沼泽红假单胞菌高效产氢hupL缺失突变株的构建

利用湖底淤泥分离的沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)CQU01作为出发菌株,构建吸氢酶大亚基基因hupL缺失突变株,以提高光合细菌菌株的产氢效率.以PCR扩增的hupL两侧hupS 和 hupC基因为同源重组双交换臂,连入pMD18-T载体;再将hupS, hupC 和Kmr基因与经SalⅠ和HindⅢ双酶切的pSUP202,构建靶向自杀载体pBPZ.经接合转移转化R. palustris CQU01菌株,成功获得沼泽红假单胞菌吸氢酶活性缺失突变株R. palustris CQU012.测定突变株的吸氢酶活性及生长和产氢特性,结果表明,突变株的产氢量比野生菌株提高了约50%,而生长特性与野生菌株没有显著差异.R. palustris CQU012 吸氢酶缺失突变株可望为工业废水的生物治理提供高效产氢工程菌株.     

1株转座子插入突变菌株TB34的筛选及产氢分析

以分离自红树林污泥的厌氧发酵产氢细菌Pantoea agglomerans BH18为出发菌株,利用转座子Tn7构建突变体文库.通过卡那霉素抗性筛选与PCR扩增,鉴定转座子插入突变菌株.通过初筛和复筛,获得1株突变菌TB34,其产氢量较野生菌株明显提高.在初始pH为7.0和葡萄糖浓度10 g.L-1的海水培养条件下,产氢量(H2/葡萄糖)为(2.04±0.04)mol.mol-1,相比野生菌株产氢量提高43%.经过5次连续传代培养,突变菌株TB34表现出稳定的产氢特性.测定突变菌株TB34在不同碳源培养条件下的产氢量.结果表明,突变菌株TB34和野生菌株BH18都能利用蔗糖、葡萄糖和果糖发酵产氢.与野生菌株BH18不同,突变菌株TB34在以木糖为底物培养条件下仍能够发酵产氢,产氢量(H2/木糖)为(1.34±0.09)mol.mol-1,扩大了底物利用范围.     

一株耐酸产氢突变株Pantoea agglomerans的筛选与产氢特性

以红树林污泥中分离的厌氧发酵产氢细菌Pantoea agglomerans BH18为出发菌株,利用转座子Tn7随机插入菌株基因组DNA,通过卡那霉素筛选与PCR扩增验证,获得一批转座子插入突变菌株.起始pH4.0培养条件下,以产氢量为指标分离获得一株耐酸产氢突变菌株TB220.多次传代结果表明,突变菌株TB220具有稳定的产氢遗传特性.起始pH3.5~7.0范围内,突变菌株TB220最适产氢pH值为6.0,产氢量为(2.39±0.08)mol H2/mol葡萄糖.起始pH4.0和葡萄糖浓度10g/L的海水培养条件下,突变菌株TB220产氢量为(0.47 ± 0.02)mol H2/mol葡萄糖,比野生菌株高70%,表现出较强耐酸性.     

混合培养对沼泽红假单孢菌产氢及代谢的影响

混合培养逐渐引起人们的关注,将沼泽红假单孢菌Rhodopseudomonas palustris和厌氧细菌Enterobacter aerogenes PCM 532的混合培养,并进行生长代谢、产氢及正交实验、Biolog碳源代谢实验。结果表明,混合菌在厌氧光照条件下生长迅速,在好氧黑暗条件下也有一定生长;混合培养的产氢量高于纯培养;正交实验得到,对混合培养产氢影响最大的是底物和混合比例;Biolog微孔板代谢中混合菌可以利用纯菌种培养不能利用的碳源。混合培养表现为协同作用,促进细菌生长和提高产氢能力。     

