甘蔗泛素结合酶基因的克隆与表达

为克隆鉴定甘蔗泛素结合酶基因(Sugarcane ubiquitin-conjugating enzyme,ScUBc E2)并探索其在激素信号通路和甘蔗与黑穗病互作过程中的作用,选择黑穗病菌胁迫下甘蔗抑制消减杂交文库(Suppression subtractive hybridization,SSH)中注释为泛素结合酶的差异表达EST序列为探针,结合电子克隆技术和RT-PCR技术,以甘蔗cDNA为模板进行泛素结合酶基因克隆.对克隆获得的序列进行生物信息学分析,并利用qRT-PCR技术分析该基因在甘蔗根、蔗髓、叶、芽中的组织特异性表达以及在黑穗病菌、茉莉酸甲酯(Methyl jasmonate,Me JA)、脱落酸(Abscisic acid,ABA)和水杨酸(Salicylic acid,SA)胁迫下的表达情况.最终克隆得到一条长度为699 bp的甘蔗泛素结合酶基因(ScUBc E2;Gen Bank accession number:KJ577594.1),该基因包含长度为447 bp的完整开放读码框,编码148个氨基酸.生物信息学分析结果显示,ScUBc E2编码的蛋白分子量(Mr)为16.507×10~3;无信号肽,为碱性不稳定的亲水蛋白;包含4个α螺旋、4个β折叠和一些无规则卷曲;第15位氨基酸为泛素化位点,74-89位氨基酸为活性位点;在进化过程中与高粱泛素结合酶基因的亲缘关系最近.qRT-PCR分析结果表明,ScUBc E2基因组成型表达,但在芽中的表达量最高;其表达在甘蔗感黑穗病基因型ROC22中受到黑穗病菌胁迫的抑制,在黑穗病抗病基因型YC05-179中则先被抑制,后被诱导;ScUBc E2基因受MeJA及SA诱导表达,对ABA胁迫的响应不明显.本研究表明,甘蔗ScUBc E2基因在抗病基因型和感病基因型甘蔗中存在不同表达模式,可能参与甘蔗与黑穗病菌的互作过程,有望为抗病育种分子标记提供潜在基因资源;同时,该基因受MeJA和SA外源激素胁迫后的表达模式,可为泛素-蛋白酶体途径及激素调控的信号转导在甘蔗与黑穗病菌互作过程中的作用提供一定的理论依据.     

甘蔗泛素结合酶基因的克隆与表达北大核心CSCD

为克隆鉴定甘蔗泛素结合酶基因（Sugarcane ubiquitin-conjugating enzyme,ScUBc E2）并探索其在激素信号通路和甘蔗与黑穗病互作过程中的作用,选择黑穗病菌胁迫下甘蔗抑制消减杂交文库（Suppression subtractive hybridization,SSH）中注释为泛素结合酶的差异表达EST序列为探针,结合电子克隆技术和RT-PCR技术,以甘蔗cDNA为模板进行泛素结合酶基因克隆.对克隆获得的序列进行生物信息学分析,并利用qRT-PCR技术分析该基因在甘蔗根、蔗髓、叶、芽中的组织特异性表达以及在黑穗病菌、茉莉酸甲酯（Methyl jasmonate,Me JA）、脱落酸（Abscisic acid,ABA）和水杨酸（Salicylic acid,SA）胁迫下的表达情况.最终克隆得到一条长度为699 bp的甘蔗泛素结合酶基因（ScUBc E2;Gen Bank accession number：KJ577594.1）,该基因包含长度为447 bp的完整开放读码框,编码148个氨基酸.生物信息学分析结果显示,ScUBc E2编码的蛋白分子量（Mr）为16.507×10^3;无信号肽,为碱性不稳定的亲水蛋白;包含4个α螺旋、4个β折叠和一些无规则卷曲;第15位氨基酸为泛素化位点,74-89位氨基酸为活性位点;在进化过程中与高粱泛素结合酶基因的亲缘关系最近.qRT-PCR分析结果表明,ScUBc E2基因组成型表达,但在芽中的表达量最高;其表达在甘蔗感黑穗病基因型ROC22中受到黑穗病菌胁迫的抑制,在黑穗病抗病基因型YC05-179中则先被抑制,后被诱导;ScUBc E2基因受MeJA及SA诱导表达,对ABA胁迫的响应不明显.本研究表明,甘蔗ScUBc E2基因在抗病基因型和感病基因型甘蔗中存在不同表达模式,可能参与甘蔗与黑穗病菌的互作过程,有望为抗病育种分子标记提供潜在基因资源;同时,该基因受MeJA和SA外源激素胁迫后的表达模式,可为泛素-蛋白酶体途径及激素调控的信号转导在甘蔗与黑穗病菌互作过程中的作用提供一定的理论依据.     

