龙眼DlAGO1基因启动子的克隆与表达

为了解启动子在龙眼AGO1基因（DlAGO1）表达调控中的作用,根据龙眼基因组数据,以龙眼胚性愈伤组织的DNA为模板克隆DlAGO1基因的启动子序列,利用Methprimer、BPDG和PlantCARE在线软件对该序列进行生物信息学分析,将该启动子序列定向替换pCAMBIA1300载体的CaMV35S启动子,构建DlAGO1基因启动子与GUS基因的融合表达载体,瞬时转化本氏烟烟草叶片,进行GUS组织化学染色分析,并用不同浓度的赤霉素（GA3）、茉莉酸甲酯（MeJA）、水杨酸（SA）和脱落酸（ABA）喷洒烟草叶片,用实时荧光定量仪（real-time quantitative PCR,RT-qPCR）分析不同浓度激素处理下GUS基因的相对表达情况.结果显示：分离克隆得到1 437 bp的DlAGO1基因启动子序列,该序列含有2个CpG岛分布区,2段核心启动子区域,还含有多种顺式元件,包括大量的TATA-box和CAAT-box核心元件以及GA3、MeJA、ABA、光、逆境、胚乳表达等响应元件;转基因烟草叶片被中度染色,ABA处理能够诱导DlAGO1启动子的活性.综上所述,龙眼DlAGO...     

茶树Ankyrin基因启动子的克隆及其5′UTR内含子功能

为了解启动子在茶树Ankyrin基因(CsAnkyrin)表达调控中的作用,以茶树新品系‘1005’嫩芽为材料,通过染色体步移技术克隆CsAnkyrin基因启动子序列,利用Neural Network Promoter Prediction和PlantCARE在线软件等对启动子序列进行生物信息学分析,将含有内含子和删除内含子的启动子序列(+intron/-intron)分别定向替换pCAMBIA1301表达载体的CaMV35S启动子,构建重组表达载体后分别转化拟南芥,并进行GUS组织化学染色分析.结果显示,克隆得到的CsAnkyrin启动子序列(命名为proAnk)为1 010 bp,含有一个5′UTR(5′Untranslated regions,5′非编码区)内含子.启动子序列除含有启动子核心元件TATA-box和CAAT-box,还存在有激素响应元件、光响应元件、厌氧胁迫应答元件以及大量功能未知或功能特异的顺式作用元件.删除5′UTR内含子后的启动子序列能够驱动下游GUS报告基因表达,保留5′UTR内含子的启动子序列不能驱动下游GUS报告基因正常表达,但是RT-PCR实验结果表明5′UTR内含子在转录后没有被切除,而是和GUS基因一起转录产生融合mRNA.本研究表明,proAnk具有诱导型启动子特性,5′UTR内含子对下游基因正常表达具有负调控作用,且可能是在翻译水平上对下游基因表达产生影响.(图7表1参32)     

非洲菊CAD基因的克隆及在非生物胁迫下的表达

为揭示非洲菊肉桂醇脱氢酶基因(GjCAD)的序列特性及其在非生物胁迫下的表达模式,利用反转录PCR (RT-PCR)从非洲菊品种'玲珑'中克隆获得两个GjCADs(GjCAD3和GjCAD5),分析它们及其编码蛋白序列特性,并利用实时荧光定量PCR (qRT-PCR)技术研究它们在不同组织器官(根、叶和叶柄)和不同逆境...     

香蕉SUT基因家族的全基因组鉴定及其在不同低温胁迫下的表达

为探究香蕉蔗糖转运蛋白(sucrose/H+ cotransporter或sucrose transporters,SUCs或SUTs)家族成员的分子特性及其在低温胁迫下的表达模式,采用生物信息学方法鉴定香蕉蔗糖转运蛋白基因家族成员,并进行蛋白结构域及特性、基因及蛋白序列组分、分子进化树、基因启动子顺式作用元件以及在不...     