常压室温等离子体快速诱变选育高产PHB菌株

聚-β-羟基丁酸(PHB)具有生物可降解性,其分解产物可全部为生物利用,对环境无污染。该研究从污水处理厂的活性污泥中筛选产PHB的菌株,通过菌落形态观察、生理生化特征与16S r DNA系统树的构建、红外光谱分析、对菌株及采用氯仿乙醇法提取的发酵产物进行了鉴定。采用常压室温等离子体(ARTP)快速诱变产PHB野生菌株,结合苏丹黑染色及摇瓶复筛方法,筛选产PHB产量高且遗传特性稳定正向突变株。分离筛选到一株产PHB的原始菌株,被鉴定命名为Bacillus toyonensis GR-6,结果表明胞内聚合物PHB含量达43.04%(干细胞含量),产量为1.33 g/L。ARTP快速诱变的突变株PHB含量可达77.43%,产量为2.78 g/L,是原始菌株的2倍多,对突变株进行连续7代的传代发酵实验,各代表现出良好的遗传稳定性。突变株PHB产量与细胞干重比原始菌株显著提高,并具有良好的遗传稳定性,在微生物法生产可降解塑料的应用领域具有较大的潜在应用价值。     

生物净水工艺中降解有机污染物优势菌的筛选初探

为了获得高效有机污染物降解的优势菌株,以稳定运行的生物净水工艺为研究对象,采用细菌分离、生化鉴定、脱氢酶活性分析、净水效能测定和降解相关基因扩增等方法对生物滤池中微生物群落进行了分析。结果表明,从生物滤池中分离的优势菌主要为巨大芽胞杆菌、短小芽胞杆菌、蜡样芽胞杆菌、弗氏枸橼酸杆菌、豚鼠气单胞菌、恶臭假单胞菌和肺炎克雷氏菌等。在8株高脱氢酶活性的菌株中,1株巨大芽孢杆菌、1株蜡样芽孢杆菌和2株恶臭假单胞菌对原水中的高锰酸盐指数UV254和TOC的去除效率较高;并从1株恶臭假单胞菌株的基因组DNA中成功扩增出大小为548 bp的偏三苯酚1,2-双加氧酶基因片段(对硝基苯酚降解相关基因),说明该菌株具有降解对硝基苯酚污染物的潜能。因此,本研究可筛选高效有机污染物降解的优势菌株,为生物净水工艺提供优良的菌种资源。     

新型专性厌氧菌利用葡萄糖进行发酵产氢的实验研究

采用批式发酵法对厌氧产氢菌株Bacteria.P利用葡萄糖发酵,在底物浓度、初始pH值、接种比例等不同培养条件下的产氢能力进行了研究。结果表明:专性厌氧菌P是一种高效产氢的菌株,在葡萄糖质量浓度为10 g/L、初始pH为6.0、接种比例为1∶20时,发酵气体总产量和细胞干重达到最大值,分别为485 mL和0.836 g/L。     

农田土壤产二甲基硫醚(DMS)细菌的筛选及其特性分析

从农田土壤中筛选到4株能在改性基础培养基上以甲硫氨酸为唯一碳源和氮源生长代谢的产DMS细菌,分别命名为AQ1、BB1、BB2和BB3.通过对其形态特征、生理生化特性及16S rRNA序列分析,确定4株产DMS细菌分别为硝基还原假单胞菌AQ1(Pseudomonas nitroreducens)、恶臭假单胞菌BB1(Pseudomonas putida)、恶臭假单胞菌BB3(Pseudomonas putida)和附着剑菌BB2(Ensifer adhaerens).研究结果表明,BB3菌株产DMS的能力显著高于其它菌株(p0.05),该菌株在温度为35℃,pH为7.0时,产DMS的能力最强;添加淀粉、硝酸钾和氯化铵显著提高了BB3菌株产DMS的能力,而添加葡萄糖和蔗糖显著抑制了该菌株产DMS的能力(p0.05).     

