环境水体中肠道病原细菌定量PCR检测与膜过滤分析方法的比较

采用通用引物,通过实时荧光定量PCR方法(QPCR),对西安市5个地表水体中肠道病原细菌的细胞密度进行了分析.检测水样体积为100mL,分别于2006年3～6月取自水源水(黑河)、景观娱乐用水(大唐芙蓉园北湖和兴庆湖)、纳污河(浐河)和未消毒的二级出水(北石桥污水处理厂),并将QPCR检测结果与滤膜法(MF)测得的细菌总数、大肠菌群和粪大肠杆菌CFU结果进行了比较分析.5个水体(n=60)检测结果显示,QPCR检测结果是大肠菌群CFU的2.2～5倍,是粪大肠杆菌CFU的7～14倍.病原细菌检测的几何平均值范围,QPCR法在25～67000 CCE·100mL-1之间,MF法大肠菌群在3～45000 CFU·100mL-1之间,粪大肠菌群在0～3000 CFU·100mL-1之间(n=60).两种方法的检测结果使用Spearman秩相关法来计算,结果显示,QPCR检测结果与大肠菌群、细菌总数以及粪大肠杆菌CFU均呈现显著正相关,秩相关系数分别为r=0.983、r=0.908和r=0.948.     

基于PCR-DGGE和拟杆菌(Bacteroides)16S rRNA的岩溶地下水粪便污染来源示踪研究:以重庆南山老龙洞地下河系统为例

岩溶地下水的微生物污染日益严重,其来源的研究得到国际学术界的广泛关注.本研究以重庆南山老龙洞岩溶地下河系统为对象,采用滤膜法监测地下水中的总细菌、大肠杆菌、粪大肠菌及粪链球菌等微生物指标,以拟杆菌(Bacteriodes)为指示细菌,采用PCR-DGGE示踪地下水中大肠杆菌/粪大肠杆菌的来源.结果表明,老龙洞地下河流域各类细菌含量严重超标,总细菌数为10~2.9×10~7CFU·m L~(-1),大肠菌群总数达4.3~4.0×10~5CFU·m L~(-1),其中粪大肠菌群(FC)和粪链球菌(FS)分别最高达到1.1×10~6CFU·(100 m L)~(-1)、1.1×10~5CFU·(100 m L)~(-1);FC/FS多数为2以上,暗示流域地下水受人类粪便影响为主.地下水样和粪便样品的拟杆菌群落的PCR-DGGE比对分析表明地下水与人粪之间相似性为7.1%~69.1%,其中地下河出口处达到69.1%.地下水与猪粪之间相似性为1.1%~53.4%,地下河出口处仅为1.5%.因此,人类粪便为地下河污染的主要来源,猪粪污染为动物粪便污染的一部分,还存在其他动物粪便污染来源.此外,PCR-DGGE产物切胶测序发现大部分Bacteroides为人类肠道或粪便来源的细菌.     

城市地表水中肠道病原微生物与粪便污染指示菌的关系研究

本研究选择肠道病毒、伤寒沙门氏菌、志贺氏菌、大肠埃希氏菌作为城市水体中典型的肠道病原微生物,分别建立起相应的实时荧光定量PCR检测方法.对水源水、景观娱乐用水以及城市河流样品进行长期监测,考察典型肠道病原微生物的分布特征和变化规律.肠道病毒在各地表水体中都有检出,浓度大都在103copy·L-1以下.大肠埃希氏菌的含量在保护良好的水体和接纳城市污水的水体中有明显差别,而伤寒沙门氏菌和志贺氏菌通常出现在受粪便污染较重的水体中.统计学的分析结果显示各种水体中的肠道病原微生物检出浓度均符合对数正态分布规律.粪便污染指示菌与肠道病毒之间不存在显著的相关性,但却能在一定程度上反映典型肠道病原菌的存在情况.在大肠菌群或粪大肠菌群浓度为104CFU·L-1以上的样品中,伤寒沙门氏菌、志贺氏菌具有较高的阳性率.     

