广东沿海养殖牡蛎中副溶血性弧菌的污染状况、毒力基因及耐药性分析

对广东沿海养殖牡蛎中副溶血性弧菌的污染状况、毒力基因携带情况和耐药特征进行研究。结果显示,320份牡蛎中副溶血性弧菌检出率为18.8%,不同季节和不同地区差异显著;分离得到60株副溶血性弧菌,均检出tlh基因,未检出tdh和trh基因;26种药敏分析发现,分离株普遍对氨苄西林耐药,耐药率为83.3%,对哌拉西林、四环素和呋喃妥因等8种抗生素的耐药率介于1.67%～11.7%。所有菌株对头孢泊肟、亚胺培南、阿米卡星等12种抗生素敏感;分离株的多重耐药率为3.33%,其中1株菌出现耐受7种抗生素的多重耐药。结果表明,广东沿海养殖牡蛎的副溶血性弧菌污染程度在不同地区及季节存在显著差异,分离株的致病风险较低并呈现不同程度的耐药性,其中惠州地区养殖牡蛎中副溶血性弧菌污染及耐药程度相对较高。     

大连星海浴场中大肠杆菌耐药性分析

研究了大连星海浴场中大肠杆菌的耐药性,对从海水中分离出的36株疑似大肠杆菌进行生理生化鉴定和分子学鉴定发现8株为大肠杆菌,并采用K-B纸片法测定了其对12种常见抗生素的耐药性。药敏实验结果显示,所有大肠杆菌菌株均表现出耐药性,并对12种所选抗生素中的10种抗生素的耐药率超过了50%,其中,对利福平的耐药率为100%;而对复方新诺明,氯霉素的耐药率分别为37.5%和25%。通过分析大肠杆菌耐药谱发现,100%的大肠杆菌菌株表现出了多重耐药性,其中,87.5%的大肠杆菌对3种及其以上的抗生素表现出抗性。上述结果表明大连星海浴场中大肠杆菌的多重耐药状况严重。     

军曹鱼养殖水体及其肠道异养细菌的耐药性研究

选用常用的15种抗生素,通过纸片扩散法(Kirby-Bauer纸片扩散法,简称K-B法),参照NCCLS抗生素敏感试验操作标准,并以金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus ATCC25923和大肠埃希菌Esсheriсhia coli ATCC25922为质控菌株,对周年监测分离自养殖军曹鱼水体及肠道的188株优势菌(包含9个菌属)进行了药物敏感性研究.结果显示,抑菌最强的是环丙沙星(耐药率为0),其次是氯霉素、诺氟沙星、庆大霉素、多粘菌素B、复方新诺明,耐药率均小于40%;抑菌效果最差的依次为羧苄青霉素、青霉素G、氨苄青霉素、痢特灵、利福平,耐药率均在40%以上,其中多重耐药的菌株(对4种或4种以上抗生素产生耐药性)共12株,包括水体菌9株和肠道菌3株.     

水产致病菌耐药基因的研究

采用纸片扩散法(Kirby-Bauer法)研究不同来源的54株水产细菌对10种抗生素的敏感性,筛选获得耐药菌株并研究其耐药基因。根据GenBank中注册的耐药基因序列,针对不同抗生素的耐药基因设计相应的引物,对耐药基因进行扩增,检测耐药菌株中耐药基因的分布。结果由54个受试菌株中检测出42个耐药株,耐药率为77.8%。其中37株对3种以上抗生素产生耐药,多重耐药率为68.5%。以耐药菌株质粒为模板,扩增磺胺类耐药基因sul2、氯霉素耐药基因cat1、cat2、cat3、cat4、卡那霉素耐药基因aadB、喹诺酮耐药基因gyrA,结果显示:sul2基因阳性9株,3株氯霉素cat2阳性,4株氯霉素cat3阳性,1株氯霉素cat4阳性,3株aadB阳性。质粒上耐药基因的检出率分别为50%、27%、36%、9%、60%。     

