五氯酚对稀有鮈鲫胚胎毒性效应研究

研究五氯酚(PCP)对稀有鮈鲫(Gobiocypris rarus)胚胎的致畸和毒性效应.以7.5,30,60,120,250μg/L5个浓度的PCP对0hpf(hpf,受精卵孵出时间)的稀有鮈鲫胚胎进行暴露染毒,同时设置空白对照组、二甲基亚砜溶剂对照组和雌二醇(EE2,2.5ng/L)阳性对照组.在立体显微镜下观察整个胚胎的发育过程,统计胚胎的孵化率、96hpf相对存活率和各时期的畸形率,并利用半定量RT-PCR检测胚胎中CYP1A基因和p53基因mRNA的表达.结果表明,PCP暴露能延迟稀有鮈鲫胚胎发育,并造成胚胎卵凝结、心包囊肿、脊柱弯曲等多种畸形甚至死亡.随着PCP暴露浓度的升高,稀有鮈鲫胚胎的孵化率和96hpf相对存活率降低,各时期的畸形率增加,并呈现一定的浓度效应.稀有鮈鲫胚胎CYP1A基因和p53基因mRNA表达被显著诱导,并随PCP浓度的升高而增加.PCP对稀有鮈鲫胚胎发育表现为显著的毒性效应.稀有鮈鲫胚胎孵化率、96hpf相对存活率、各时期畸形率及CYP1A基因和p53基因的诱导表达可以作为评价PCP毒性作用的敏感指标.     

五氯酚对稀有鮈鲫卵黄蛋白原及p53的诱导效应

采用中国特有鱼种稀有鮈鲫为实验动物,研究五氯酚（PCP）对其肝脏卵黄蛋白原（VTG）、VTG基因及抑癌基因p53的诱导效应,评价PCP的内分泌干扰作用,并从蛋白和基因表达水平上筛选PCP检测的敏感生物标志物.1.5、15、40、80、120、150、160μg.L-1PCP暴露稀有鮈鲫,同时设置空白、溶剂对照和17α-雌二醇（EE2）阳性对照,运用SDS-PAGE,ELISA法检测经PCP暴露后稀有鮈鲫肝脏VTG蛋白的表达差异;克隆稀有鮈鲫新的VTG和p53基因序列片段,运用实时荧光定量PCR方法检测PCP暴露对基因表达的影响.结果表明,40、80、120、160μg.L-1PCP均能诱导雌雄稀有鮈鲫肝脏VTG蛋白的表达,具有显著的浓度-效应关系;1.5、15、150μg.L-1PCP暴露后,雄性稀有鮈鲫肝脏VTG和p53基因表达均明显升高,具有显著的浓度-效应和时间-效应关系.证明PCP具有雌激素效应,稀有鮈鲫肝脏的VTG蛋白、VTG及p53基因可作为PCP检测的敏感分子生物标志物.     

五氯酚对HeLa细胞毒性及DNA损伤的研究

以人宫颈癌HeLa细胞为研究对象,运用MTT法检测PCP处理后HeLa细胞的增长抑制率;通过测定细胞培养液中乳酸脱氢酶(LDH)的漏出率和总超氧化物歧化酶(SOD)的活性,评价PCP的细胞毒性作用;彗星实验检测HeLa细胞经不同浓度PCP处理后的DNA损伤.结果表明,PCP对HeLa细胞的半数抑制浓度(IC50)为66.59μmol.L-1;HeLa细胞在12.5、25、50、100和200μmol.L-1 PCP染毒条件下,LDH的漏出率随着染毒时间的增加逐渐增大,具有明显的时间-效应关系,在12.25、17.5和25μmol.L-1 PCP染毒下,细胞培养液中SOD的活性随着染毒时间的增加逐渐下降,存在显著的时间-效应关系,低浓度PCP(25μmol.L-1)显著增加细胞培养液中LDH的漏出率以及PCP(12.25μmol.L-1)显著降低总SOD的活性;PCP(实验浓度为6.25、12.5、25和50μmol.L-1)不会导致HeLa细胞DNA损伤.因此SOD和LDH可作为评价低浓度PCP毒性效应的敏感性生物标志物.     

