) in the shoots and that of N, Fe, Zn, and Cu in the roots (48.5, 33.2, 24.3 and 44.8%, respectively) of all canola cultivars. The root K, P, Zn and Mn and shoot P, Mg and Fe contents were less affected, the concentration of Pb, Ca and Mg in roots of all cultivars. Among canola cultivars Con-II and Con-III performed better than Legend and Shiralee in terms of growth (26.03%) and nutrient accumulation. Overall, plant growth and nutrient accumulation in the canola cultivars was hampered due to the presence of Pb.     

矮牵牛花香基因BSMT3的cDNA克隆与表达特征分析

以矮牵牛花瓣总RNA为模板,RT-PCR方法克隆得到其BSMTcDNA,全长1100bp,编码357aa,与已有报道phBSMT1(GenBank No.AA0501)和phBSMT2(AAO45013)的同源性分别达到97.76%和98.6%,该序列在Gen-Bank登录号为DQ494491,命名为phBSMT3.构建的BSMT3 cDNA的原核表达质粒pGBSMT转化BL21(DE3)E.coli,获得的重组菌株经0.01mol/LIPTG诱导后得到正确表达的GST-BSMT融合蛋白带,以纯化的重组表达蛋白免疫家兔获得其兔抗免疫血清.免疫组化研究结果证实,矮牵牛花香基因BSMT在花瓣、花管中的表达量较其它组织的表达量高.图5参24     

麻疯树胚乳类F-盒蛋白基因的克隆和载体构建

通过随机测序从本实验室构建的麻疯树胚乳cDNA文库中获得了一条与多种植物、动物F-盒家族(F-box)序列相似的EST序列,并进一步克隆得到含有完整编码框的cDNA全长和基因组序列(Jc-Fbl1).Jc-Fbl1cDNA全长1672bp,开放阅读框为1224bp,编码的蛋白质含有407个氨基酸残基.Jc-Fbl1推导的氨基酸序列与拟南芥、水稻中的同源F-box蛋白相似性分别为52%和75%;与人、斑马鱼、线虫等动物的F-box蛋白的相似性达到48%~56%.应用Pfam Search寻找功能结构域,发现其除了含有F-盒家族类结构域外,还有富含亮氨酸重复单位(leucine-rich repeats,LRRs).比对Jc-Fbl1的基因组序列和cDNA序列,发现Jc-Fbl1有两个长度分别为331bp和893bp的外显子和一个长362bp的插入序列,符合内含子的GT-AG法则,认为是Jc-Fbl1的内含子.水稻、拟南芥基因组中的同源序列也出现了这种两个外显子、一个内含子的结构,且内含子位置较为保守.为了进一步研究麻疯树F-box蛋白的功能,构建了同时含有Jc-Fbl1完整开放阅读框序列和绿色荧光蛋白标签的真核表达载体pBI121-Jc-Fbl1-GFP,并经酶切鉴定构建成功.     

东亚飞蝗辅酶Q-细胞色素C还原酶基因克隆和序列分析

辅酶Q-细胞色素C还原酶是组成线粒体呼吸链的4种酶复合体之一,对线粒体呼吸链的电子传递起着重要作用.同时,辅酶Q-细胞色素C还原酶还是杀真菌剂(Fungicide)、抗原虫(Antiprotozoan)、抗癌药物(Anticancer drugs)以及抗疟疾(Antimalarial)药物——阿托喹酮(Atovaquone)、氯胍(Proguanil)、布帕伐醌(Buparvaquone)的作用靶标,可将它作为昆虫的药靶,设计和开发新型的杀虫剂.采用RACE方法,克隆了东亚飞蝗[Locusta migratoria manilensis(Meyen)]辅酶Q-细胞色素C还原酶cDNA全序列(GenBank登录号:GU593056.1).获得的cDNA全长939 bp,其中可读框819 bp,编码272个氨基酸,推测其相对分子质量为29.48 ku,等电点为9.19.通过与其它10个物种的细胞色素C还原酶基因的氨基酸序列进行比对,发现东亚飞蝗与家蚕、赤拟谷盗、黒腹果蝇、埃及伊蚊、致乏库蚊、小家鼠、人、丽蝇蛹集金小蜂、蜜蜂和豌豆蚜的辅酶Q-细胞色素C还原酶氨基酸序列同源性分别为72%、72%、66%、63%、60%、59%、59%、58%、57%和56%.     

镉胁迫对小白菜（Brassica campestris L.）抗氧化机理的影响

采用水培的方法,研究了不同Cd2 水平(0、1、2.5、5、10、15mg·L-1)对小白菜(Brassica campestris L.)抗氧化酶(SOD、POD、CAT)活性、非酶物质(SH、GSH、PCs)含晕以及生长的影响.结果表明,小白菜叶片和根系SOD活性随Cd处理质量浓度的增加呈降低的变化趋势,POD、CAT活性以及MDA含量随Cd处理质量浓度的增加而增加.小白菜的生物量、根长、株高、叶绿素质量分数随Cd处理质量浓度的增加显著降低(P<0.05),表明Cd抑制了小白菜的生长,破坏了叶绿素的合成.小白菜地上、地下部镉质量分数均随Cd处理质量浓度的增加而显著增加(P<0.05).当Cd处理质量浓度为15 mg·L-1,小白菜地上、地下部镉质量分数分别达到637.5、1 663.0 mg·kg-1,表明小白菜对Cd有良好的富集效果.小白菜根系与叶片中SH、GSH和PCs含量均随Cd处理质量浓度增加而增加的变化趋势,表明SH、GSH和PCs在解毒小白菜Cd毒害中起着重要作用.     

Pseudomonas sp.L19抗除草剂AHAS基因的克隆、表达及特性

乙酰羟酸合酶(AHAS)是磺酰脲类、咪唑啉酮类、三唑嘧啶类、磺酰胺类和嘧啶水杨酸类等乙酰羟酸合酶抑制剂类除草剂的作用靶标,获得能抗此类除草剂的AHAS突变基因资源具有非常重要的理论和应用价值.从长期使用甲磺隆的农田土壤中分离到1株对乙酰羟酸合酶抑制剂类除草剂有广谱抗性的菌株L19,根据表型特征、生理生化特性和16S rDNA序列系统发育分析,将其鉴定为假单孢菌属(Pseudomonas sp.).利用PCR技术从Pseudomonas sp.L19的总DNA中克隆AHAS基因,氨基酸序列比对结果表明,L19与对除草剂敏感菌株P.putida KT2440的AHAS调节亚基氨基酸序列完全相同,而催化亚基有4个氨基酸位点不同:[Val 29→Ala(L19→KT2440),Pro93→Ser,Val 345→Ala,Pro 484→Arg].分别将菌株L19与KT2440的AHAS催化亚基克隆到pET29a(+)的多克隆位点,构建了表达载体pET-L19AHASc和pET-KT2440AHASc,通过镍柱亲和层析纯化得到带有组氨酸标签的乙酰羟酸合酶.抗性试验结果表明菌株L19的乙酰羟酸合酶对四大类乙酰羟酸合酶抑制剂类除草剂的抗性均要强于KT2440的乙酰羟酸合酶,对甲磺隆、咪唑乙烟酸、唑嘧磺草胺和嘧草醚的抗性倍数分别达到53.6、9.3、8.2和9.5倍.菌株L19的乙酰羟酸合酶比活力、对ThDP和Mg2+的Kc值相应地比KT2440乙酰羟酸合酶的要低;而对底物丙酮酸钠的米氏常数Km值要比KT2440乙酰羟酸合酶的要高近1倍.