费氏中华根瘤菌lrp基因的克隆、突变与功能

通过分子克隆技术,从费氏中华根瘤菌(Sinorhizobium fredii)HN01基因组文库中克降到一个lrp基因.该基因与已报道的苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)1021的lrp基因在核苷酸水平上有89%相似性,在氨基酸水平上有99%相似性.利用自杀质粒pK18mob构建含有lrp基因部分片段的重组质粒,通过三亲本结合后导入原始菌株HN01中,经过同源单交换,获得发生正向插入突变的突变株GXHNLTA和反向插入突变的突变株GXHNLTB.将lrp基因ORF连接到载体pLAFR3上,获得用于互补的质粒pGXHNL100,将该质粒通过三亲本接合导入突变株中,获得互补株GXHNWA、GXHNWB.对野生型菌株、突变株、互补株进一步研究发现,在以脯氨酸、亮氨酸、丝氨酸等氨基酸为唯一碳、氮源的MM培养基中培养时,突变体GXHNLTA、GXHNLTB的生长均滞后于出发菌株HN01.植株试验表明,突变菌株GXHNLTA、GXHNLB比野生菌株HN01开始结瘤的时间提前1 d,在结瘤效率、单株瘤数、瘤重、固氮酶活性方面并无显著差别.     

豆豉纤溶酶在枯草杆菌WB800中的高水平表达

一个来源于豆豉产生菌DC12的新的纤溶酶基因序列被克隆测序.为了实现在枯草杆菌中高水平表达豆豉纤溶酶,将来源于枯草杆菌168的重叠启动子P43序列以及转录终止信号序列通过重叠延伸融合,将融合序列克隆到大肠杆菌-枯草杆菌穿梭载体pBE3中,构建了pBEP43载体.将豆豉纤溶酶基因插入到载体pBEP43后转化枯草杆菌WB800.结果表明,在P43启动子驱动下,豆豉纤溶酶基因在重组菌中的对数生长期和平衡期均获得了表达且分泌到培养基中.重组菌经培养后上清液中的纤溶酶活性最高达1270U/mL,是豆豉纤溶酶基因在自身启动子驱动下表达量的1.87倍和野生菌株枯草杆菌DC12表达量的4.1倍.图5参16     

费氏中华根瘤菌15142的cysDN基因克隆及其相关功能

为确定cysDN操纵子的功能及对根瘤菌结瘤的影响,通过三亲本接合,将质粒转座子pTnMod-RKm′随机插入费氏中华根瘤菌15142中,建成随机插入突变体库,随后通过含有不同硫源的MM培养基的筛选得到一株不能利用硫酸盐但能够利用半胱氨酸的突变体.进一步克隆和测序分析后发现该操纵子与已报道的Sinorhizobium sp.strain BR816的cysDN在核苷酸水平上有92%的相似性,在氨基酸水平上有96%的相似性.用自杀质粒pK18mob分别构建含有cysD部分片段和cysN部分片段的重组质粒,通过三亲本接合导入出发菌株15142中,经过同源单交换,分别获得cysD的pK18mob正反向插入突变株cysDF/15142以及cysDR/15142和cysN的pK18mob正反向插入突变株cysNF/15142与cysNR/15142.用广谱宿主质粒pLAFRJ载体连接完整操纵子cysDN构建互补质粒cysDN+pLAFRJ,将该质粒通过三亲本接合导入突变株中,获得互补菌株.用不同硫源的液体MM培养基培养,发现互补菌株能够补回突变菌株不能利用硫酸盐作为唯一硫源的缺陷,说明cysDN操纵子确实与硫酸盐同化途径有关;植株试验表明突变株比出发菌株推迟结瘤1~2 d,固氮酶活也比出发菌株稍低;竞争结瘤试验表明突变菌株占瘤率较差,但在平均瘤数、平均瘤重、平均植株干重上则无差异.     

用单个特异引物扩增桃ACC氧化酶cDNA及其在大肠杆菌中的表达

用单个特异引物和通用引物ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）１５从桃受伤叶片ｃＤＮＡ中扩增出１．３ｋｂ左右大小的片段．将该扩增产物克隆并对重组克隆作酶切分析发现至少可分为３类．用桃ＡＣＣ氧化酶基因组ＤＮＡ为探针进行点杂交表明,４,７,９,１０,１１,１２重组质粒能与之杂交,其中７,９,１０,１１,１２号重组质粒酶切图谱与已报导的桃果实成熟相关的ＡＣＣ氧化酶ｃＤＮＡ基因基本一致,而４号克隆则不同．ＤＮＡ序列分析和ＰＣＲ鉴定表明,插入片段均由５′端特异引物单个引物扩增出来,对７号重组克隆插入片段ＤＮＡ全序列分析表明,７号重组克隆插入片段全长１１４６ｂｐ,包含了除启始密码子外的全部编码区和１９２ｂｐ的３′端非编码区．通过补上起始密码子ＡＴＧ构建重组表达载体,在大肠杆菌中表达出３５×１０３的非融合蛋白     

费氏中华根瘤菌HN01的putA基因克隆

从快生型大豆根瘤菌费氏中华根瘤菌HN01的基因组文库中克隆到一个putA(脯氨酸脱氢酶)基因,该基因与已报道的苜蓿中华根瘤菌1021中putA基因在核苷酸和氨基酸水平上分别有82%和86%相似性.利用自杀性质粒pK18mob构建含有putA基因部分片段的重组质粒,通过三亲本结合导入出发菌株HN01中,获得正向插入的极性突变体GXHNPA和反向插入非极性突变体GXHNPB.将putA基因完整的ORF连接到广宿主载体pLAFRJ上,获得用于互补的质粒pGXHN37,通过三亲接合,将pLAFRJ导入GXHNPA和GXHNPB获得互补菌株GXHNPHA和GXHNPHB.对出发菌株、突变菌株、互补菌株进一步的研究发现,以脯氨酸为唯一C、N源的MM培养基中培养时,突变体均不能生长,互补菌株和野生型HN01没有差异,而在完全培养基YMB中培养时,突变菌株生长不受影响.植株实验发现,突变体均能有效结瘤,但是固氮酶活与出发菌株相比有所下降,结瘤时间延迟1d,竞争结瘤能力下降,而互补菌株与野生型HN01没有明显的差异.     