稀有鮈鲫HMGR基因全长克隆及雄鱼经五氯酚暴露基因表达的分析

3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase,HMGR)是甲羟戊酸(mevalonic acid,MVA)途径中的第一个关键限速酶.克隆稀有鮈鲫HMGR基因全长,分析该基因在不同组织及雄鱼经不同浓度五氯酚(pentachlorophenol,PCP)暴露的表达差异,探索PCP对类固醇激素前体(胆固醇)合成水平基因转录调控的内分泌干扰机制.采用同源克隆策略及cDNA末端快速扩增技术(rapid-amplification of cDNA ends,RACE),从稀有鮈鲫肝脏中首次克隆得到3 101碱基(bp)的HMGR基因cDNA全长,基因命名为GrHMGR(GenBank accession No:KF885724).GrHMGR编码884个氨基酸,系统发育树分析表明,GrHMGR编码的蛋白与其他鱼类来源的HMGR氨基酸序列同源性较高.Real-time PCR分析表明GrHMGR的表达有组织特异性,在大脑,性腺和肝脏中均有表达,性腺中表达量最高.稀有鮈鲫雄鱼经不同浓度PCP暴露后,GrHMGR在大脑和性腺的表达随PCP浓度的增加显著下降,然而在肝脏组织中表达趋势有所不同.HMGR的表达下降会减少胆固醇的合成.说明PCP暴露会通过干扰稀有鮈鲫的胆固醇合成途径,进而对内分泌系统产生影响.     

稀有鮈鲫和日本青鳉肝细胞原代培养及其对2,3,7,8-TCDD的敏感性比较

利用胰酶消化和机械分散相结合的方法对稀有鮈鲫和日本青鳉的肝细胞进行分离和培养,测定了不同培养时间下两种原代培养肝细胞的活力,研究了两种原代培养肝细胞受到2,3,7,8-TCDD暴露后EROD活力变化的时间-和浓度-效应关系.结果表明,稀有鮈鲫和日本青鳉的肝细胞产率分别达到2.0×107cells.g-1和1.5×107cells.g-1,稀有鮈鲫原代肝细胞的活力可以稳定地保持5d,日本青鳉原代肝细胞的活力至少可以稳定地保持1周;不同浓度TCDD暴露后,两种鱼的原代肝细胞EROD活力变化均显示良好的时间-浓度-效应关系,TCDD诱导稀有鮈鲫和日本青鳉原代肝细胞EROD活力的最低可观察效应浓度(LOEC)分别为4pg.mL-1和1pg.mL-1;TCDD诱导日本青鳉原代肝细胞EROD活力的EC50值低于稀有鮈鲫.就原代肝细胞培养操作和对毒物胁迫的敏感性而言,日本青鳉优于稀有鮈鲫.     

CdSe/ZnS量子点对稀有鮈鲫胚胎发育的影响及其氧化应激作用

本研究以稀有鮈鲫(Gobiocypris rarus)为对象,研究了不同浓度CdSe/ZnS量子点(QDs)暴露下,稀有鮈鲫胚胎发育过程中自主运动频率、内心率和体长的变化,以及利用体内超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)作为毒性指标,反映CdSe/ZnS QDs暴露对稀有鮈鲫胚胎发育的氧化应激作用.结果显示:CdSe/ZnS QDs对稀有鮈鲫胚胎72 hpf(hours post fertilization)的半致死浓度(LC50)为319.629 nmol·L-1,96 hpf的半致畸浓度(EC50)为203.312 nmol·L-1.CdSe/ZnS QDs暴露不仅影响稀有鮈鲫胚胎死亡率、畸形率、自主运动频率、孵化时间和孵化率,而且使其内心率减缓、体长缩短,导致胚胎卵凝结,心包囊肿,出现脊椎弯曲等多种毒性现象.同时发现,CdSe/ZnS QDs暴露导致稀有鮈鲫体内MDA含量增加以及SOD活力的降低.这表明CdSe/ZnS QDs对稀有鮈鲫胚胎发育具有致畸、致死作用,而氧化应激可能是引起其胚胎致畸、致死的重要机制之一.     