铜绿假单胞菌NY3及其突变株好氧降解四溴双酚A特性研究

为明确铜绿假单胞菌NY3 2个烷羟化酶基因alk B1和alk B2基因在该菌代谢四溴双酚A中的作用,研究了野生NY3菌及其突变菌株(NB1D、NB2D及NB12DD)对四溴双酚A好氧降解特性.研究表明,NY3、NB1D、NB2D及NB12DD菌株均能以四溴双酚A为单一碳源和能源进行生长,并对四溴双酚A进行一定程度上的降解.NY3菌中alk B1基因和alk B2基因的缺失对NY3菌株在四溴双酚A中的生长有抑制作用,而且alk B1基因和alk B2基因在NY3菌降解四溴双酚A中起一定的作用,但不完全,说明NY3菌中还存在其他影响四溴双酚A降解的基因.缺失alk B2基因的突变株NB2D在高浓度的四溴双酚A溶液中降解转化率最少,说明alk B2基因的缺失,对NY3菌降解高浓度四溴双酚A碳源更重要.加入同一易降解共代谢碳源,野生株NY3菌及其各突变株生长特性无明显差异,然而,因共存碳源种类不同,同一菌株细胞生长量、对四溴双酚A降解及其脱溴效率等特性差别明显.加最佳共代谢碳源乳酸钠的体系内,突变株NB2D存在下易积累中间产物3,3',5-三溴双酚A和2-溴-4(异丙基-溴苯)-苯酚等直接脱溴产物,说明alk B1基因可能为NY3菌株代谢四溴双酚A脱溴时的关键基因.     

Pseudomonas sp.JM2菲降解酶基因解析

Pseudomonas sp.JM2是一株新发现的菲好氧高效降解菌,文章通过对该菌株菲降解基因簇的解析,发现降解关键酶基因均处于质粒上。获得了该菌菲双加氧酶、顺-3,4-二氢二羟基菲脱氢酶、3,4-双羟基菲双加氧酶、2-羟基-2H-苯芘[h]色原烯-2-羧酸盐异构酶、水合-醛缩酶、1-羟基-2-萘甲醛脱氢酶、1-羟基-2-萘甲酸双加氧酶、反式-2'-羧基苄基丙酮酸水合-醛缩酶、2-羧基苯甲醛脱氢酶的基因序列。通过与14种多环芳烃降解菌的基因序列比对,发现JM2降解关键酶的基因序列与产碱杆菌AFK2有96%的同源性,而与同种属的假单胞菌的同源性仅有约55%。进一步用同源模建的方法获得了JM2菲双加氧酶α亚基的关键氨基酸,并结合已知的代谢产物分析,推测该菌株通过邻苯二甲酸途径降解菲,该降解途径与目前已知的假单胞菌菲降解途径不同。实验结果对于评价JM2菲降解物的环境影响、进一步通过基因调控和改造提高JM2的降解能力奠定了基础。     

一株利用生物柴油废水产氢的光合菌的筛选、鉴定

从37株光合细菌中筛选出1株能够利用甘油做碳源进行有效产氢的菌株(DB803).根据该菌株的形态、生理生化特征、16S rDNA序列和ERIC-PCR结果分析,初步鉴定该菌株为类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides).研究了该菌株在30℃, 4000lx光照厌氧条件下利用不同浓度的生物柴油废水产氢的能力,当培养基起始COD浓度为11.5g/L时,其在对数生长期平均产氢速度为38mL/(L·h),同时,废水COD去除率达91.2%.     

菌株WYT降解还原蓝4的关键基因

以印染厂活性污泥中筛选出的WYT菌株为研究对象,探索其对还原蓝4（VB4）染料降解脱色的关键基因.采用全基因组测序分析方法和同源重组法,确定染料代谢的可能关键基因.对该基因进行敲除,构建载体进行基因回补,设计表型验证实验验证基因的脱色效果.结果表明,该可能关键基因属于染料过氧化物酶基因中的B型,命名为DyP.敲除后的菌株对VB4没有脱色效果,基因敲除成功.WYT菌株与敲除载体发生双交换,获得回补株.在降解实验中,回补株对VB4的脱色率为96.04%,野生株的脱色率为96.95%,回补株恢复了对VB4的降解脱色能力,而敲除株几乎失去对VB4的降解能力,DyP基因是VB4降解脱色的关键基因.     