Cloning and expression of RING-finger E3 ubiquitin ligase CsSDIR1 gene in tea plant (Camellia sinensis)北大核心CSCD

Protein ubiquitination regulates many aspects of plant development and stress response. The RING-finger type E3 ubiquitin ligase SDIR1 (salt and drought induced ring finger 1) gene plays a key role in plant stress response. In this study, the full-length cDNA and the promoter sequences of CsSDIR1 were isolated from tea plants using the RT-PCR technology, and its bioinformatics characteristics were systematically analyzed. The expression patterns of CsSDIR1 in various tissues and in response to cold, drought, salt, and ABA treatments were also investigated by quantitative real-time RT-PCR (qRT-PCR). The sequence of CsSDIR1 contains a complete open reading frame of 831 bp, coding for a 276-long amino acid protein with a molecular weight of (Mr) 30.085 × 103 and a theoretical isoelectric point of 6.54. CsSDIR1 was predicted to be a hydrophobic protein localized on the intracellular membranes. The analysis of the amino acid sequence characteristics showed that CsSDIR1 contains two putative transmembrane domains at the N-terminus and a C3H2C3 RING-finger domain at the C-terminus; it shares high similarity with other plants' SDIR1, and has the closest relationship to Actinidia sinensis. A cis-acting regulatory elements prediction showed that the CsSDIR1 promoter contains many cis-acting elements, especially drought and salt stress response elements. The qRT-PCR analysis indicated that the CsSDIR1 gene has a high expression level in stems, followed by roots, leaves, and flowers; the expression of the CsSDIR1 gene is up-regulated by ABA, salt, and drought treatments, whereas it is down-regulated in response to cold stress. These results demonstrated that the CsSDIR1 gene might be involved in the plant stress response of tea trees. © 2018 Science Press. All rights reserved.     

茶树CSD1基因及其启动子克隆与低温胁迫下的表达

低温寒害严重影响茶树的生长发育状况及成品茶品质,Copper/zinc-superoxide dismutase(CSD)基因在植物抗胁迫响应中起着关键作用.为了解茶树CSD基因(CsCSD)响应低温胁迫的作用机制,以铁观音茶树叶片为供试材料,采用同源克隆结合RACE方法及染色体步移法,获得茶树CSD1基因的cDNA序列(GenBank登录号:KR078346)、gDNA序列及其启动子序列,并对其进行生物信息学分析,同时对低温胁迫处理下CsCSD1基因的表达模式也进行分析.结果显示,茶树CsCSD1基因cDNA全长860 bp,完整的开放阅读框(ORF)长度为459 bp,共编码152个氨基酸;gDNA基因结构分析发现CsCSD1基因由6个外显子和5个内含子构成;CpG岛预测发现启动子区域内存在1个CpG岛,CpG长度为219bp,GC含量为50.3%;CsCSD1启动子上还存在大量的顺式作用元件,包括光响应元件、激素响应元件、胁迫响应元件和其他响应元件;在低温胁迫下CsCSD1基因的表达模式显示,在低温胁迫前期,CsCSD1基因表达上调;随后CsCSD1基因的表达量不断下降.本研究表明,CsCSD1基因能够响应低温胁迫并在胁迫的不同时期发挥不同的作用,推测与低温胁迫密切相关.     