北极新奥尔松地区粪土中大肠杆菌和肠球菌的分布及耐药性分析

采用滤膜法对2012年北极黄河站科学考察采集的新奥尔松地区8个鹿粪和1个鸟粪样品进行分离鉴定,共获得84株肠球菌和85株大肠杆菌。84株肠球菌分属于10个属,其中屎肠球菌（28株）、鼠肠球菌（28株）及鸟肠球菌（10株）为优势菌。采用K-B纸片法对受试菌株进行药敏试验结果显示:85株大肠杆菌对利福平全部耐药,对氨苄西林的耐药率为81%;对甲氧苄啶（TMP）、喹诺酮类的萘啶酸（NAL）与环丙沙星（CIP）、四环素（TCY）4种抗生素高度敏感。84株肠球菌中屎肠球菌对氨苄西林耐药率最高（89%）,对万古霉素耐药率最低（4%）。10株鸟肠球菌对利福平全部耐药,而28株鼠肠球菌对利福平耐药率最低（4%）,对链霉素耐药率最高（75%）。18株其他肠球菌对利福平耐药率最高（61%）。上述结果表明抗生素耐药性已出现于北极新奥尔松地区野生动物肠道菌群中。     

近江牡蛎Crassostrea hongkongensis体内细菌的周年变化及细菌产酶能力

对近江牡蛎体内异养细菌进行1周年的监测(2010年1月～2010年12月),分离得到的异养菌(180株)鉴定到属,并检测产生蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶的能力。结果显示,正常贝体内异养菌和弧菌数分别为7.3×103～6.6×104CFU/g和8.0×10～8.2×103CFU/g,随机分离的菌株分属肠杆菌科的部分属Enterbacteriaceae、弧菌属Vibrio、气单胞菌属Aeromonas、假单胞菌属Pseudomonas、葡萄球菌属Staphylococcus、发光杆菌属Photobacterium、无色杆菌属Achromobacter、芽孢杆菌属Bacillus等。产酶试验结果表明,正常贝体分泌蛋白酶和纤维素酶的菌株数量最高出现于9月份,产酶菌株比例分别高达91.7%和63.9%,分泌淀粉酶和脂肪酶菌株数量高峰出现于7月份,产酶菌株比例均达81.8%,其中15株能同时分泌这4种酶。     

南海高效石油降解菌的筛选及降解特性研究

以南海10个采样点采集到的样品为研究材料,以石油降解率为筛选依据,初筛获得52株石油降解菌,从中进一步筛选出6株对石油烃有降解能力的细菌,通过16S rRNA序列分析对筛选得到的6株菌进行初步鉴定,并使用GC-MS内标法测定降解产物,对降解菌的降解特性进行进一步研究.结果表明,采用重量法筛选出来的6株细菌对石油的降解率为20%～55%.与Genbank中的16S rRNA基因序列BLAST对比结果显示,所筛选出的6株菌株中,3株菌株属于芽孢杆菌属(Bacillus),2株菌株属于假交替单胞菌属(Pseudoalteromonas),1株属于交替单胞菌属(Alteromonas).降解特性分析表明,所筛选6株菌的烷烃降解率均在40%以上,多环芳烃降解率均在70%以上,其中,菌株B08500m-3对石油中总烷烃和总芳香烃的降解效果较好,降解率分别为75%和87%.     

军曹鱼肠道细菌及其产酶能力的研究

对军曹鱼Rachycentron canadum Linnaeus肠道异养细菌进行一周年的监测,分离得到的94株优势菌(2004年4月～2005年3月)鉴定到属,并检测产生蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶的能力.结果显示,鱼肠道异养菌和弧菌数分别为16.7～8.7×108 cfu/g和5.0～6.0×108 cfu/g.肠道异养菌及弧菌的数量高峰均出现于6～7月份,并于12月份和次年2月份出现次高峰.94株优势菌分属假单胞菌属Pseudomonas、芽孢杆菌属Bacillus、气单胞菌属Aeromonas、肠杆菌科的部分属Enterbacteriaceae、弧菌属Vibrio等.产酶试验结果表明,能分泌蛋白酶的菌株占16.0%,18.1%分泌淀粉酶,37.2%分泌脂肪酶,其中8株能同时分泌这3种酶.产酶菌株总比例高达43.6%,可见军曹鱼的肠道细菌在其消化过程发挥重要作用.     