香蕉MaMPK1基因的克隆与表达模式

为研究香蕉MAPK1的序列特征及其在不同激素处理、逆境胁迫下的表达趋势,以‘天宝蕉’为材料,采用RTPCR技术克隆MaMPK1并对其进行生物信息学分析和不同处理下的表达模式分析.结果显示该基因编码区长为1182bp,可编码393个氨基酸.其编码蛋白具有STKc_TEY_MAPK结构域,属于MAPK基因家族TEY亚型A亚家族,是不稳定的脂溶性亲水酸性蛋白,无信号肽和跨膜结构,有多个磷酸化位点.亚细胞定位预测结果显示MaMPK1主要定位于细胞核.蛋白互作预测结果显示该蛋白与HSFA4A存在互作,暗示其可能在香蕉抗热反应过程中发挥作用.启动子顺式作用元件预测结果显示MaMPK1启动子包含多种激素和逆境胁迫相关作用元件.定量分析结果显示MaMPK1的表达受SA、45℃、低温和盐胁迫抑制,受茉莉酸甲酯(MeJA)和枯萎病菌侵染诱导上调,在脱落酸(ABA)处理后期极显著上调表达.本研究表明MaMPK1广泛参与香蕉逆境胁迫应答.(图9表1参35)     

茶树RING-finger型E3泛素连接酶基因CsSDIR的克隆与表达

蛋白质泛素化修饰广泛参与植物的生长发育及逆境胁迫响应,其中RING-finger型E3泛素连接酶基因salt and drought induced ring finger1(SDIR1)在植物抗逆中具有重要的作用.为了解茶树SDIR1(CsSDIR1)在抗逆应答中的作用机制,采用RT-PCR技术从茶树中克隆CsSDIR1的全长cDNA序列及启动子序列,对其生物信息学特征进行分析,并采用qRT-PCR技术检测该基因的组织表达特异性及在不同逆境胁迫下的表达模式.结果显示,CsSDIR1基因的开放阅读框(ORF)长831 bp,编码276个氨基酸,蛋白质分子量(Mr)为30.085×103,理论等电点为6.54;氨基酸序列分析表明,CsSDIR1属于疏水性蛋白、定位在胞内膜上,与其他植物中的SDIR1相似性较高,在其N-端和C-端分别含有2个保守的跨膜结构域和C3H2C3 RING finger功能域;CsSDIR1与猕猴桃关系最近. CsSDIR1上游启动子含多个与干旱胁迫和盐胁迫响应相关的元件.表达分析显示,CsSDIR1在茎中的表达量显著高于根、叶和花;ABA、干旱和高盐诱导其表达,低温抑制CsSDIR1的表达.根据上述结果推测CsSDIR1基因可能参与了茶树的抗逆响应.     

团头鲂谷胱甘肽S-转移酶基因的克隆及其在氨氮胁迫中的表达分析

谷胱甘肽S-转移酶(glutathione S-transferase,GST)是一类多功能蛋白家族,主要参与解毒和抗氧化防御过程。为了研究GST在团头鲂(Megalobrama amblycephala)肝脏解毒过程中的作用,克隆并分析了团头鲂1个谷胱甘肽S-转移酶基因(命名为MaGST)cDNA序列,采用实时荧光定量PCR研究了其在氨氮胁迫下的表达规律。MaGST包含1个长218个氨基酸的完整开放阅读框,具有GST蛋白家族的保守碱基和保守结构域。通过MEGA 5.0软件分析系统进化树发现,团头鲂GST与其他动物mu型GST聚为一簇,表明团头鲂GST属于mu型GST。荧光定量PCR结果显示MaGST基因在团头鲂各组织中均有表达,在肝脏和鳃中表达量最高,肌肉中表达量最低,同时在氨氮胁迫过程中该基因在肝和鳃中的表达规律相似,均在胁迫期间表达量显著上调;氨氮胁迫24 h时鳃和肝组织均存在组织损伤。研究结果提示在团头鲂肝脏和鳃组织中GST基因参与了氨氮胁迫的解毒过程。将该基因的编码区重组到p ET-21(a+)载体后在大肠杆菌中得到诱导表达,重组MaGST的GST活力为(10.36±0.68)U·mg~(-1)蛋白。     