矮牵牛花香基因BSMT3的cDNA克隆与表达特征分析

以矮牵牛花瓣总RNA为模板,RT-PCR方法克隆得到其BSMTcDNA,全长1100bp,编码357aa,与已有报道phBSMT1(GenBank No.AA0501)和phBSMT2(AAO45013)的同源性分别达到97.76%和98.6%,该序列在Gen-Bank登录号为DQ494491,命名为phBSMT3.构建的BSMT3 cDNA的原核表达质粒pGBSMT转化BL21(DE3)E.coli,获得的重组菌株经0.01mol/LIPTG诱导后得到正确表达的GST-BSMT融合蛋白带,以纯化的重组表达蛋白免疫家兔获得其兔抗免疫血清.免疫组化研究结果证实,矮牵牛花香基因BSMT在花瓣、花管中的表达量较其它组织的表达量高.图5参24     

甘蔗乙醇脱氢酶基因的克隆与表达

乙醇脱氢酶基因(Alcohol dehydrogenase,ADH)在植物抵御涝害、冷害、干旱等逆境中起着重要作用.基于前期已构建的甘蔗受黑穗病菌胁迫后基因差异表达的抑制消减杂交(Suppression subtractive hybridization,SSH)文库,利用电子克隆和RT-PCR技术,从甘蔗品种ROC22中获得一条ADH基因的c DNA全长序列,命名为Sugarcane Alcohol Dehydrogenase(Sc ADH;Gen Bank登录号为KJ577593).生物信息学分析显示,Sc ADH基因全长为1 644 bp,含有1 140bp的开放阅读框,编码一个379个氨基酸的蛋白质.Sc ADH蛋白为稳定、亲水的酸性非分泌蛋白,定位于叶绿体基质上.蛋白二级结构元件多为无规则卷曲,具有典型的ADH蛋白结构域以及NAD和锌的结合位点.实时荧光定量PCR(Real-time quantitative PCR)表达分析表明,该基因在甘蔗各组织中组成型表达,其中根中表达量最高,而叶中的表达量最低.在SA和Me JA胁迫下,Sc ADH基因的表达趋势为"先扬后抑",均在胁迫6 h达到最大值,分别为对照的7.34倍和11.81倍.在ABA胁迫下,该基因均上调表达,在胁迫12 h达到最大值,为对照的5.53倍.在黑穗病菌胁迫下,该基因在感病品种ROC22中的表达受到抑制,而在抗病品种YC05-179中的表达模式为"先抑后扬".综上推测Sc ADH基因在甘蔗应答非生物胁迫和生物胁迫中发挥重要作用.     

烯酮还原酶基因的克隆与优化表达

烯酮/酯还原酶可以专一性地还原烯酮/酯中的碳碳双键,并引入两个手性中心,是手性化合物生物催化合成的重要酶类之一;在使用烯酮/酯还原酶进行全细胞手性分子生物催化合成中,其他还原酶的存在常导致副反应的产生.为研究烯酮/酯还原酶的理化性质、底物的专一性、产物的手性特点等,需要经过纯化的烯酮/酯还原酶.为此,根据烯酮还原酶(Enoate reductase,ERs,EC 1.3.1.31)的基因序列设计引物,以丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)ATCC824基因组DNA为模板,通过PCR扩增技术得到了目标酶的基因,目的片段全长为1 995 bp,共编码664个氨基酸,相对分子质量为73×103.将烯酮还原酶基因连接到pET-32a(+)上,构建表达质粒pET-32a(+)-ERs,并成功在Escherichia coli Rosetta(DE3)pLysS中表达.在摇床上优化的表达条件为:诱导温度为18℃,诱导起始时菌体D600 nm为0.6～0.8,转速为100 r/min,诱导剂IPTG浓度为0.1 mmol/L,诱导培养时间为12 h,表达的烯酮还原酶大部分以可溶性形式存在于菌体内.     