溴氰菊酯对稀有鮈鲫早期生命阶段发育和内分泌干扰毒性

采用半静态水体暴露方式研究了水中溴氰菊酯对稀有鮈鲫早期生命阶段的发育毒性与内分泌干扰效应.结果表明,影响稀有鮈鲫胚胎孵化的LOEC (最低可观察效应浓度)>3.0μg/L;影响稀有鮈鲫仔鱼发育畸形和死亡指标的LOEC和NOEC (无可观察效应浓度)分别为1.0和0.33μg/L.低至0.04μg/L的溴氰菊酯暴露便可显著下调稀有鮈鲫幼鱼体内雄激素受体基因(AR)表达量并上调甲状腺激素受体基因(TRβ)表达量;0.11μg/L的溴氰菊酯暴露可以下调稀有鮈鲫幼鱼体内雄激素受体基因(AR)、雌激素受体基因(ER1、ER2b)和芳香烃受体基因(AhR1a)的表达量,并上调甲状腺激素受体基因(TRβ)表达量;0.33μg/L的溴氰菊酯可以下调稀有鮈鲫幼鱼体内雄激素受体基因(AR)、雌激素受体基因(ER1、ER2b)、芳香烃受体基因(AhR1a、AhR1b、AhR2)的表达量,并诱导甲状腺激素受体基因(TRβ)表达量的上调.上述作用浓度水平已经处于多个天然水体中溴氰菊酯的检出浓度范围,因此,关于水体残留溴氰菊酯对鱼类的内分泌干扰效应必须予以重视.     

邻苯二甲酸二(2-乙基已)酯(DEHP)对马氏珠母贝(Pinctada maetensii)胚胎发育的影响及DNA损伤

邻苯二甲酸二(2-乙基己)酯(DEHP)是一种常用的增塑剂,在环境中广泛存在。本研究以马氏珠母贝胚胎为研究对象,揭示DEHP短期胁迫对胚胎发育的影响及胚胎DNA损伤。结果显示:DEHP对D型面盘幼虫的发育有显著影响,同一浓度组的死亡率与时间呈正相关。在(4~32)mg/L浓度范围内,不同胁迫时间段,幼虫的死亡率随染毒浓度升高而上升,表现出明显的剂量-效应关系,说明DEHP暴露能影响马氏珠母贝D型面盘幼虫的发育,并可能对其种群结构产生不利影响。DEHP胁迫还能对胚胎 DNA造成明显损伤,随着DEHP染毒浓度的增大,彗星尾长(TL)、尾矩(OTM)明显增加,尾部DNA含量(T-DNA)上升,3个指标表现出良好的相关性,DNA的损伤与暴露浓度间存在明显的剂量-效应关系。研究结果表明马氏珠母贝D型面盘幼虫的发育和形态学变化、胚胎细胞的DNA的损伤可以作为反映海洋环境中DEHP污染早期预警的敏感生物标志物。     