江苏如东滩涂环境中细菌总数和大肠菌群分布特征及污染评价

按照<海洋监测规范>相关方法要求,分别于2010年3月、5月对江苏如东滩涂文蛤产地环境中大肠菌群和细菌总数以及各环境因子进行调查检测,分析研究该环境中细菌总数和大肠菌群的分布特征、污染程度以及与各环境因子的相关性,并用单因子污染指数法评价其受大肠菌群污染状况.结果表明,表层海水细菌总数范围10～4.8×104/mL,平...     

污泥生物沥浸处理对病原物的杀灭效果影响

生物沥浸能够去除污泥中的重金属,同时可能对污泥中的病原物有一定的杀灭作用．通过测定沥浸过程中异养细菌总数及沥浸前后总大肠菌群和粪大肠菌群的变化,研究了生物沥浸作用去除城市污泥和制革污泥中的病原物的作用．结果表明,经过6～7 d的生物沥浸处理,城市污泥中的异养细菌总数从1.38×10⁸个/mL降为4.43×10⁶个/mL,制革污泥中的异养细菌总数从9.23×10⁵个/mL降为4.26×10⁴个/mL;总大肠菌群（TC）和粪大肠菌群（FC）的去除率达到99%以上;但蛔虫卵的死亡率并无明显变化．大肠菌群纯培养试验表明,沥浸过程中病原物的消减作用主要是由于沥浸作用产生的低pH环境,而与污泥中SO^2-₄和重金属浓度的升高无关．     

污水中大肠杆菌的酶联免疫检测方法研究

以城市污水处理厂二沉池出水为检测目标,比较了夹心法和直接法2种酶联免疫反应方式,分析包被抗体和酶标抗体浓度、菌液预处理等因素对检测灵敏度的影响,确定了ELISA的最佳工作条件.结果表明,检测大肠杆菌的线性区间为10CFU/mL～6×10⁴CFU/mL,最低检测限达到10CFU/mL.与传统检测方法相比,该技术具有操作简单,节省时间和费用,反应灵敏度高等优点.     

繁茂膜海绵生物修复养殖水体中病原体的初步研究

研究繁茂膜海绵(Hymeniacidon perleve)滤食近海养殖水体中病原体细菌.海绵处理海水24 h后,海水中总大肠菌群、弧菌和总细菌分别比初始数量降低55.%～91.%、55.%～96.%和25.%～95.%.海绵滤食总大肠菌群、弧菌和总细菌速率分别在4.～105./(h·g)、1.×104～3.×104/(h·g)和2.×106～48.×106/(h·g),且滤食速率随细菌初始数量的加大而增加.当初始细菌总数在55×104～250×104/mL范围内,海绵滤食细菌的速率与细菌初始数量成线性正相关,其斜率为0.2.     

管网多相界面下抗生素抗性菌的分布特征研究

以CDC生物膜反应器模拟给水管网输配系统,探究管网水相、生物膜相和颗粒物相三相界面下6种典型抗生素抗性细菌的分布特征.反应器稳定运行30d后,出水余氯从0.66mg/L下降到0.26mg/L,出水浊度和颗粒物浓度分别从进水的0.08NTU和377counts/mL增高至0.86NTU和4151counts/mL,出水水质变差.进水中仅有红霉素和氨苄西林的抗性细菌的数量较高,分别为36和99CFU/100mL,出水中,链霉素和氨苄西林的抗性细菌数量最高,分别为432和155CFU/100mL,远远高于进水中抗性细菌数量.生物膜相中异养菌总数和细胞总数达到了4089CFU/cm~2和1.5×10~6cells/cm~2,链霉素和红霉素的抗性细菌数量较高,为3432和2508CFU/cm~2,其抗性细菌比例分别达到了83.9%和61.4%.颗粒物相中,氯霉素和氨苄西林的抗性细菌比例较高,都在45%左右.生物膜和颗粒物都会给细菌提供一个安全稳定的生长场所,使细菌能够抵抗残留消毒剂和部分抗生素的抑制作用,更易产生耐药性,对人体健康的威胁也更大.     