盐生杜氏藻烯醇酶基因启动子的克隆分析及胁迫转录应答

为了解盐生杜氏藻(Dunaliella salina)烯醇酶(Enolase)在渗透耐受中的具体功能,利用基因组步行方法和巢式PCR,从D.salina中克隆了烯醇酶基因DsENO 5’上游约2 000 bp的调控序列,并对其进行序列分析.分析表明,它包含多个与转录调控有关的保守序列(如CAAT-box,TATA-box),富含光﹑干旱及其它胁迫应答元件.利用实时荧光定量PCR的方法,研究了高渗﹑高温以及低温外界胁迫条件下DsENO的转录情况,发现其受高渗强烈抑制,高温显著诱导而低温微弱诱导.     

gsh1基因的克隆及其在巴斯德毕赤氏酵母中的表达

利用PCR技术克隆了来源于Saccharomyces cerevisiae ALJ036的γ-L-谷氨酰-L-半胱氨酸合成酶(γ-glutamyl-cysteine synthetase)编码基因gsh1,连接多拷贝表达载体pGAPZA,转化Pichia pastorisx-33,构建了重组菌P.pastorisx-33(pGAPZA-gsh1);在高浓度Zeocin平板上筛选多拷贝阳性转化子,并通过PCR进行了验证.对阳性转化子的γ-L-谷氨酰-L-半胱氨酸合成酶酶活力进行了测定,结果显示,重组酵母的γ-L-谷氨酰-L-半胱氨酸合成酶的酶活是宿主菌的3.0倍,在液体YEPD中重组菌GSH的产量为42.2mg/L,是宿主菌的1.6倍.图7表1参10     

水稻花药特异表达启动子的克隆与活性检测

植物雄性器官特异表达启动子的克隆是作物杂种优势利用分子育种的基础.根据水稻花药特异表达RA8基因序列设计引物,从水稻(Oryza sativa L.)品种日本晴中克隆得到水稻花药特异表达基因RA8启动子Tsp2,该启动子为RA8基因翻译起始位点上游828 bp的片段,具有启动子特征序列TATA盒TATAAATA和真核生物启动子特征序列CAAT框,与RA8启动子的核苷酸序列同源性为97%.利用该启动子与报告基因GFP构建植物表达载体p1304-rap,采用基因枪法转化烟草花药,通过GFP的瞬时表达证明该启动子具有花药特异启动子活性. 图5 参9     

水稻精细胞优势表达基因RSSG58的启动子克隆和功能鉴定

利用本实验室已经克隆的水稻精细胞优势表达基因RSSG58的cDNA序列与NCBI中的粳稻基因组文库进行比对、定位,结合生物信息学方法分析预测基因上游的启动子序列.在此基础上设计引物,以粳稻Oryzasativa(japonicacultivar-group)日本晴黄化苗总DNA为模板,采用DNA聚合酶链式反应(PCR)的方法扩增出基因上游1093bp和462bp两个不同长度的启动子缺失片段(分别命名为JP58B和JP58S),测序结果显示,其具有大多数高等植物启动子的保守元件.进一步构建启动子片段的植物表达载体pBI121-JP58B和pBI121-JP58S,瞬时表达结果显示,两个启动子片段对报告基因GUS均具有启动活性.图4参20     

中国水仙DFR基因启动子的克隆及功能

为了解中国水仙花青素合成途径关键基因DFR(NtDFR)的表达调控以及中国水仙不能合成花青素的分子机制,采用染色体步移法从中国水仙中克隆NtDFR基因起始密码子上游962 bp的启动子序列.生物信息学分析结果表明启动子序列除包含TATA-box、CAAT-box等基本启动子元件外,还包含光调控元件、植物激素响应元件、胁迫响应元件等多个顺式作用元件.此外,该启动子序列还含有MYB转录因子结合位点.为验证启动子的表达特性,将NtDFR启动子取代植物表达载体pBI121上35S启动子,构建pBI121-pNtDFR::GUS载体,利用农杆菌转化烟草叶片瞬时表达,通过GUS组织染色法确定了克隆的启动子的活性.将中国水仙R2R3-MYB转录因子NtMYB2、NtMYB5分别和pBI121-p NtDFR::GUS共同注射烟草,定量PCR和GUS组织化学染色结果表明NtMYB2和NtMYB5都使NtDFR启动子诱导的烟草叶片GUS颜色变浅以及GUS基因表达量下降,表明NtMYB2和NtMYB5是NtDFR的抑制因子.本研究结果有助于了解中国水仙花青素合成途径的分子调控机制.(图5参34)     