海洋环境中的致病性细菌——创伤弧菌

本文综述了近年来关于一种能使人类感染致病的海洋细菌——创伤弧菌(Vibrio vulnificus)的一些研究结果,对创伤弧菌的生化特征,导致的疾病和致病的机理及能力进行了描述和分析。还比较了海洋菌株和临床菌株(从病人化验物中分离出)产生致病毒素和动物试验的结果,结果表明,两者间没有差异。在受试的29株海洋创伤弧菌中,有25株同临床菌株一样对小白鼠致病;有约90％的海洋菌株与临床菌株一样产生致病的溶血素和细胞毒素。本文还探讨了该菌对抗菌药物的敏感性和防治方法。     

养殖鱼塘底泥微生物抗生素耐药基因分布分析

针对水产养殖中抗生素滥用引起微生物耐药基因污染的现象,本实验以杭州市某水产养殖区底泥样品为研究对象,测定了底泥样品中抗生素含量,并从其中分离出74株可培养细菌.采用PCR方法对分离菌株中磺胺类、四环素类、喹诺酮类、氯霉素类抗性基因(antibiotic resistance genes,ARGs)和整合子基因进行了检测.结果表明,除tet A(四环素类)耐药基因未被检出外,其余3种耐药基因及整合子基因均被检出,其中qnr S(喹诺酮类)耐药基因的检出率最高,为50.00%.另外,利用16S r DNA序列分析技术将分离菌株鉴定为12个属、19个种,包括环境中多种常见土著细菌及部分致病菌,其中气单胞菌(Aeromonas spp.)数量最多(29株),占分离菌株的39.19%.掌握水产养殖区中ARGs的污染现状,对控制其传播、保障食品安全和保护微生态环境具有重要指导意义.     

原油降解菌的筛选鉴定及降解特性的研究

实验从河北省唐山市柳赞镇冀东油田油井污水中筛选出8株以原油为唯一碳源的降解菌株(编号为T1-8),通过形态学特征观察以及16SrDNA分子生物学鉴定,确定这8个菌株分别为铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、Bacillus safensis、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、嗜冷杆菌(Psychrobacter pulmonis)、鲁氏不动杆菌(Acinetobacter lwoffii)、纺锤芽孢杆菌(Bacillus fusiformis)和洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cepacia)。采用无机盐培养基,以华北任丘油田原油为唯一碳源,分别对上述8种菌株进行原油降解能力测试,通过为期7d的降解,其相对应的降解率分别为67.14%、43.13%、30.37%、24.74%、43.00%、37.94%、55.28%和14.51%,而且其中的金黄色葡萄球菌和嗜冷杆菌对原油具有降解能力为首次报导。后续对铜绿假单胞菌进行了影响降解率的单因素实验,实验结果显示在pH为7、初始原油浓度为5g/L和菌液接种量1mL(约1.8×1010cfu/mL)时铜绿假单胞菌对原油的降解率达到其最大值67.14%。     

1株巢湖高效溶藻菌的分离鉴定及其溶藻特性研究

对巢湖水华期可分离纯化的菌株进行溶藻菌的筛选、溶藻特性研究和生物学鉴定。筛选出一批有明显溶藻作用的细菌,以3种蓝藻为研究对象,通过叶绿素a的测定,对其中5株溶藻菌的溶藻效率进行比较后,确定了1株高效溶藻菌C1138。通过将菌液经过4种处理(菌液、洗脱菌体、无菌滤液及加热滤液)后与蓝藻混合培养,确定溶藻作用方式。同时,初步探讨了菌液藻液浓度比例对溶藻效果的影响。最后对菌株C1138进行了分子生物学鉴定和PHB染色。结果显示:C1138菌株为Chitinimonas viridis,且PHB染色阳性。菌株C1138对3种蓝藻(FACHB-905、PCC 7806、FACHB-7942)均有显著的溶藻作用,溶藻效率均50%,且主要通过菌体的直接作用产生溶藻效果,菌株C1138菌体悬液以2/30的体积比加入铜绿微囊藻FACHB-905藻液的效果最佳,且第4天溶藻率达80%以上。     

染料脱色微生物的筛选及其脱色条件的研究

实验通过富集驯化培养,从南昌市某织染厂废水中筛选分离到14株细菌菌株,经测定14株菌株对染料直接大红具有不同程度的脱色能力。其中脱色率在50%以上的菌株有12株,占总菌株数的85.7%;脱色率在70%以上的有8株,占总菌株数的57.1%;脱色率在80%以上的有4株,占总菌株数的28.6%。菌株Z03的脱色率达84.2%,为脱色能力最强的菌株。试验以菌株Z03进行脱色条件研究。通过采取L(93)4正交设计方案,考虑温度、pH值、溶解氧和培养时间四因素。试验结果表明该菌株的最佳培养条件为温度35℃,pH7,装量40mL的厌氧条件,在该条件下,菌株Z03的脱色率达到89.6%。     