工厂化养殖方斑东风螺消化道及养殖环境中细菌数量变动与理化因子的关系

为掌握秋冬季方斑东风螺养殖系统细菌数量变动情况及其与理化因子的关系,试验采用TCBS培养法分别检测方斑东风螺（Babylonia areolate）消化道及其养殖水体、底沙弧菌数量（Sediment Vibrio,SV）,用营养琼脂培养法检测螺消化道异养菌数量（Heterotrophic Bacteria of Alimentarytract,AHB）,用荧光显微镜法检测水体总细菌数量（Water Total Bacteria,WTB）,并对养殖理化因子（水温（T）、盐度（S）、pH、溶解氧（DO）、氨氮（AN）、亚硝酸盐氮（Nitrite））及底质营养盐（总氮（TN）、总磷（TP））进行监测。结果显示,消化道异养菌数量为4.3×104~5.9×106 CFU/g,弧菌（AlimentarytractVibrio,AV）为2.0×102~7.5×105 CFU/g;水体总细菌、水体弧菌（WaterVibrio,WV）数量分别为4.8×104~3.8×105 cells/mL、2.1×102~1.2×104 CFU/mL;底沙弧菌数量为6.0×104~1.9×106 CFU/g。消化道内异养菌及弧菌分别与亚硝酸盐氮呈极显著正相关（P < 0.01）,与pH、盐度均呈显著负相关（P < 0.05）;水体中总细菌数量与溶解氧呈显著负相关（P < 0.05）,弧菌与总磷呈显著负相关（P < 0.05）;底沙中弧菌数量与各理化因子无明显相关性。主成分分析（Principal component analysis,PCA）结果显示,东风螺消化道细菌、养殖水体总细菌及弧菌、底沙弧菌数量在秋季主要受温度、氨氮、亚硝酸盐氮的影响,而冬季受水体溶解氧的影响更多,在整个养殖期间,需加强对盐度及pH的监控。     

铜绿微囊藻与藻际细菌Ma-B1菌株的相互作用

藻与细菌通常共生于淡水生境,形成藻-菌共生体系,藻际细菌是水体生态系统中的重要组成部分,对藻的消长起重要的调控作用,但有关藻际微环境中藻与细菌的互作机制还不清楚. 采用传统的细菌平板培养方法,从太湖优势水华藻——铜绿微囊藻(Microcystis aeruginosa)细胞表面分离出一株藻际细菌Ma-B1,基于生理、生化试验和16S rRNA基因序列分析,初步鉴定为甲基营养芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus). 通过测定细胞生长,分析藻-菌相互作用机理. 结果表明:一定浓度(＞60 μg/mL)的Ma-B1的胞外代谢物可显著抑制铜绿微囊藻的生长(培养基为BG11,28 ℃/日,22 ℃/夜,3 000 lx,光暗比为14 h∶10 h);铜绿微囊藻的胞外滤液(500 μL/mL)对Ma-B1的生长有一定的促进作用,但其总滤液(500 μL/mL)显著促进Ma-B1的生长;Ma-B1细胞对铜绿微囊藻的生长没有显著影响,而高浓度(藻菌比10∶1)的铜绿微囊藻细胞则可显著抑制Ma-B1的生长. 铜绿微囊藻与Ma-B1之间存在复杂的相互抑制或促进关系,共同影响着藻、菌在自然水体生态系统中的消长.      

南海北部细菌丰度和细菌生产力分布及其与环境因子相关性

以2014年8月南海北部海水样品为研究对象,利用平板计数法和流式细胞仪计数法对南海北部表层和垂直海域可培养细菌和细菌总数分布状况进行研究,对细菌生产力进行测定,并结合环境因子进行相关性分析。结果表明:珠江口到南海北部海域,水平方向可培养细菌总数变化范围是3.70×102~1.42×103 CFU/mL,细菌总数变化范围是5.12×105~1.61×106 cells/mL,细菌生产力的变化范围是0.03~0.40 mg/m3/h;垂直方向上可培养细菌变化范围是1.08×103~9.00×103 CFU/mL,细菌生产力变化范围是0.01~0.08 mg/m3/h,其中表层海水中的细菌生产力明显高于底层。与环境因子相关性分析表明,水平方向上,影响南海北部表层海水细菌总数和细菌生产力的主要因素是温度、盐度、硝酸盐（NO₃-N）、硅酸盐（SiO₃-Si）、亚硝酸盐（NO₂-N）和磷酸盐（PO₄-P）（P < 0.05）;垂直方向上,影响南海北部可培养细菌总数的主要因素是NO₂-N（P < 0.05）,影响细菌生产力的主要影响因素是温度和盐度（P < 0.05）。可见,南海北部表层海水中细菌总数高于可培养细菌总数2~3个数量级,表明该海域表层海水存在大量不可培养细菌;细菌的生命活动在海水表层相较底层更为活跃。     