菌株BL—21解磷能力的研究

本实验以自行分离得到的具有解磷能力的菌株BL-21为研究对象,经鉴定为侧孢芽孢杆菌(Bacilluslaterosporus),以蜡状芽孢杆菌BC-01为对照菌株,对菌株BL-21的解磷能力进行研究。分别以4种不同土壤(大豆土、小麦土、玉米土、水稻土)为唯一磷源进行测定。结果表明,在以小麦土为唯一磷源的培养液体中菌株BL-21的解磷能力要大于菌株BC-01.在以玉米土,大豆,水稻土唯一磷源的无机磷液体培养基中BL-21的解磷能力于BC-01的解磷能力基本相同。     

多聚磷酸盐激酶基因在污水生物除磷中的功能

为验证多聚磷酸盐激酶基因(ppk)在污水生物除磷中的功能.采用Red敲除系统,以p KD4质粒为模板,设计同源短臂,扩增外源线性DNA片段,将外源线性DNA片段电转化整合入已导入p KD46的大肠杆菌ATCC25922野生型菌株.获得重组菌E.coli/ppk~-Kan~+.将p CP20导入大肠杆菌E.coli/ppk~-Kan~+以消除卡那霉素抗性基因,通过负抗性筛选及正反向引物验证,构建无抗生素抗性的ppk基因缺失工程菌株E.coli/ppk~-Kan~-.比较工程菌株和野生型菌株的生长特性,并比较两者在缺磷诱导/富磷及多次厌氧/好氧诱导条件下的除磷性能.结果表明采用Red重组系统,通过无痕敲除,成功构建了大肠杆菌ppk基因缺失菌株E.coli/ppk~-Kan~-.敲除后的工程菌株和野生型菌株生长整体没有差异,但是4 h前对数期工程菌株生长快于野生型菌株,8 h后稳定期工程菌株生长慢于野生型菌株,表明ppk影响菌体的生长;缺磷诱导/富磷条件下,工程菌株并未表现出因ppk缺失而影响其除磷能力;经过5次厌氧/好氧诱导,两菌菌体含磷量保持在1%~2%,没有因诱导次数的增加而表现出菌体含磷量增加的趋势,也未发现厌氧有PHB好氧有聚磷颗粒生成,表明ppk基因的缺失并没有引起菌体除磷能力的下降.ppk并未表现出明显的与污水生物除磷相关的功能.     

不同铁浓度对单细胞和群体铜绿微囊藻生长的影响

分别在限铁和富铁的条件下,比较研究了Microcystis aeruginosa PCC7806(单细胞株)和M.aeruginosa XW01(群体株)2株铜绿微囊藻的生长、光合作用效率、铁载体分泌及其细胞对铁元素的积累.2株藻的ITS 序列相似性为95%,铁吸收调节蛋白基因fur的序列相似性为98%,二者具有很高的遗传相似性.研究表明,在限铁条件下单细胞株微囊藻生长受到抑制,在第 6 d藻体黄化死亡,但群体株在限铁条件下能维持一定的生长; 限铁条件下最大光能转化效率(F_v/F_m)群体株高于单细胞株,二者分别为0.182±0.014和0.160±0.017.群体株比单细胞株有更高的光合作用能力; 2株藻均可产生铁载体菌株,其铁载体类型为氧肟酸盐型.在限铁条件下,群体株比单细胞株产生更多的铁载体.通过测定藻体铁的含量,发现缺铁条件下藻体积累的铁含量不足富铁条件下的1/3,但不同铁浓度培养的2株藻之间铁含量差异不大.研究结果显示,群体株比单细胞株有更强的适应低铁环境的能力,其机制并非是由于二者对铁吸收和积累的差异导致,可能是由于单细胞株的其他生理代谢过程对细胞内低铁状态更为敏感.