香蕉含VQ基序蛋白基因MaVQ1的克隆与表达

克隆香蕉含VQ基序蛋白基因MaVQ1,研究其序列特征及其在不同激素处理和逆境胁迫下的表达模式.采用RTPCR技术从‘天宝蕉’中克隆了该基因,对其进行生物信息学分析,并利用实时定量PCR技术(qRT-PCR)研究它在不同组织部位和不同激素、不同逆境胁迫处理下的表达情况.结果显示:MaVQ1编码序列(CDS)长为459 bp,可编码一个分子式为C_(732)H_(1164)N_(210)O_(207)S_3、分子量为16 314.76、等电点为10.19的不稳定亲水性蛋白.MaVQ1含有保守的VQ结构域,不含跨膜结构和信号肽,与小果野蕉VQ亲缘关系最近.亚细胞定位预测结果显示MaVQ1主要定位在细胞核.蛋白互作预测结果显示MaVQ1与其他香蕉VQ蛋白以及WRKY互作系数最高.启动子顺式作用元件预测结果显示MaVQ1启动子包含多种光响应元件、激素响应元件和逆境胁迫相关作用元件.转录因子结合位点分析结果显示其启动子上存在大量的ERF结合位点.qRT-PCR结果显示:MaVQ1在不同组织部位中的表达无显著差异,其表达受茉莉酸、脱落酸和低温显著诱导,受高温和干旱抑制.本研究表明,与其他植物VQ类似,MaVQ1的表达受多种激素和逆境影响,暗示其可能在香蕉抗逆防御反应过程中发挥着重要调节作用.(图6表2参33)     

甘蔗乙醇脱氢酶基因的克隆与表达

乙醇脱氢酶基因(Alcohol dehydrogenase,ADH)在植物抵御涝害、冷害、干旱等逆境中起着重要作用.基于前期已构建的甘蔗受黑穗病菌胁迫后基因差异表达的抑制消减杂交(Suppression subtractive hybridization,SSH)文库,利用电子克隆和RT-PCR技术,从甘蔗品种ROC22中获得一条ADH基因的c DNA全长序列,命名为Sugarcane Alcohol Dehydrogenase(Sc ADH;Gen Bank登录号为KJ577593).生物信息学分析显示,Sc ADH基因全长为1 644 bp,含有1 140bp的开放阅读框,编码一个379个氨基酸的蛋白质.Sc ADH蛋白为稳定、亲水的酸性非分泌蛋白,定位于叶绿体基质上.蛋白二级结构元件多为无规则卷曲,具有典型的ADH蛋白结构域以及NAD和锌的结合位点.实时荧光定量PCR(Real-time quantitative PCR)表达分析表明,该基因在甘蔗各组织中组成型表达,其中根中表达量最高,而叶中的表达量最低.在SA和Me JA胁迫下,Sc ADH基因的表达趋势为"先扬后抑",均在胁迫6 h达到最大值,分别为对照的7.34倍和11.81倍.在ABA胁迫下,该基因均上调表达,在胁迫12 h达到最大值,为对照的5.53倍.在黑穗病菌胁迫下,该基因在感病品种ROC22中的表达受到抑制,而在抗病品种YC05-179中的表达模式为"先抑后扬".综上推测Sc ADH基因在甘蔗应答非生物胁迫和生物胁迫中发挥重要作用.     