左炔诺孕酮对稀有鮈鲫脂质代谢的干扰效应

为探究孕激素左炔诺孕酮（LNG）对鱼类脂质代谢的影响,将刚孵化的稀有鮈鲫仔鱼置于0.8和6.5ng/L LNG暴露6个月至性成熟,考察其生长指标、肝脏组织病理学变化、脂质和脂蛋白含量及脂质代谢相关基因的表达情况.结果显示：（1）0.8,6.5ng/L LNG暴露显著降低70dph稀有鮈鲫的体重和肥满度,且6.5ng/L LNG暴露显著降低180dph雌、雄鱼的体长或体重;（2）0.8,6.5ng/L LNG暴露导致180dph成鱼肝脏出现细胞空泡、肝细胞肿胀等损伤;（3）0.8,6.5ng/L LNG暴露显著降低180dph雌鱼肝脏中甘油三酯、胆固醇的含量,且6.5ng/L LNG暴露显著降低雌鱼血浆中甘油三酯的含量,但对雄鱼肝脏及血浆的脂质含量无显著影响;（4）0.8,6.5ng/L LNG暴露显著降低180dph雌鱼肝脏中脂肪酸合成酶基因（fasn） mRNA的表达水平,且6.5ng/L LNG暴露显著降低180dph雄鱼肝脏中fasn及乙酰辅酶A羧化酶基因（acaca） mRNA的表达水平.由此可见,LNG长期低剂量暴露可抑制稀有鮈鲫的生长、诱导肝细胞损伤、引起肝脏和血浆脂质含量发生性别差异性变化,并影响肝脏中脂质代谢相关基因的表达,表明LNG在低浓度下可干扰稀有鮈鲫的脂质代谢,提示LNG对鱼类种群具有较高的潜在生态风险.     

1-硝基芘和1, 2-萘醌的联合细胞毒性和致DNA损伤

以人肺上皮细胞A549为研究对象,运用MTT方法检测1-硝基芘(1-NP)处理后A549的细胞存活率;测定细胞培养液中乳酸脱氢酶(LDH)的漏出率,评价细胞膜损伤;运用彗星实验检测DNA损伤;通过荧光探针的方法测定细胞内产生的活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS).通过1,2-萘醌(1,2-NQ)预先染毒24 h,再使用1-NP染毒24 h的方法,评估1-NP和1,2-NQ对A549的联合细胞毒性和DNA损伤.结果表明,1-NP对A549暴露24 h和48 h的半致死浓度(LC50)分别为5.2μmol·L-1和2.8μmol·L-1.LC50随着染毒时间的增加而降低,提示暴露时间越长1-NP的细胞毒性越强.A549在1、2、3和4μmol·L-1浓度的1-NP染毒下,DNA损伤显著增强,ROS水平不断升高,呈现剂量-效应关系(P<0.05);但LDH漏出率无显著变化.1,2-NQ(5μmol·L-1)预染毒A549细胞24 h,能明显减弱1-NP造成的DNA损伤和ROS升高.结果说明,1,2-NQ预处理可能通过抑制1-NP暴露产生的ROS,从而降低A549的DNA的损伤.     

Evaluation of genotoxicity of combined soil pollution by cadmium and phenanthrene on earthworm

The DNA-damaging effects of the combined pollution of heavy metal and organic contamination on earthworms were evaluated by single cell gel electrophoresis （SCGE） assay. Earthworms Eisenia andrei were exposed to single or combined test compounds in different doses of cadmium （Cd） 5, 10, 50 mg/kg and phenanthrene （Phe） 0.5, 2.5, 12.5 mg/kg with a treatment of 14 d. In SCGE assay, isolated coelomcytes and electrophoresis were employed to determine DNA damage degree after a 14-d treatment by test compounds. The results showed that there was a significant statistical difference between earthworms treated with Cd combined Phe with them treated alone with Cd or Phe. The Olive tail moment （OTM） of SCGE assay using earthworm coelomcytes appears to be a sensitive biomarker for evaluating exposure to genotoxic compounds. These tests also revealed that the interaction between Cd and Phe to DNA damaging effects was negative, and was strongly dependent on the concentration of pollution. This study corresponds to exploratory phase in order to reveal interaction effects of heavy metal and organic contamination on earthworms and then to set up more in-depth analysis to increase progressively the understanding of the genotoxicity mechanisms involved.     

