自然生境中氨氧化细菌的分子生物学研究进展

摘要 硝化过程是自然界氨氮污染降解的主要生化机制,氨氧化细菌对于富营养的河流、海洋及土壤环境等自然生境具有重要作用.氨氧化细菌的群落结构很复杂,且在不同研究区的时空上存在很大差异性.随着分子生物技术的发展,各种自然环境中存在的氨氧化细菌得到了研究.目前,中国对氨氧化细菌的研究多集中于污水处理、土壤等方面,采用非培养方法对自然环境中氨氧化细菌的研究较少.首先介绍了氨氧化细菌的发现过程和生理特性,其次论述了不同的分子生物学方法对土壤和水生生态环境等自然生境中氨氧化细菌研究进展和研究方法,最后提出了自然生境中氨氧化细菌研究的问题和展望.     

固定化氨氧化细菌短程硝化特性研究

以高分子聚合物为载体,采用固定化细胞增殖技术固定氨氧化细菌,研究温度、pH、碱度和溶解氧等因素对短程硝化过程的影响.实验结果表明,最适宜的温度、pH分别是30℃和8.5;当碱度/NH4 -N(质量比)=6.75时,亚硝化率为87.5%;溶解氧浓度影响氨氧化速率,但对亚硝化率影响不大,溶解氧的适宜质量浓度为403 mg/L.     

磺胺嘧啶对纯膜MBBR氨氧化性能及氨氧化菌群的影响

通过向NH₄⁺-N质量浓度为30 mg·L⁻¹的合成废水中投加不同剂量磺胺嘧啶(SDZ)(0、1、3、5、7和10 mg·L^–1),比较了SDZ浓度对一台60 L单级纯膜移动床生物膜反应器(pure MBBR)的氨氧化速率、amoA基因丰度和氨氧化细菌(AOB)种群结构的影响,揭示了磺胺嘧啶对纯膜MBBR系统中氨氧化作用的影响机制。结果表明：1~3 mg·L^–1的SDZ显著提升了纯膜MBBR系统的氨氧化速率(P<0.05),出水${\rm{NH}}_4^{+} $-N质量浓度可降低至(0.19±0.10) mg·L^–1;5~10 mg·L^–1的SDZ仍能促进${\rm{NH}}_4^{+} $-N去除,但氨氧化速率变化相对平缓。相比于氨氧化古菌(AOA),AOB为纯膜MBBR氨氧化的主导者,AOB amoA基因丰度是AOA amoA基因丰度的12.2~168.5倍。1~10 mg·L^–1的磺胺嘧啶暴露显著抑制了AOB amoA基因丰度(P<0.05),但能有效刺激AOA amoA基因丰度上调(P<0.05)。高通量测序结果表明,添加磺胺嘧啶改变了AOB的种群多样性及结构,且1~3 mg·L^–1的SDZ能显著促进AOB种群多样化和亚硝化螺菌属(Nitrosospira)生长(P<0.05)。SDZ对氮源的补充、对AOB与AOA丰度占比的改变、对微生物耐药性的促进以及对AOB种群结构的干扰是其影响纯膜MBBR氨氧化过程的主要机制。     

黑藻根际对沉积物中氨氧化细菌和古菌的影响

氨氧化反应对水生态系统氮循环和氮的去除有重要作用,沉水植物通过根系泌氧促进沉积物中硝化反应并对氨氧化细菌和古菌的分布产生影响。本研究以轮叶黑藻为实验对象,利用微电极研究沉积物-水界面的溶解氧变化,研究了黑藻根系对沉积物中氨氧化细菌和古菌数量的影响。结果表明,黑藻通过根系泌氧增加沉积物-水界面的溶解氧量和表层沉积物有氧层厚度,有氧层厚度增加了3 mm以上;种植黑藻后,根际沉积物中氨氧化细菌数量逐渐增加,氨氧化古菌数量前30天增加随后减少,氨氧化细菌与氨氧化古菌amoA基因拷贝数的比值由0.51增加到6.75,说明黑藻根际沉积物更适宜氨氧化细菌的生存。     