烯酮还原酶基因的克隆与优化表达

烯酮/酯还原酶可以专一性地还原烯酮/酯中的碳碳双键,并引入两个手性中心,是手性化合物生物催化合成的重要酶类之一;在使用烯酮/酯还原酶进行全细胞手性分子生物催化合成中,其他还原酶的存在常导致副反应的产生.为研究烯酮/酯还原酶的理化性质、底物的专一性、产物的手性特点等,需要经过纯化的烯酮/酯还原酶.为此,根据烯酮还原酶(Enoate reductase,ERs,EC 1.3.1.31)的基因序列设计引物,以丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)ATCC824基因组DNA为模板,通过PCR扩增技术得到了目标酶的基因,目的片段全长为1 995 bp,共编码664个氨基酸,相对分子质量为73×103.将烯酮还原酶基因连接到pET-32a(+)上,构建表达质粒pET-32a(+)-ERs,并成功在Escherichia coli Rosetta(DE3)pLysS中表达.在摇床上优化的表达条件为:诱导温度为18℃,诱导起始时菌体D600 nm为0.6～0.8,转速为100 r/min,诱导剂IPTG浓度为0.1 mmol/L,诱导培养时间为12 h,表达的烯酮还原酶大部分以可溶性形式存在于菌体内.     

青稞β—1，3—葡聚糖酶Ⅱ基因启动子的克隆分析及表达载体的构建

根据本实验室克隆并公布的藏青稞β—1，3—葡聚糖酶Ⅱ(BGH Ⅱ)基因序列，以藏青稞QB09基因组DNA为模板，构建DNA步移文库，并通过步移技术克隆出BGH Ⅱ起始密码子上游调控序列BGHP．鉴定和分析表明，BGHP具备大多数高等植物启动子的保守元件，预测它对BGHⅡ基因的表达具有一定的作用．为鉴定BGHⅡ基因的基本启动子元件，将基因5′侧翼序列做缺失片段分析，利用PCR方法从BGHP中得到3个不同大小两端带有Hind Ⅲ、BamH I酶切位点的片段BGHP1、BGHP2和BGHP3，定向插人载体pMGFP4(pBI221改建，报告基因为GFP)中，取代原有的CaMV35S启动子，构建了由驱动报告基因GFP的植物表达载体BGHPVl、BGHPV2和BGHPV3，用于大麦的遗传转化，为进一步研究其功能奠定了基础．图5表1参15     

甘蓝型油菜脂肪酸链延长酶基因FAE1的克隆与原核表达

脂肪酸延长酶1(FAE1)是广泛存在于植物中并定位于内质网上的一种能催化脂肪酸碳链延长的酮脂酰CoA合成酶.根据Genbank上已知的植物FAE1基因设计引物,以从甘蓝型油菜叶片中提取的总DNA为模板,进行PCR扩增,获得了1380bp的片段.回收该片段,并连接到pMD18-T载体测序.序列比对结果说明了该片段与植物中已知的FAE1序列有极高的相似性,并且不存在内含子序列.将该片段通过高保真酶扩增,EcoRⅠ酶切消化后定向克隆到pGEX-2T表达载体中,在IPTG诱导下于28℃表达出Mr76×103的蛋白质条带.用兔抗GST多克隆抗体做第一抗体进行Western-blot检测,并获得阳性检测结果.这为甘蓝型油菜脂肪酸链延长酶基因FAE1功能的进一步研究奠定了基础.图4表1参14     

甘薯LEA2基因的克隆与表达分析

胚胎发育晚期丰富蛋白(Late embryogenesis abundant,LEA)是植物在逆境胁迫下产生的一种应激蛋白质,具有较高的亲水性和热稳定性,与植物抗逆功能密切相关,研究LEA家族基因对于甘薯抗逆性分子育种具有重要意义.通过对甘薯(徐薯18)转录组数据库搜寻时发现编码LEA2的转录本,随后对该转录本进行了克隆和测序分析,利用数字表达谱(Digital Gene Expression Profi ling,DGE)和半定量RT-PCR分析了Ib-LEA2在不同组织和不同发育阶段的表达图谱.为进一步了解Ib-LEA2在生物体响应盐胁迫中的作用,将Ib-LEA2连接原核表达载体pET-32a,用大肠杆菌BL21(DE3)菌株进行盐胁迫的耐受分析.结果显示:Ib-LEA2完整的开放阅读框(ORF)长度为942 bp,编码313个氨基酸残基.进一步研究发现,在甘薯组织内同时存在3个高度同源的LEA 2基因型(核苷酸序列99%),分别命名为Ib-LEA2a、Ib-LEA2b和Ib-LEA2c.数字表达谱和半定量RT-PCR的结果显示Ib-LEA2在不同组织和发育阶段具有不同的表达图谱,在茎中的表达量远远高于叶和根.大肠杆菌BL21(DE3)菌株盐胁迫的结果显示,较之对照菌株,表达Ib-LEA2的菌株能够更好地耐受高浓度的NaCl.研究表明,Ib-LEA2对盐胁迫有一定的响应能力,能够保护细胞免受高盐的毒害.     