甘薯LEA2基因的克隆与表达分析

胚胎发育晚期丰富蛋白(Late embryogenesis abundant,LEA)是植物在逆境胁迫下产生的一种应激蛋白质,具有较高的亲水性和热稳定性,与植物抗逆功能密切相关,研究LEA家族基因对于甘薯抗逆性分子育种具有重要意义.通过对甘薯(徐薯18)转录组数据库搜寻时发现编码LEA2的转录本,随后对该转录本进行了克隆和测序分析,利用数字表达谱(Digital Gene Expression Profi ling,DGE)和半定量RT-PCR分析了Ib-LEA2在不同组织和不同发育阶段的表达图谱.为进一步了解Ib-LEA2在生物体响应盐胁迫中的作用,将Ib-LEA2连接原核表达载体pET-32a,用大肠杆菌BL21(DE3)菌株进行盐胁迫的耐受分析.结果显示:Ib-LEA2完整的开放阅读框(ORF)长度为942 bp,编码313个氨基酸残基.进一步研究发现,在甘薯组织内同时存在3个高度同源的LEA 2基因型(核苷酸序列99%),分别命名为Ib-LEA2a、Ib-LEA2b和Ib-LEA2c.数字表达谱和半定量RT-PCR的结果显示Ib-LEA2在不同组织和发育阶段具有不同的表达图谱,在茎中的表达量远远高于叶和根.大肠杆菌BL21(DE3)菌株盐胁迫的结果显示,较之对照菌株,表达Ib-LEA2的菌株能够更好地耐受高浓度的NaCl.研究表明,Ib-LEA2对盐胁迫有一定的响应能力,能够保护细胞免受高盐的毒害.     

龙眼DlAGO1基因启动子的克隆与表达

为了解启动子在龙眼AGO1基因（DlAGO1）表达调控中的作用,根据龙眼基因组数据,以龙眼胚性愈伤组织的DNA为模板克隆DlAGO1基因的启动子序列,利用Methprimer、BPDG和PlantCARE在线软件对该序列进行生物信息学分析,将该启动子序列定向替换pCAMBIA1300载体的CaMV35S启动子,构建DlAGO1基因启动子与GUS基因的融合表达载体,瞬时转化本氏烟烟草叶片,进行GUS组织化学染色分析,并用不同浓度的赤霉素（GA3）、茉莉酸甲酯（MeJA）、水杨酸（SA）和脱落酸（ABA）喷洒烟草叶片,用实时荧光定量仪（real-time quantitative PCR,RT-qPCR）分析不同浓度激素处理下GUS基因的相对表达情况.结果显示：分离克隆得到1 437 bp的DlAGO1基因启动子序列,该序列含有2个CpG岛分布区,2段核心启动子区域,还含有多种顺式元件,包括大量的TATA-box和CAAT-box核心元件以及GA3、MeJA、ABA、光、逆境、胚乳表达等响应元件;转基因烟草叶片被中度染色,ABA处理能够诱导DlAGO1启动子的活性.综上所述,龙眼DlAGO...     

香蕉MaMPK1基因的克隆与表达模式

为研究香蕉MAPK1的序列特征及其在不同激素处理、逆境胁迫下的表达趋势,以‘天宝蕉’为材料,采用RTPCR技术克隆MaMPK1并对其进行生物信息学分析和不同处理下的表达模式分析.结果显示该基因编码区长为1182bp,可编码393个氨基酸.其编码蛋白具有STKc_TEY_MAPK结构域,属于MAPK基因家族TEY亚型A亚家族,是不稳定的脂溶性亲水酸性蛋白,无信号肽和跨膜结构,有多个磷酸化位点.亚细胞定位预测结果显示MaMPK1主要定位于细胞核.蛋白互作预测结果显示该蛋白与HSFA4A存在互作,暗示其可能在香蕉抗热反应过程中发挥作用.启动子顺式作用元件预测结果显示MaMPK1启动子包含多种激素和逆境胁迫相关作用元件.定量分析结果显示MaMPK1的表达受SA、45℃、低温和盐胁迫抑制,受茉莉酸甲酯(MeJA)和枯萎病菌侵染诱导上调,在脱落酸(ABA)处理后期极显著上调表达.本研究表明MaMPK1广泛参与香蕉逆境胁迫应答.(图9表1参35)     

