环境因素对土壤中几种典型四环素抗性基因形成的影响

兽用四环素在养殖业中的大量使用导致了日益严重的环境污染,其诱导生成的抗性基因更可能产生比其自身污染更大的环境危害.本研究探讨了环境因素对几种典型四环素抗性基因(tetA、tetC)形成的影响,结果表明,温度、光照及pH能够对土壤中四环素抗性基因的形成产生显著的影响,在较为合适的温度条件(25℃)、光照条件(500 lx)和pH(7.5)条件下,土壤中四环素耐药菌菌落数和四环素抗性基因总含量均处于较高的水平,并多显著高于其他环境条件下的诱导水平(P<0.05),而高温、强光照及较高的pH条件能够有效抑制土壤中四环素抗性基因的形成,抑制的主要途径可能包括影响土壤中四环素的残留水平或直接影响抗性基因的生成,同时研究也发现这些不利的环境条件也抑制了土壤中四环素耐药菌的生长.进一步分析在两种不同通气处理条件下土壤中所诱导产生的四环素抗性基因含量水平与土壤中四环素耐药菌数量之间的关系,发现在两种条件下四环素抗性基因含量水平与土壤中四环素耐药菌数量之间存在着较为显著的正相关关系(R2好氧=0.7872,n=30;R2缺氧=0.8841,n=21),土壤中四环素耐药菌的生长对四环素抗性基因的形成也起到了关键性作用.     

连续施用发酵猪粪对土壤中四环素抗性基因数量的影响

为了研究连续施用发酵猪粪之后,土壤中抗性基因的数量以及发酵猪粪的施用量对土壤抗性基因的影响,采用实时荧光定量PCR方法,对稻麦轮作模式下连续6年施用4.5t/hm2和9.0t/hm2发酵猪粪的土壤进行了四环素抗性基因(TRGs)的检测和定量分析.在施用发酵猪粪的土壤中能够检测到9种TRGs.施用发酵猪粪显著增加了土壤中tet G、tet L、tet B(P)、tet O、tet W的绝对数量,其中tet B(P)、tet W、tet O的绝对数量受到了施肥用量的影响;而tet Z、tet C和tet S的绝对数量则没有受到施肥的影响.上述8种TRGs在同一施肥处理的0~5cm、5~10cm以及10~20cm土壤中的相对丰度分布均无显著差异.发酵猪粪的施用也显著增加了tet G、tet L、tet B(P)和tet O的相对丰度,但是仅有tet O的相对丰度受到了施肥用量的显著影响.本研究表明,在稻麦轮作模式下,农田土壤中的TRGs数量会受到发酵猪粪中残留TRGs的影响,连续施用该粪肥会显著增加土壤中tet G、tet L、tet B(P)和tet O的绝对数量和相对丰度.因此,需要优化畜禽粪堆肥发酵工艺,以减少抗性基因在粪肥中的残留.     

长期施用猪粪水稻土抗生素抗性基因污染研究

为了全面研究猪粪有机肥对水稻土抗生素抗性及分布格局的影响,选择295对抗生素抗性基因引物,采用高通量荧光定量PCR对水稻土中的抗生素抗性基因污染情况进行了研究.结果表明,未施用猪粪水稻土检测出66种抗性基因,而施用猪粪水稻土则检测出107种抗生素抗性基因,施用猪粪后水稻土中抗生素抗性基因种类显著增加(P<0.05).相对于未施用猪粪水稻土,施用猪粪水稻土有49种抗生素抗性基因丰度显著增加(P<0.05),其中施用猪粪水稻土中喹诺酮类/氯霉素类抗性基因的mexF的丰度相对于未施用猪粪水稻土增加1791倍.高通量定量结果表明,施用猪粪的水稻土抗生素抗性基因分布格局发生显著变化,高通量定量技术是研究环境抗生素抗性基因的一个非常实用的工具.     