城市污水中病原性大肠埃希氏菌毒力基因eaeA和rfbE的实时荧光定量PCR检测

针对病原性大肠埃希氏菌EHEC和EPEC的毒力基因eaeA和rfbE,选用特异性引物,建立了实时荧光定量PCR检测方法. 利用从污水中分离出的目的核酸片段构建重组质粒,通过测序和BLAST比对分析,确定了PCR扩增的特异性. 将重组质粒作为模板,分别测定标准曲线,在eaeA基因模板量8.77～8.77×105 copy,rfbE基因模板量4.98～4.98×105copy的范围内,Ct(循环阈值)与模板量的对数值具有良好的线性关系〔R2为0.997(eaeA)和1.000(rfbE)〕. 结合膜吸附洗脱浓缩方法,对于实际水样,eaeA和rfbE基因的检测限分别为1.75×102和9.96×101copy/100 mL. 利用该方法对城市污水处理厂进、出水进行检测的结果显示,污水二级处理工艺对这2种毒力基因的去除效果明显.      

污水处理厂污泥细菌总数和粪大肠菌群的检测

分别采用《城市污水处理厂污泥检验方法》（CJ／T221—2005）中平皿计数法和多管发酵法检测分析呼和浩特市周边7个城镇污水处理厂、2个制药企业以及2个乳制品企业污泥中的细菌总教和粪大肠菌群茵值。结果显示：供试样品的细菌总数为1．0×10^6～1．3×10^8个／g,其中细菌含量最高的是乳制品企业l污泥样品,最低的是污水处理厂4污泥样品。粪大肠菌群菌值为2．0×10^5-5．4×10^8个／g,其中粪大肠茵群菌值最高的是污水处理厂2和污水处理厂5污泥样品,最低的是污水处理厂4和制药企业1污泥样品,乳制品企业污泥样品的粪大肠菌群茵值居中。     

不同时期条纹环沟藻可培养藻际细菌研究

通过梯度稀释法分离出条纹环沟藻5个生长时期的可培养藻际细菌,利用基于单菌落16S rDNA V3区序列测定对细菌进行了分子分类鉴定,与GenBank上的相似菌株序列构建了邻接系统发育树并计算遗传距离,同时对不同时期的细菌进行了定量分析.结果表明,在分离培养出的32株细菌中,有12株不同种属细菌.12株细菌分属于a-变形菌纲(Alphaproteobacteria)、g-变形菌纲(Gammaproteobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)和放线菌门(Actinobacteria)4大细菌类群,在种类和数量上均以α-变形菌纲为主,其次为g-变形菌纲和拟杆菌门.每个生长时期可培养藻际细菌的种类数为5~8种,其中稳定生长期细菌种类数较为丰富,而在迟滞期和衰亡后期细菌种类较少.从各时期的细菌总数来看,对数生长期细菌数量最低,仅为2.83×106CFU/mL;在衰亡前期细菌数量最高,达到1.72×109CFU/mL;衰亡后期虽然细菌数量有所降低,但仍达到1.37×108CFU/mL.聚类分析和多维尺度分析结果显示,衰亡前期细菌群落结构与其它时期差异较大,而藻细胞快速生长阶段的对数生长期和稳定生长期菌落结构相近.衰亡前期特异性菌株鲍氏不动杆菌(Acinetobacter baumannii)的大量出现,可能与藻类迅速进入衰亡阶段有关;而各个时期均出现的一株麦氏交替单胞菌(Alteromonas macleodii)可能对条纹环沟藻的种群竞争起作用.在条纹环沟藻不同生长时期藻际细菌的种类与数量有所差异,藻际细菌的群落结构可能对条纹环沟藻的生长、种群竞争以及赤潮的生消具有重要作用.     