‘琯溪蜜柚’CmPAL基因的克隆与表达

为探究CmPAL基因在蜜柚果实发育过程中的作用与表达规律,以‘琯溪蜜柚’果实为材料,利用反转录PCR技术克隆了3个‘琯溪蜜柚’PAL基因,对它们所编码的蛋白进行了系列生物信息学分析,研究它们在‘琯溪蜜柚’及其两个芽变品种(‘红肉蜜柚’和‘三红蜜柚’)不同发育时期果实汁胞中的表达情况,对3种蜜柚汁胞木质素含量进行了测定.克隆所得到3个CmPAL基因,分别命名为CmPAL1、CmPAL3和CmPAL4,它们的cDNA长度分别为2 154 bp、2 160 bp和2 142 bp,编码717、719和713个氨基酸;生物信息学分析发现3个CmPAL含有相同的保守结构域,均有跨膜螺旋结构与磷酸化位点;进化树分析结果表明,CmPAL1、CmPAL3和CmPAL4分别与甜橙CsPAL1、CsPAL2和CsPAL4的亲缘关系最近,且都归于双子叶植物分组;实时定量PCR结果显示,CmPAL基因蜜柚果实发育过程中表达水平存在显著性差异,不同成员的表达水平和变化趋势各有所不同;相关性分析结果显示,CmPAL3的表达与蜜柚果实木质素的含量存在显著性相关.本研究表明CmPAL基因成员尤其是CmPAL3可能通过调控木质素代谢进而在蜜柚果实成熟过程中发挥较大作用.(图8表4参39)     

真鲷去毒相关基因cDNA序列的克隆与肝脏组成型表达分析

赤潮发生时产生的一些海洋生物毒素对人类和海洋动物的安全形成潜在的威胁甚至导致死亡.为从分子水平探讨鱼类中海洋藻毒素的去毒分子机理,采用RT-PCR法克隆了真鲷(Pagrus major)肝脏芳香烃受体核转位蛋白(ARNT)和I时相异生素代谢酶细胞色素P4501A(CYP1A)基因cDNA核心序列,同时,应用半定量RT-PCR方法,以β-肌动蛋白作为外参照,在其指数期增长的范围内研究了芳香烃受体(AHR)、ARNT、CYP1A、II时相异生素代谢酶alpha型谷胱甘肽S-转移酶(GSTA1、GSTA2)、rho型谷胱甘肽S-转移酶(GSTR)、热休克蛋白70(HSP70)基因组成型表达水平.结果发现,真鲷ARNT、CYP1A基因cDNA核心序列片段分别长438bp和908bp,分别编码146和302个氨基酸.序列同源性分析发现,真鲷与门齿鲷(Stenotomus chrysops)、石首鱼(Micropogon undulatus)ARNT基因氨基酸序列同源性高达97.2%、95.2%,与斑马鱼(Brachydanio rerio)、人、大鼠、小鼠ARNT同源性较低(77.2%～79.3%).真鲷与门齿鲷、金头鲷(Sparus auratus)、欧洲川鲽(Rhombus maximus)、欧洲海鲈(Dicentrachus labrax)CYP1A基因氨基酸序列同源性较高,为84.8%～94.0%,与斑马鱼、人、小鼠CYP1A同源性较低,为59.6%～77.8%.真鲷肝脏AHR、ARNT、CYP1A、GSTA1、GSTA2、GSTR和HSP70基因组成型表达水平分别为(25.32±6.56)%、(26.22±4.24)%、(146.5±16.06)%、(55.42±3.75)%、(48.82±10.89)%、(79.47±3.13)%、(107.42±14.34)%.     

亚硝酸细菌amoA基因的克隆、测序与表达

采用PCR技术对亚硝酸细菌的特异性amoA基因进行克隆、测序 ,以确定其准确性 ;然后采用基因重组技术构建亚硝酸细菌的基因工程菌 ,并进行鉴定与功能初步评价 .结果表明 ,克隆得到的 4种亚硝酸细菌的amoA基因 ,与标准菌株Nitrosomonassp.GH2 2的amoA基因同源性达到 98%～ 99% ;构建了一种含有特异性amoA基因的大肠杆菌基因工程菌株 ,并采用直接比色法对重组细菌的氨氧化活性进行测定 ,发现基因工程菌的氧化氨氮速率明显高于分离的野生菌株 .研究表明 ,利用基因重组技术对亚硝酸细菌等自养菌进行改造 ,构建高效基因工程菌在水污染治理领域具有可行性 .图 6表 1参 12     

香蕉MaTIFY9基因的克隆及表达

为探究一个受低温诱导的香蕉MaTIFY9基因的序列特征及在不同激素和逆境胁迫处理下的表达模式,分别使用PCR和反转录PCR (RT-PCR)技术克隆该基因的gDNA和cDNA序列,分析其核苷酸和编码蛋白序列特性,利用实时荧光定量PCR (qRT-PCR)技术研究其在不同器官和不同激素、逆境胁迫处理下的表达情况.结果 显...     