方斑东风螺“急性死亡症”病原及其毒力基因研究

为明确引起方斑东风螺（Babylonia areolata）"急性死亡症"的病原及相关的毒力因子,对"急性死亡症"疫区的方斑东风螺进行了病原分离纯化鉴定、人工感染试验等,经鉴定为塔氏弧菌（Vibrio tubiashii）。本实验以4株分离自发病方斑东风螺且具有不同程度毒力的塔氏弧菌及东风螺组织样品为研究对象,根据半数致死剂量（LD₅₀）确定菌株毒力大小依次为:BBXP1>FBC1>FB20>FB13,针对17种弧菌毒力相关基因进行了检测分析,结果显示强毒株BBXP1、FBC1中的毒力基因检出率最高,携带12种毒力基因,弱毒株FB13毒力基因检出率最低,携带7种,表明弧菌的致病性可能与其携带毒力基因的数量具有相关性。其中,不耐热溶血毒素基因tlh、胞外碱性丝氨酸蛋白酶基因asp、金属蛋白酶基因vtmp、几丁质外切酶基因chi36、锌金属蛋白酶基因vtpA、塔氏弧菌溶血素基因vthA在4株塔氏弧菌中检测均呈阳性,且仅在患有"急性死亡症"的东风螺组织样品中检测出,在健康的组织样品中未检测出。进一步通过实时荧光定量PCR方法检测此6种毒力基因在4株不同毒力的塔氏弧菌中的mRNA表达差异,结果显示,asp、vtpA的mRNA表达量与弧菌的毒力呈正相关,随着塔氏弧菌致病性的增强,vtpA、asp的mRNA表达量呈上升趋势,且菌株的半致死剂量LD₅₀与相对表达量具有显著相关性（r2=0.933,0.948;P < 0.05）;溶血素vthA的表达量则与弧菌的致病性呈现负相关,相关性并不显著（r2=0.2401;P < 0.05）,因此推测可能与其致病性关联不大;其它几种毒力基因的相对表达量与弧菌的毒力相关性不显著（P>0.05）,可见同种毒力因子在不同毒力的菌株中相对表达量存在差异,推测塔氏弧菌致病株在侵染螺体的过程主要由金属蛋白酶和丝氨酸蛋白酶发挥主导作用。     

降解偶氮染料耐盐菌GTY的分离鉴定及特性研究

通过定向驯化,从海底污泥中分离得到一株降解偶氮染料的耐盐新菌株GTY,通过形态特征、生理生化特性以及对16S rDNA序列(GenBank Accession No.DQ286727)进行同源比较,鉴定该菌株属于芽孢杆菌属(Gracilibacillus sp.,中国普通微生物菌种保藏中心CGMCC No.1528).生长特性和染料降解实验结果表明,菌株对链霉素和卡那霉素不敏感,耐盐度为0.5%～30%.其最适降解与生长条件为:pH=7～8,温度30℃,盐度10%～20%.同时该菌株对13种不同结构的染料具有脱色作用,多数脱色率在90%以上,说明其具有较好的脱色广谱性和实际应用基础.     

弧菌拮抗菌的筛选及其对凡纳滨对虾的抑菌防病作用

从海洋沉积物中分离到2株弧菌拮抗菌(H2和H4),经生理生化特性、16S rRNA基因序列分析分别鉴定为短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus H2)和地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis H4). H2和H4菌株均对需钠弧菌的生长有显著的抑制作用;但只有H2菌株在模拟养殖动物小肠环境中生长良好. 选择H2进行模拟试验(20尾凡纳滨对虾虾苗为1组).结果表明,对照组(不接种)虾苗存活32h,接种弧菌的试验组虾苗仅存活16h,同时接种H2菌株和弧菌的试验组虾苗存活48h,而仅接种H2菌株的试验组虾苗存活了72h,说明菌株H2可显著提高凡纳滨对虾的存活时间.现场试验中,100L养殖池中(50尾虾/池),分别接种0 (对照), 103, 104 CFU/mL的H2菌株并养殖14d,再用104 CFU/mL需钠弧菌处理14d.接种104 CFU/mL H2菌株的试验组,虾的死亡率仅为12.5%,显著低于对照组的30.8%(P0.05).     