甘蔗泛素结合酶基因的克隆与表达

为克隆鉴定甘蔗泛素结合酶基因(Sugarcane ubiquitin-conjugating enzyme,ScUBc E2)并探索其在激素信号通路和甘蔗与黑穗病互作过程中的作用,选择黑穗病菌胁迫下甘蔗抑制消减杂交文库(Suppression subtractive hybridization,SSH)中注释为泛素结合酶的差异表达EST序列为探针,结合电子克隆技术和RT-PCR技术,以甘蔗cDNA为模板进行泛素结合酶基因克隆.对克隆获得的序列进行生物信息学分析,并利用qRT-PCR技术分析该基因在甘蔗根、蔗髓、叶、芽中的组织特异性表达以及在黑穗病菌、茉莉酸甲酯(Methyl jasmonate,Me JA)、脱落酸(Abscisic acid,ABA)和水杨酸(Salicylic acid,SA)胁迫下的表达情况.最终克隆得到一条长度为699 bp的甘蔗泛素结合酶基因(ScUBc E2;Gen Bank accession number:KJ577594.1),该基因包含长度为447 bp的完整开放读码框,编码148个氨基酸.生物信息学分析结果显示,ScUBc E2编码的蛋白分子量(Mr)为16.507×10~3;无信号肽,为碱性不稳定的亲水蛋白;包含4个α螺旋、4个β折叠和一些无规则卷曲;第15位氨基酸为泛素化位点,74-89位氨基酸为活性位点;在进化过程中与高粱泛素结合酶基因的亲缘关系最近.qRT-PCR分析结果表明,ScUBc E2基因组成型表达,但在芽中的表达量最高;其表达在甘蔗感黑穗病基因型ROC22中受到黑穗病菌胁迫的抑制,在黑穗病抗病基因型YC05-179中则先被抑制,后被诱导;ScUBc E2基因受MeJA及SA诱导表达,对ABA胁迫的响应不明显.本研究表明,甘蔗ScUBc E2基因在抗病基因型和感病基因型甘蔗中存在不同表达模式,可能参与甘蔗与黑穗病菌的互作过程,有望为抗病育种分子标记提供潜在基因资源;同时,该基因受MeJA和SA外源激素胁迫后的表达模式,可为泛素-蛋白酶体途径及激素调控的信号转导在甘蔗与黑穗病菌互作过程中的作用提供一定的理论依据.     

过量表达沙冬青巯基蛋白酶抑制剂基因AmPI提高大肠杆菌低温与热胁迫抗性

沙冬青是我国北方内蒙古荒漠地区特有的常绿阔叶灌木,具有很强的抗低温、干旱、盐碱能力,是重要的抗逆基因资源植物.将从低温诱导的沙冬青幼苗中克隆获得的巯基蛋白酶抑制剂基因AmPI亚克隆后构建到原核表达载体pTWIN1上,得到重组表达载体pT-PI,双酶切及测序结果证明pT-PI已经构建成功.将pT-PI转入大肠杆菌ER2566中,经异丙基β-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导后,SDS-PAGE电泳检测发现有Mr35×103的目的融合蛋白表达,与预测结果一致,其中以在37℃诱导3～4h条件下表达量最高,表明目的基因AmPI在大肠杆菌中得到了成功表达.分别测定了低温(0℃)和热胁迫(50℃)条件下AmPI宿主菌的生存能力,结果表明AmPI的表达能提高宿主菌的存活率,可能是AmPI对细胞具有保护功能.