茶树Ankyrin基因启动子的克隆及其5′UTR内含子功能

为了解启动子在茶树Ankyrin基因(CsAnkyrin)表达调控中的作用,以茶树新品系‘1005’嫩芽为材料,通过染色体步移技术克隆CsAnkyrin基因启动子序列,利用Neural Network Promoter Prediction和PlantCARE在线软件等对启动子序列进行生物信息学分析,将含有内含子和删除内含子的启动子序列(+intron/-intron)分别定向替换pCAMBIA1301表达载体的CaMV35S启动子,构建重组表达载体后分别转化拟南芥,并进行GUS组织化学染色分析.结果显示,克隆得到的CsAnkyrin启动子序列(命名为proAnk)为1 010 bp,含有一个5′UTR(5′Untranslated regions,5′非编码区)内含子.启动子序列除含有启动子核心元件TATA-box和CAAT-box,还存在有激素响应元件、光响应元件、厌氧胁迫应答元件以及大量功能未知或功能特异的顺式作用元件.删除5′UTR内含子后的启动子序列能够驱动下游GUS报告基因表达,保留5′UTR内含子的启动子序列不能驱动下游GUS报告基因正常表达,但是RT-PCR实验结果表明5′UTR内含子在转录后没有被切除,而是和GUS基因一起转录产生融合mRNA.本研究表明,proAnk具有诱导型启动子特性,5′UTR内含子对下游基因正常表达具有负调控作用,且可能是在翻译水平上对下游基因表达产生影响.(图7表1参32)     

甘蔗光合系统Ⅰ亚基O基因的克隆与表达分析

光合系统Ⅰ亚基O(PhotosystemⅠsubunit O,Psa O)是光合系统Ⅰ中的蛋白亚基,在两个光合系统之间平衡激发能方面起着重要的作用.为研究Psa O基因的结构和功能,对甘蔗(Saccharum offi cinarum L.)叶片全长c DNA文库进行测序,获得光合系统Ⅰ亚基O基因的全长c DNA序列,命名为Sc Psa O(Gen Bank Accession Number:KF714498).生物信息学分析表明,该基因全长708 bp,开放阅读框435 bp,编码144个氨基酸;该基因所编码的蛋白定位于叶绿体基质,无信号肽,为疏水性非分泌碱性蛋白,二级结构多为无规则卷曲,含有PJN00046家族的保守结构域,参与能量新陈代谢及脂肪酸新陈代谢.同时,该基因在不同物种间具有较强的保守性,其中与同属C4植物的同源性较C3植物高.荧光定量PCR分析结果表明,甘蔗Sc Psa O基因在叶片中的相对表达量最高,具有一定的组织特异性;在氯化钠(Na Cl)、聚乙二醇(PEG)、氯化铜(Cu Cl2)、脱落酸(ABA)、水杨酸(SA)和茉莉酸甲酯(Me JA)等外源胁迫下,其表达量均呈下调趋势,且以PEG胁迫下的下调表现最为明显.这些结果表明这几种外源胁迫可能抑制甘蔗Sc Psa O基因的转录水平表达,为其进一步功能验证以及在甘蔗基因工程中的应用积累了基础资料.     