一个硫化叶菌病毒启动子的分离与鉴定

几乎所有古菌病毒基因组中无RNA聚合酶(RNA polymerase,RNAP)等组成基本转录装置的同源蛋白编码序列,而且启动子活性对病毒感染过程中病毒基因的转录上可能具有重要的影响.为进一步揭示古菌病毒基因启动子的序列结构特点和活性之间的关系,首先基于硫化叶菌质粒pSeSD,将β-半乳糖苷酶编码基因lacS克隆到阿拉伯糖启动子araS下游多克隆位点,构建重组表达载体pSeSD-lacS.将pSeSD-lacS转化冰岛硫化叶菌(Sulfolobus islandicus)E233S菌株后的功能分析结果表明,lacS基因成功表达.在此基础上,利用硫化叶菌病毒STSV2衣壳蛋白编码基因ORF37上游500bp的潜在启动子片段P37替换pSeSD-lacS中的araS启动子,构建出新的重组表达质粒pSeSD-P37-lacS,进一步将pSeSD-P37-lacS转化E233S菌株进行启动子活性分析.β-半乳糖苷酶酶活结果显示,诱导后araS启动子酶活为14 345.7±422.3 mU,P37酶活为13 723.1±370.9 mU,表明P37片段具有启动子功能,而且活性与araS启动子相当.序列分析也显示,P37具有与硫化叶菌基因启动子类似的基础序列元件initiator、TATA-box及BRE等.本研究表明pSeSD-lacS可作为一个硫化叶菌病毒基因启动子筛选载体,而且高活性的基因启动子可能在STSV2病毒生命过程具有重要的作用.(图4表1参27)     

含发光酶基因的转座子质粒载体的改造及向根瘤菌HN01的转座

将从自杀性重组质粒pDB30上分离的3．6kb含卡那霉素抗性基因和发光酶基因（luxAB）的BglⅡ酶切片段，克隆到小Mr的高拷贝质粒pIJ2925上，构成新的质粒，pHNLX1011；然后将pHNLX1011经BglⅡ部分酶切，酶连在含蔗糖酶基因（sacB）的自杀性重组质粒载体pMH1701上，载体分别采用BglⅡ酶切和BamHⅠ酶切．连接转化后共得到4种重组质粒类型的菌株，它们具有不同发光活性；将它们分别与快生型大豆根瘤菌HN01进行三亲本杂交，发现它们的转座频率均较pDB30高．对经转座标记后的根瘤菌进行发光活性检测，只有pHNC3质粒所转座的根瘤菌浇具有较强发光活性．所得发光根瘤菌衍生菌株能在野大豆和栽培大豆黑农39根际形成正常根瘤，能用X光片记录下根瘤的发光活性．     

假单胞菌表达载体pYMB03的构建与性能分析

恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)是具有强抗逆性能的环境优势菌,构建其质粒表达载体有着明显的应用潜力.将恶臭假单胞菌AB92019菌株中肽聚糖相关脂蛋白编码基因的启动子PoprL和质粒载体pTrcHis-B的多克隆位点片段插入到质粒载体pUCPl8的EcoRL/HInIII位点,获得了重组载体pYMB03.用绿色荧光基因gfp作为标记进行外源蛋白表达的结果表明,该载体能分别在恶臭假单胞菌AB92019菌株和大肠杆菌DH5a菌株中,由启动子PoprL启动组成型表达GFP蛋白并使细胞产生可见荧光.经SDS-PAGE验证,所产生的GFP蛋白分别占细胞总蛋白的12.5%和5.O%.重组菌株YMB001中GFP表达量与菌体培养时间有关,在稳定期后期其相对荧光强度达到最大值(D600nm=l.0),但与培养温度未见相父性.对携带该载体的2株重组恶臭假单胞菌7次168 h继代培养测定,载体pYMB03的稳定性均为100%.     

Ralstonia eutropha菌株镉抗性调节基因CzcR的克隆与序列测定

G-细菌镉抗性决定子是一个编码4个蛋白的CzcCBAD操纵子,参照GenBank已登录Czc基因序列进行引物设计,利用PCR技术,从可在含350mg/LCdCl2的培养基上生长的抗镉菌株Ralstoniaeutropha质粒中,扩增出长度约为1200bp的革兰氏阴性细菌镉抗性系统中的抗性调节基因CzcR,然后将其亚克隆到pGEM-T-easy载体上,并转化至受体菌中,构建重组质粒,采用碱性裂解法提取质粒DNA后,经EcoRI酶切分析和核苷酸序列分析,其与GenBank中登录的CzcR基因序列相似性高达98%,显示其具有正确的CzcR基因核苷酸序列。镉抗性基因的获得将大大推动对微生物抗重金属机理的研究,并为进一步构建耐镉基因工程菌,高效净化重金属污染环境打下坚实的基础。