水体二价铜离子致蟾蜍蝌蚪DNA损伤和氧化损伤

为研究水体二价铜离子(Cu2 )暴露对蝌蚪造成的损伤,以常见的中华大蟾蜍蝌蚪为研究对象,采用标准水生生物毒性实验法,将蝌蚪暴露于0.029、0.037、0.049、0.075 mg·L-1的铜溶液中7d,检测蝌蚪血细胞DNA损伤及机体过氧化产物丙二醛(MDA)、还原型谷胱甘肽(GSH)的含量,以及超氧化物歧化酶(SOD)、谷肮甘肽过氧化物酶(GSH-Px)和过氧化氢酶(CAT)活性.结果表明,随铜暴露浓度的增加,蝌蚪血细胞DNA损伤、MDA和GSH含量与对照组比均有明显升高,且呈浓度-效应关系.蝌蚪SOD、CAT、GSH-Px酶活性也有显著改变;MDA、GSH、DNA损伤均呈线性关系(R2分别为0.9968、0.8997).上述结果表明,水体二价铜离子可导致蝌蚪的氧化损伤和DNA损伤.     

人造板材释放的甲醛所致遗传毒性的研究

进行了两方面的DNA损伤实验：(1)采用SCGE技术进行体外实验，观察甲醛对大鼠肝细胞和人血淋巴细胞DNA损伤作用；(2)采用微核技术进行体内实验，观察甲醛对活体小鼠的骨髓嗜多染红细胞的微核率诱导作用．结果表明在浓度为1．24mg/m^3、3．71mg/m^3时，不论是体内还是体外实验，甲醛对细胞DNA都有明显的损伤作用．SCGE实验结果还表明，高浓度的甲醛可能引起DNA交联．     

CuSO4对松江鲈肾细胞系的毒性效应

本文研究了不同浓度的CuSO₄对55-65代松江鲈肾细胞系的毒性效应。采用MTT法测得CuSO₄ 24 h LC₅₀为154.34 μmol/L。酶活力测定的结果显示:超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽-S-转移酶（GST）的活性在CuSO₄浓度为0~300 μmol/L时,随浓度的升高逐渐升高,在300 μmol/L时达到最大值;谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）的活性在CuSO₄浓度为100 μmol/L时达到最大值,随后随着CuSO₄浓度的降低逐渐降低。微核率随CuSO₄浓度增加而增加,最高达14.33‰,彗星实验发现在半致死浓度条件下松江鲈肾细胞拖尾率为54.00%、迁移长度18.41±2.94 μm,与对照组差异显著（p ＜0.05）。认为CuSO₄会引起细胞氧化酶活性的改变以及细胞核DNA损伤。松江鲈肾细胞系可以作为Cu2+污染的监测指标。     

燃料油水溶液对牙鲆幼鱼的细胞毒性及DNA损伤

海洋溢油污染是当前世界各国普遍关注的环境问题之一,本实验以牙鲆(Paralichthys olivaceus)幼鱼为受试生物,研究了低剂量燃料油水溶液暴露对牙鲆幼鱼肝脏和鳃组织中超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)、过氧化氢酶(Catalase,CAT)、过氧化物酶(Peroxidase,POD)、谷胱甘肽转硫酶(Glutathione S-transferase,GST)活性和脂质过氧化(Lipid peroxidation,LPO)水平、血细胞溶酶体膜稳定性的影响以及产生的DNA损伤。结果表明:(1)抗氧化酶活性及脂质过氧化水平对燃料油胁迫的响应存在明显的组织差异,且同一种酶活性在不同的时间对燃料油污染的响应也不同;(2)溶酶体膜稳定性随着燃料油浓度增大与实验时间的延长而降低(P0.05),解除污染后低浓度组(0.001 mg/L)恢复至对照组水平(P0.05),中(0.010 mg/L)、高(0.100 mg/L)浓度组则不能恢复至对照组水平(P0.05);(3)燃料油暴露可使牙鲆血细胞DNA受到明显损伤,染毒第15 d,低浓度组组与中浓度组血细胞DNA损伤为中度损伤,高浓度组为重度损伤,解除污染6 d后,低浓度组与中浓度组组恢复至轻度损伤,高浓度组恢复至中度损伤。因此,燃料油污染会对牙鲆造成脂质过氧化损伤,影响血细胞溶酶体膜的稳定性,最终对生物产生遗传损伤。     