香蕉含VQ基序蛋白基因MaVQ1的克隆与表达

克隆香蕉含VQ基序蛋白基因MaVQ1,研究其序列特征及其在不同激素处理和逆境胁迫下的表达模式.采用RTPCR技术从‘天宝蕉’中克隆了该基因,对其进行生物信息学分析,并利用实时定量PCR技术(qRT-PCR)研究它在不同组织部位和不同激素、不同逆境胁迫处理下的表达情况.结果显示:MaVQ1编码序列(CDS)长为459 bp,可编码一个分子式为C_(732)H_(1164)N_(210)O_(207)S_3、分子量为16 314.76、等电点为10.19的不稳定亲水性蛋白.MaVQ1含有保守的VQ结构域,不含跨膜结构和信号肽,与小果野蕉VQ亲缘关系最近.亚细胞定位预测结果显示MaVQ1主要定位在细胞核.蛋白互作预测结果显示MaVQ1与其他香蕉VQ蛋白以及WRKY互作系数最高.启动子顺式作用元件预测结果显示MaVQ1启动子包含多种光响应元件、激素响应元件和逆境胁迫相关作用元件.转录因子结合位点分析结果显示其启动子上存在大量的ERF结合位点.qRT-PCR结果显示:MaVQ1在不同组织部位中的表达无显著差异,其表达受茉莉酸、脱落酸和低温显著诱导,受高温和干旱抑制.本研究表明,与其他植物VQ类似,MaVQ1的表达受多种激素和逆境影响,暗示其可能在香蕉抗逆防御反应过程中发挥着重要调节作用.(图6表2参33)     

闽侯野生蕉LDOX基因的克隆及表达特性

为探讨闽侯野生蕉无色花青素双加氧酶基因(MiLDOX)的序列和表达特性,利用反转录PCR(RT-PCR)克隆MiLDOX基因cDNA序列,并对其进行系列生物信息学和不同组织器官中的表达特性分析.结果显示,MiLDOX基因包含1 083 bp完整的开放阅读框,可编码分子量(Mr)为40.73×10~3、包含360个氨基酸的蛋白质. MiLDOX基因属于α-酮戊二酸依赖性双加酶基因家族,其编码蛋白为不含信号肽和跨膜结构的亲水性蛋白,理论等电点为5.71.MiLDOX二级结构中不规则卷曲和α-螺旋占比较大.亚细胞定位预测结果显示MiLDOX可能定位于细胞质中.系统进化树显示MiLDOX与小果野蕉MaLDOX和阿比西尼亚红脉蕉EvLDOX亲缘关系最近.实时荧光定量PCR结果显示MiLDOX在闽侯野生蕉不同组织部位都有表达,在雄花中的表达量最高,且与类黄酮和花色素苷含量呈显著正相关.此外,通过研究MiLDOX基因在不同转色阶段果皮中的表达情况,发现它的表达随着果皮色素积累逐步升高.本研究表明MiLDOX基因可能分别参与闽侯野生蕉类黄酮和花色素苷的积累,并在果皮转色等过程发挥着重要作用.(图9表1参37)     

两个非洲菊4CL基因的克隆及表达

香豆酸:辅酶A连接酶(4CL)是苯丙烷类代谢的一个关键酶,在植物生长发育和抗逆防御反应中发挥着重要作用.为了解非洲菊4CL基因的序列特征和表达特性,使用反转录PCR克隆两个非洲菊4CL基因,利用生物信息学分析软件分析它们的序列特性,同时利用qRT-PCR研究它们在不同组织部位和低温、干旱、盐胁迫和水杨酸(SA)处理下的表达情况.结果显示,两个非洲菊4CL基因(Gj4CL-like7和Gj4CL-like1)CDS长度分别为1 617 bp和1 623 bp,它们编码的蛋白均为疏水蛋白,其中Gj4CL-like7拥有跨膜结构.Gj4CL含有木质素代谢相关4CL特有保守序列SSGTTGLPKGV和GEICIRG.定量结果显示,它们在不同组织部位中的表达情况相同均为根叶柄叶;低温处理下Gj4CL-like7的表达先升高,在处理8 h时达到最大值,之后显著下调并显著低于对照,而Gj4CL-like1的表达呈"升—降—升—降"的趋势,低温处理前12 h的表达量均高于对照且在12 h时最高,之后显著低于对照;盐胁迫下,Gj4CL-like7的表达受到显著抑制,而Gj4CL-like1的表达早期呈下调趋势,处理24h后的表达量显著高于对照;干旱胁迫和SA处理下这两个基因的表达均受到显著抑制,且Gj4CL-like7受抑制程度更高.本研究表明Gj4CL-like1主要参与木质素代谢,在非洲菊逆境胁迫应答中发挥着重要作用;Gj4CL-like7编码蛋白具有4CL保守序列相似序列,可能参与类黄酮代谢.(图6表1参36)