高效石油降解菌群构建及降解性能

试验从受石油污染海水中分离出6株石油降解菌D3、T4、R4、T1、D4和R3,对单一菌株的降解能力进行了鉴定,采用等比混合的方式构建了混合菌群分析其降解性能。试验结果表明,T4受柴油浓度影响较小,T1和D3在柴油浓度为0.2%(v/v)时降解率最高,分别为78%和88%;R3和R4的降解率随柴油浓度的升高而上升,D4的降解率随柴油浓度的升高而下降。6种菌株构成的混合菌群的降解能力优于单一菌株,对C13~C19的组分几乎全部降解。二元混合菌T4/R4和R4/D3的实际降解率高于理论降解率,表现出较明显的协同作用。     

高效降解黑臭废水细菌的筛选及鉴定

以筛选出能够高效降解黑臭废水的更多细菌为目的,从不同重污染水体和底泥中筛选获得了多种细菌,并对其降解能力进行检测。净化实验结果表明,筛选出的50多株细菌中有12株对废水COD有明显的降解效果,降解率在45%以上;有4株菌对废水氨氮有明显的降解效果,降解率在30%以上,其中4号菌株对COD和氨氮都有很高的降解能力。经16SrRNA基因鉴定,4号菌株为不动杆菌属,由单因子优化实验得出4号菌株生长的最适条件为:温度30℃,pH7.5,转速180r/min,培养时间为22h时,微生物达到稳定期。在此条件下,4号菌株对自然黑臭废水COD和氨氮的降解率可达到92%和72%。     

不同构型人工湿地基质中土著菌的耐药性及整合子丰度调查

采用Kirby-Bauer纸片琼脂扩散法分析了夏、冬季节9个不同构型人工湿地中的葡萄球菌(Staphylococcus)、假单胞菌(Pseudomonas)两种土著菌对7种常用抗生素的耐药性,并通过荧光定量PCR检测人工湿地基质中Ⅰ型整合子(int1)的丰度.结果表明,共分离出的522株葡萄球菌和543株假单胞菌,约84%的菌株对所测试的抗生素具有耐药性,多重耐药率达到68%以上,MRI指数平均为0.22,与某些环境中人源或动物源细菌耐药水平相当,表明人工湿地基质土著菌具有较高水平的耐药性;两种土著菌对氨苄西林和复方新诺明的耐药率较高,四环素、庆大霉素和环丙沙星的耐药率均极低(3%),而对头孢他啶和氯霉素的耐药性呈现差别.湿地基质中int1基因的浓度为1.14×105~5.66×105copies·g-1,其相对丰度为0.54%~3.68%.季节和湿地工艺对细菌耐药和整合酶基因分布有较大影响.夏季2种细菌的抗生素耐药率、多重耐药指数和int1丰度均显著高于冬季;下行垂直流湿地中的抗生素耐药率、多重耐药指数(MRI)最高,而在水平潜流湿地中int1丰度最高.研究表明人工湿地基质的土著菌长期暴露在一定浓度抗生素和耐药肠道菌的生活污水环境下获得了耐药性,人工湿地中抗生素耐药菌和耐药基因的污染及环境风险不容忽视.     

甲醛降解功能菌的分离鉴定及降解特性

在小型实验填料塔内长满生物膜的陶粒上,以甲醛为唯一碳源和能源,分离纯化出具有降解甲醛能力的菌株,为后期研究生物降解甲醛的机理提供菌种来源。文章采用环境微生物研究方法,生理生化实验及16S rDNA序列分析进行菌种鉴定和分类;通过单因素(pH、接种量、甲醛浓度)实验,研究各因素对菌株降解甲醛的影响并以筛选出的菌株进行挂膜,建立新的填料塔系统。实验从填料塔内筛选出了两株甲醛降解菌,并分别命名为P_1、Q_1;经序列鉴定再结合菌落形态特征及生理生化实验,菌株P_1属于假单胞菌属(Pseudomonas),Q_1属于甲基营养菌属(Methylobacterium)。在含甲醛浓度300 mg/L的培养基中,相同培养条件下,菌株P_1在44 h内的甲醛降解率为92.8%,而菌株Q_1在28 h内的甲醛降解率为97.9%;当甲醛初始浓度700 mg/L时,菌株P_1、Q_1均能够完全降解溶液中的甲醛且菌株Q_1对较高浓度的甲醛耐受性好。两种混合的甲醛降解功能菌对甲醛气体净化效率可达99%以上,甲醛生化去除量于21 d后保持在16 mg/(L·h),表明填料塔的甲醛降解功能菌群挂膜成功,且填料塔对甲醛废气具有良好的净化效果。