污水处理厂二级出水中四环素抗性菌的生长特性与耐药性

抗生素抗性菌的扩散已成为全世界面临的重要公共卫生安全隐患.本文从某城市污水处理厂二级出水中分离出21株四环素抗性菌,对其种属、生理生化特性、抗生素耐受性进行了研究.结果表明,21株四环素抗性菌均属于肠杆菌科,分别属于气单胞菌属(9株)、埃希氏菌属(5株)、肠杆菌属(3株)、克雷伯氏菌属(2株)、柠檬酸杆菌属(1株)和哈夫尼菌属(1株).这些菌大多属于条件致病菌,且有18株携带质粒.21株四环素抗性菌中,气单胞菌、埃希氏菌的平均最大生长量显著高于肠杆菌,大部分菌株的迟滞时间在2 h以内.抗生素耐受性试验结果表明,四环素抗性菌对氯霉素耐受能力最强,对β-内酰胺酶类抗生素(青霉素、氨苄青霉素、头孢噻吩)的耐受性次之,对利福平的耐受性最弱.75%以上的四环素抗性菌同时表现出对其它5种抗生素具有抗性.以上结果为我国污水处理厂抗生素抗性菌的风险分析与控制提供了参考数据.     

畜禽粪便中多重耐药细菌及耐药基因的分布特征

为了解畜禽粪便中多重抗生素耐药细菌及耐药基因的污染特征,采用微生物培养的方法调查了鸡粪、猪粪中多重耐药细菌的数量,并挑取部分菌株进行16S rDNA鉴定和抗生素敏感性试验;进一步通过高通量测序技术解析多重耐药细菌的群落结构,利用高通量定量PCR对粪便中176种耐药基因的分布情况进行研究.结果表明,不同鸡粪、猪粪中对四环素、环丙沙星和庆大霉素同时耐药的多重耐药细菌比例在7.96%~12.40%;单菌株鉴定和群落结构分析均显示,可培养的多重耐药细菌主要集中在Escherichia(埃希氏杆菌属)、Acinetobacter(不动杆菌属)和Proteus(变形杆菌属)中.与未饲用抗生素的猪粪相比,猪粪样品中耐药基因的总富集倍数达到1.96×10~4~1.54×10~5倍,各类耐药基因的富集情况为:四环素类β-内酰胺类MLSB(大环内酯、林可酰胺和链阳性菌素B类)氨基糖苷类FCA(氟喹诺酮、喹诺酮、氟苯尼考、氯霉素和酰胺醇类)磺胺类万古霉素类.     

高温堆肥对猪粪中四环素类抗生素及抗性基因的影响

为了研究高温堆肥对猪粪中抗生素及抗生素抗性基因的影响,对不同堆肥处理中的四环素类抗生素(四环素、土霉素、金霉素)及其抗性基因(tetA、tetC、tetG、tetM、tetQ、tetW)的动态变化进行了定量研究.结果表明:低剂量组(10 mg·kg~(-1))中四环素、土霉素、金霉素的去除率分别为91%、94%、92%,高剂量组(50 mg·kg-1)中四环素、土霉素、金霉素的去除率分别为60%、62%、71%.在堆肥过程中,抗生素处理组目标基因相对丰度高于对照组,而低剂量组目标基因相对丰度(tetW除外)又普遍高于高剂量组.经堆肥处理后,tetA的相对丰度增加,tetC、tetG、tetM、tetQ、tetW的相对丰度均下降.高温堆肥可以有效去除猪粪中一定浓度的四环素类抗生素,并对四环素类抗性基因也有一定的削减作用.     

北京地区菜田土壤抗生素抗性基因的分布特征

为研究北京地区菜田土壤抗生素抗性基因(antibiotic resistance genes,ARGs)的污染状况和分布特征,采集了11个长期施用粪肥蔬菜基地的温室土壤和大田土壤,进行了抗生素以及ARGs种类和丰度的检测.结果表明,菜田土壤中四环素类抗生素残留量最高,其次为磺胺类抗生素,温室土壤抗生素残留普遍高于大田土壤.温室和大田土壤磺胺类抗性基因sul1、sul2和四环素类抗性基因tet L的检出率均为100%.温室土壤的Ⅰ类整合子(int I1)检出率比大田土壤高1.5倍.定量PCR的检测结果表明,菜田土壤中sul2和tet L的相对丰度介于10-4~10-2之间,温室土壤sul2和tet L的相对丰度普遍高于大田土壤.sul2的相对丰度与磺胺二甲嘧啶和强力霉素的含量显著正相关(P0.05),tet L相对丰度与抗生素含量无明显相关性(P0.05).本研究结果对于掌握北京地区农田土壤ARGs的污染现状,以及从ARGs角度评估农艺措施具有重要的指导意义.     