镉致黑斑蛙肝脏中ROS生成及其蛋白质氧化损伤作用

在实验条件下,将健康性成熟黑斑蛙(Rana nigromaculata)暴露于0.005、0.010、0.050和0.100mg·L-1浓度的镉溶液中30d,采用2,4二硝基苯肼比色法测定肝组织蛋白质羰基含量,KCl-SDS沉淀法测定DNA-蛋白质交联含量,并测定了肝组织中活性氧自由基(ROS)的水平,以探讨镉对黑斑蛙肝组织蛋白质的氧化损伤作用及其作用机制.结果表明,随染镉浓度的增加,黑斑蛙肝线粒体中的ROS水平明显升高,各染毒组与对照组相比有显著性差异;肝蛋白质羰基(PCO)含量和DNA-蛋白质交联(DPC)也随镉暴露浓度的增加而升高,且均呈明显的浓度-效应关系,但这种升高仅在镉浓度为0.05、0.10mg.L-1时才具有显著意义.结果还显示,低浓度镉的长期暴露可引起黑斑蛙肝蛋白质氧化损伤和DNA损伤,诱导产生大量自由基可能是导致蛋白质和DNA产生损伤的主要机制之一.     

氨基酚类化合物对鲤鱼(Cyprinus caprio)肾细胞遗传毒性的影响

应用彗星试验技术,通过检测分级与分析软件相结合的方法,研究氨基酚类化合物在鲤鱼体内暴露72h后对其肾脏细胞DNA的遗传毒性。结果表明:3种氨基酚类化合物均能引起不同程度的DNA损伤,其损伤程度随剂量的增加而增加;与溶剂对照组相比,存在显著或极显著差异(P<0 05,P<0 01);同时,4个损伤指标AU,TDNA,MT及MOT显示了较好的一致性;结果也表明3种化合物所表现出的基因毒性差异可能与其结构有关。试验表明鱼类肾细胞彗星试验在环境质量监测中有较大的应用前景。      

胜利原油对半滑舌鳎幼鱼肝脏过氧化物酶、溶菌酶和鳃丝Na+-K+-ATPase活力的影响

在实验室条件下研究了浓度分别为0、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6和3.2 mg/L胜利原油暴露1、2、4、8、15 d以及解除污染1 d和3 d后对半滑舌鳎幼鱼肝脏过氧化物酶(POD)、溶菌酶(LSZ)和鳃丝Na+-K+-ATPase活力的影响。结果表明:在曝油15 d内,(1)原油浓度0.1、0.2、0.4和0.8 mg/L组肝脏POD活力呈峰值变化,先增大后减小,第8 d时升高到最大值,而原油浓度1.6和3.2 mg/L组肝脏POD活力先减小后增大,第8 d时降低至最小值。(2)原油浓度3.2 mg/L组肝脏LSZ活力先减小后增大,第8 d时降低至最小值,其它实验组肝脏LSZ活力先增大后减小,第2 d时达到最大值,第4 d后趋于稳定。(3)原油浓度0.1 mg/L组鳃丝Na+-K+-ATPase活力与对照组无显著差异(P>0.05),原油高浓度组3.2 mg/L组鳃丝Na+-K+-ATPase活力呈波动变化,其他各实验组鳃丝Na+-K+-ATPase活力先减小后增大,各组均在第1 d降低至最小值。另外恢复3 d后各实验组3种酶活力都能恢复至初始水平,与对照组无显著差异(P>0.05)。因此,3种酶相结合有望成为石油类污染的生物标志物。