通用引物PCR方法在地表水病原菌检测中的应用

为了探索通用引物PCR方法在地表水病原细菌检测中的应用价值,利用16S rRNA基因的高度保守性,设计并合成细菌的通用引物,采用合成的引物扩增参考菌株及西安市区不同地表水样,并对PCR产物分别进行序列测定及序列同源性分析,同时检测水样中的细菌总数和粪大肠杆菌浓度.结果显示,通用引物扩增4种参考菌株,320 bp处均可得到清晰的电泳条带,其特异性通过序列测定及同源性分析得到进一步验证;通用引物PCR可检出250 ng/L的埃希氏大肠杆菌标准菌株DNA,其PCR检测的灵敏度可达0.275 CFU/mL;用通用引物对西安市区不同地表水样进行PCR扩增,其中■河、兴庆湖、大唐芙蓉园北湖、北石桥污水处理厂出水样品320 bp处都得到了清晰的电泳条带,而黑河水样没有条带;与之相对应的粪大肠杆菌群检测结果显示,只有北石桥污水处理厂出水和兴庆湖水样有粪大肠杆菌检出.      

膜生物反应器处理城市污水的后续次氯酸钠消毒研究

针对膜生物反应器（membrane bioreactor,MBR）处理城市污水的后续次氯酸钠消毒,分别开展了不同氯的投加剂量对指示微生物（总大肠菌群和粪大肠菌群）的灭活效果、消毒副产物（disinfection by-products,DBPs）生成量以及消毒后出水发光菌急性毒性研究.结果表明,在工程应用中MBR处理工...     

臭氧氧化深度处理二级处理出水的研究

以某城市污水处理厂二级处理出水为原水,研究了臭氧氧化深度处理对水中残留有机物以及病原微生物的降解和去除效果.结果表明,臭氧投加量达到6mg/L时,DOC、UV254、色度的去除率分别为15.49%、36.36%、73.61%,环境激素类痕量有机物邻苯二甲酸二丁酯(DBP)和邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯(DEHP)的去除率分别为37.29%和14.6%,三维荧光光谱荧光峰的各区域有机物质平均去除率在80%以上,DBP出水浓度为2.64mg/L,DEHP出水浓度为1.4mg/L,满足《城市污水再生利用地下水回灌水质》(GB/T 19772-2005)的标准.臭氧投加量达到10mg/L时,出水中指示性微生物粪大肠菌群仍接近103CFU/L,5mg/L有效氯消毒后出水粪大肠菌群仍接近10CFU/L,6mg/L臭氧与5mg/L有效氯组合消毒出水的粪大肠菌群下降至3CFU/L,满足《城市污水再生利用景观环境用水水质》(GB/T 18921-2002)的标准.三卤甲烷(THMs)的生成量随着有效氯投加量的增加而增加,臭氧与氯组合消毒过程与氯单独消毒过程相比,THMs生成量减少了78.08%.     

城市污水厂MCR-1基因及其携带菌的污染

研究了南京某城市污水处理厂MCR-1基因及其携带菌的污染特征,从MCR-1的分布特征、影响因素及MCR-1携带菌的耐药特征等方面综合评价.结果发现MCR-1随处理流程丰度下降,去除率达83.6%,但其相对丰度在出水中显著升高,剩余污泥中含有高浓度MCR-1,浓度达2.88×10¹²copies/L.粘菌素耐药菌同样沿处理流程逐渐降低,出水降至53CFU/mL,去除率达99.98%,但在剩余污泥中浓度高达2.04×10⁵CFU/mL.相关性分析发现MCR-1丰度与氨氮含量呈正相关,而相对丰度与COD、总氮和硝酸盐含量呈负相关.耐药特征分析表明曝气池（CAST、MSBR）和曝气生物流化池（ABFT）中MCR-1携带菌可耐受较高浓度粘菌素,且污水处理使MCR-1携带菌对粘菌素的耐受能力提高.表明污水处理流程不但无法完全去除MCR-1及其携带菌,且导致耐药性风险提高.本研究可为评价污水中以MCR-1为代表的超级抗性基因的环境风险提供参考.