长江口近岸地区抗生素抗性基因与微生物群落分布特征

由于抗生素的大量使用,环境中微生物对抗生素的抗性不断增加,抗生素抗性基因(ARGs)问题越来越严重,严重威胁生态安全和人类健康.为研究长江口近岸地区水体和底泥沉积物中的ARGs和微生物群落的分布特征,通过野外调查采集了8个站点的水样和沉积物样本,对2种磺胺类抗性基因(sul1、sul2)、6种四环素类抗性基因(tetM、tetC、tetX、tetA、tetO、tetQ)、1种整合子基因intI1、16S rRNA基因和微生物群落进行检测分析.结果表明,长江口近岸地区10种抗性基因的检出率为100%.其中,整合子基因intI1和水样中多种ARGs呈显著正相关关系.变形菌门(Proteobacteria)和拟杆菌门(Bacteroidota)是长江口近岸地区水环境中的优势菌门;Chloroplast为水体中的主要菌属,Chloroplast和Nitrospira为沉积物中的主要菌属.在水体中,硝化螺旋菌门(Nitrospirota)是4种四环素类抗性基因(tetX、tetA、tetO和tetQ)共同的潜在宿主;在沉积物中,Sva0485是sul1和intI1的共同潜在宿主.微生物群落的分布...     

不同施肥措施对水稻土壤微生物镉抗性的影响

镉（Cd）是最常见的土壤重金属污染物之一,对植物和人体具有毒害作用,研究不同施肥条件下的土壤微生物Cd抗性水平,可以为有机肥改良重金属污染提供一定的理论依据.为了探讨施无机肥和有机肥对于微生物Cd抗性水平的影响,在中国江苏常州、江西上高和福建福州水稻种植区采集了施有机肥（猪粪）和无机肥的土壤样品及猪粪样品,利用功能基因芯片（GeoChip 5.0）技术,研究了土壤微生物Cd抗性功能基因的响应及影响Cd抗性功能微生物群落互作的因素.结果表明,施有机肥土壤中有效态Cd含量[（1.08±0.70）mg·kg^-1]显著低于施无机肥土壤[（3.75±1.22）mg·kg^-1]（P<0.05）.土壤及猪粪样品中共检测到639个Cd抗性功能基因,施有机肥土壤中微生物Cd抗性基因丰度高于施无机肥土壤;有效态Cd含量、含水率、pH和铵态氮含量是影响Cd抗性微生物分布的重要环境因素.对Cd抗性微生物分子生态网络分析表明,施无机肥条件下,pH、含水率和有效态Cd含量是影响功能微生物潜在互作关系的主要因素;施有机肥条件下,主要影响因素是全钾和含水率.相比较无机肥,施用有机肥提高了土壤中微生物的Cd抗性水平及耐Cd微生物分子生态网络中的正相互作用.     

施肥模式对设施土壤抗生素及抗性基因的影响

采集不同施肥模式下设施菜地表层土壤(0～20cm),对83种抗生素和203种抗性基因(ARGs)进行检测.结果表明,各处理组土壤中共检出14种抗生素、129种ARGs亚型和10种可移动遗传元件(MGEs).四环素类(TCs)是土壤中残留的主要抗生素,β-内酰胺类和多重耐药类抗性基因是主要的ARGs,放线菌门(Actinobacteria)、变形菌门(Proteobacteria)、绿弯菌门(Chloroflexi)和厚壁菌门(Firmicutes)是主要的细菌门.施肥增加了土壤中抗生素残留和ARGs的多样性及丰度,并且提高了土壤细菌群落α多样性.施用常量有机肥组抗生素、ARGs和MGEs相对丰度最大,有机肥减量可有效降低抗生素和ARGs污染程度,稻壳还田对控制抗生素和ARGs污染具有积极作用.设施菜地土壤中抗生素选择压力、细菌群落结构变化和MGEs是影响ARGs分布的驱动因素.     

富勒烯对PCR反应的抑制作用

以110bp单链DNA为模板,研究富勒烯(C60)对聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)的影响.实验结果表明,随着C60浓度的增加,PCR反应被显著抑制;将Taq DNA聚合酶、单链DNA模板与C60孵育后,其PCR扩增产物均显著减少;增加PCR反应体系中的Taq DNA聚合酶量,可消除C60的抑制作用,但增加起始单链DNA模板的数量,效应不明显,上述研究结果说明,C60不仅可抑制Taq DNA聚合酶活性,同时对DNA模板也具有一定的损伤作用.     

基于引物的湖泊沉积物氨氧化细菌PCR扩增策略比较

PCR扩增是检测环境中β-变形杆菌纲氨氧化细菌(β-AOB)群落的主要方法,但是引物的敏感性和特异性对结果具有关键影响.本研究首先比较了2组常用的β-AOB 16S rRNA基因引物,结果显示,在扩增一组不同性质湖泊沉积物样品时,βAMO引物均获得明亮的单一条带,但CTO引物则未能全部扩增.克隆及序列分析证实,βAMO引物扩增获得的序列均不属于β-AOB所在的Nitrosomonadales目,而CTO引物扩增获得的序列来自β-AOB中的Nitrosomonas europaea/"Nitrosococcus mobilis"分支.采用变性梯度凝胶电泳方法,对4种不同引物组合PCR策略扩增所得产物进行分析,发现以βAMO或16S rRNA通用引物结合CTO引物的巢式方案可以提高扩增的效率,且β-AOB的群落轮廓与CTO引物直接扩增方案高度相似.这些结果表明βAMO引物具有较高的敏感性但特异性较低,而CTO引物则相反.因此,特定巢式扩增方案既可提高扩增的效率,也能真实反映湖泊沉积物中β-AOB的群落轮廓,是较为理想的β-AOB研究方法.     

好氧堆肥高温期的嗜热真菌和嗜热放线菌群落结构

使用传统的培养方法和PCR-DGGE技术对好氧堆肥高温期的嗜热真菌和嗜热放线菌群落结构进行了研究.分别采用园林垃圾和餐厨垃圾作为堆肥原料,进行了20d好氧堆肥.高温期(≥50℃)持续了10d和8d.分别对2堆体高温期样品进行稀释平板混菌培养,真菌总数和放线菌总数均分别呈"降低-升高"和"升高-降低-升高"的趋势.同时提取微生物总DNA.分别使用真菌引物对(GC-NS7/NS8)和放线菌引物对(F243/GC-R513)从总DNA中成功扩增得到目标产物,对目标产物进行DGGE分离.传统培养法和DGGE图谱结果显示,不同堆体高温期的嗜热真菌和嗜热放线菌均表现出相似的变化规律,嗜热真菌优势菌比嗜热放线菌明显,但菌群总数比嗜热放线菌少.聚类分析结果表明,堆肥高温期嗜热真菌和嗜热放线菌分别以升温时56℃和58℃为界,分成2个明显的变化阶段,每阶段内部聚类关系较近.阶段间关系较远.温度对高温期真菌和放线菌具有明显的筛选作用.     

高温ASBR处理热水解污泥的梯度升温法启动试验研究

采用序批式运行方式、梯度升温方法进行了高温ASBR处理热水解污泥的启动实验.结果表明,梯度升温法能在131 d内较快地启动高温ASBR反应器.在3个梯度升温阶段中（35℃→40℃→47℃→53℃）,反应器的性能都出现了一定的波动,其中在中温→中温（35℃→40℃）、高温→高温（47℃→53℃）阶段出现的波动比较小,而在中温→高温（40℃→47℃）阶段反应器的产气量、甲烷含量、出水COD和反应器内微生物量都出现了较大的变化,反应器的性能波动较大,40℃和47℃分别为中温和高温的上限和下限.在反应器启动过程的稳态期,反应器的平均产气量为2.038 L/d,甲烷含量为72.0％,COD产气率（CH₄/COD_投入）为188.8　mL/g,TCOD和SCOD平均去除率分别为63.8％和83.3％.扫描电镜和DGGE分析结果表明,启动过程中反应器中的微生物形态和种类都发生了变化,启动初期（35℃）和稳定期（53℃）的优势菌种明显不同.     

Real Time PCR研究进展及其在海洋病原生物检测中的应用

Real Time PCR,即实时监测PCR扩增产物并进行解析的方法,目前已广泛应用于分子生物学研究的各个领域.Real Time PCR技术秉承及发展了普通PCR的快速、高灵敏度检出等优点,同时克服了普通PCR不能准确定量、容易污染等缺点,无需在反应结束后通过电泳操作确认扩增产物.目前,Real Time PCR可设计多对引物在同一反应体系中同时对多个靶基因进行扩增,实现多莺实时定量检测.Real Time PCR使PCR技术发生了质的飞跃,扩展了PCR技术的应用范畴,是一种具有划时代意义的技术.本文主要介绍Real Time PCR的主要原理、解析方法、技术发展趋势及其在海洋病原生物检测方面的应用.     

生活垃圾堆肥过程中细菌群落演替规律

应用PCR-DGGE技术研究生活垃圾堆肥过程中的细菌群落演替规律,对堆肥不同时期的宏基因组DNA进行提取,扩增16S rDNA的V3区,分析生活垃圾堆肥过程中细菌群落的变化. DGGE图谱表明,随着堆体温度的升高,DNA条带表现出了明显的动态变化,降温期出现了新的优势条带并趋于稳定,说明堆肥不同时期的细菌群落发生了更替. 对条带分布进行聚类分析,结果表明:以55 ℃为界,将14个堆肥样品划分为2个族,族间的相似性仅为13%,说明堆肥过程中常温期(<55 ℃)和高温期(>55 ℃)微生物群落结构差别较大. 对优势条带回收测序的结果表明:在升温期,堆肥堆体中检测到H. obtusa和人类排泄物中的细菌;但随着温度的升高,具有纤维素降解功能的嗜热微生物Clostridium thermocellum成为堆肥高温期的优势细菌;当堆体温度小于55 ℃时出现了大量的未培养微生物.      

固态发酵过程中微生物总DNA提取方法比较

为了分析固态发酵过程中微生物群落的多样性及演替情况,对比研究了从固态发酵中提取细菌和真菌DNA的3种方法--溶壁酶法、超声波法、液氮研磨 CTAB法.使用紫外分光光度计测定了由不同提取方法得到的DNA的产量与纯度;使用细菌16S rDNA基因通用引物(341F和907R)和真菌18S rDNA基因通用引物(NU-SSU-0817和NU-SSU-119)对DNA进行了PCR扩增;采用DGGE(变性梯度凝胶电泳)法对固态发酵中细菌和真菌的多样性进行了分析.结果显示,3种方法得到的粗提和纯化DNA长度均约为23 kb;细菌和真菌PCR产物长度分别约为586 bp和422 bp.细菌和真菌PCR产物的DGGE分析表明,3种方法提取的DNA所反映的微生物多样性比较一致;但紫外分光光度计测定结果表明溶壁酶法提取固态发酵中微生物总DNA产量最高,超声波法次之,液氮研磨 CTAB法最低.     

鱼类虹彩病毒PCR快速检测试剂盒的准确度评价及其应用

虹彩病毒对鱼类等水生动物有广泛的感染性,给世界水产养殖业造成了巨大的经济损失.针对已研制成功的一种鱼类虹彩病毒PCR快速检测试剂盒,本文对反映其检测准确程度的灵敏性和特异性两个指标进行了检测,并在多个待测鱼样本中进行了试用.结果表明,该试剂盒的检测灵敏度相当于30个病毒粒子,无非特异性扩增反应,适用于多鱼种虹彩病毒病的早期快速诊断、苗种检疫以及水质环境的监测.     

城市污水中人类星状病毒的检测及变化规律

人类星状病毒是典型的水媒病毒,可引起腹泻等疾病. 为了明确污水中人类星状病毒的分布及去除规律,利用常规PCR和定量PCR方法对西安市3个污水处理厂的进水和出水进行了为期1 a的监测;采用特异性引物,确立了人类星状病毒在环境水体中的定性PCR和荧光定量PCR的检测方法. 结果表明,人类星状病毒在进水和未消毒二级出水中呈较高的阳性率,分别为91.5%和36.6%. 经过核苷酸测序鉴定,人类星状病毒的主要血清型为HAst V-1和HAst V-4. 人类星状病毒在进水和未消毒二级出水中的平均浓度分别为1.47×104和1.03×103 copies/mL,污水处理厂对人类星状病毒的去除率为93.15%. 污水处理厂进水中人类星状病毒浓度呈季节性变化,春季和冬季较高,夏季和秋季较低,这一分布规律与该地区历年人类星状病毒的流行规律相似.