包埋氨氧化细菌处理合成氨工业废水

以聚乙烯醇与海藻酸钠为载体,包埋固定氨氧化细菌(AOB),研究温度、DO、初始游离氨(FA)、有机物等影响因素对其短程硝化稳定性的影响。结果表明,25~30℃时载体中氨氧化细菌占优势;DO宜控制在4.0~5.5 mg/L之间,既能满足细菌生长所需,又不至过度曝气,造成载体间的摩擦增大,减少其使用寿命;载体耐氨氮负荷能力强,同时可以抵御有机物对氨氧化细菌的伤害;当初始FA>6.5 mg/L时,氨氧化细菌的活性将受到抑制;富集氨氧化细菌的污泥包埋后氨氮去除率降低了7.5%;包埋载体在确保短程硝化作用的同时,在内部形成的缺氧区可实现反硝化脱氮,提高了系统氨氮的处理能力。     

底物流加-间歇运行方式下氨氧化细菌富集培养的效果及影响因素分析

富集培养氨氧化细菌(AOB)可为污水处理工艺提高氨氮氧化速率、促进亚硝酸盐积累提供物质基础。在(20±2) ℃下,采用底物流加-间歇运行方式进行氨氧化细菌富集培养,重点考察了游离氨(FA)、游离亚硝酸(FNA)、溶解氧(DO)等因素的影响,并对富集前后活性污泥样品中的AOB进行了定性定量分析。结果表明：第15天左右AOB增殖进入稳定生长期,比氨氮氧化速率由接种时的4.45 mg·(g·h)⁻¹升高至57.22 mg·(g·h)⁻¹;通过pH、底物流加速率和实际反应速率关系的联合控制,可以实现整个反应过程中FA和FNA在预期范围内波动;即使在极低的DO条件下,高纯度的AOB也可进行氨氮氧化。高通量测序结果表明,体系内Nitrosomonas属的AOB大幅度增长,可由0.23%上升至54.18%,亚硝酸盐氧化细菌(NOB)的生长得到了有效抑制,培养结束时仅为0.12%。荧光定量PCR对AOB功能基因amoA的绝对含量结果表明,富集前后平均拷贝数由2.67×10⁵ copies·g⁻¹升至最大,可达9.67×10⁹ copies·g⁻¹,AOB成为活性污泥中的优势菌。本研究结果可为常温条件下快速富集AOB提供参考。     

好氧氨氧化菌混培物的氨氧化动力学研究

采用批式呼吸法求得好氧氨氧化菌产率系数为0.2119 mg COD/mg NH4 -NOD(或者0.7268 mg COD/mg NH4 -N)和氨氧化菌最大氨氮降解速率为0.1 mg NOD/(mg COD·h)(或者0.0292 mg N/(mg COD·h)).用间歇式批试验法,加入24 μmol/L NaN3抑制NO2--N氧化,建立氨氧化反应动力学方程,得到氨氮半饱和系数为18.38 mg NOD/L(或者5.36 mg NH4 -N/L),DO半饱和系数为0.494 mg/L.对比参数值表明,用一步硝化动力学来描述氨氧化反应动力学模型是错误的.     

氨氧化菌群的筛选及发酵条件的优化

利用选择性培养基对活性污泥进行连续驯化,筛选出氨氮去除效率较高且稳定的氨氧化菌群。采用聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳(PCR-DGGE)技术分析了氨氧化菌群在连续传代过程中菌群的结构差异,并对菌群的发酵培养基及发酵条件分别进行了正交优化和单因子优化。结果表明,该菌群的最佳发酵培养基为每升培养基中含碳酸盐缓冲液15mmol,硫酸铵4.2 mmol,磷酸盐缓冲液12.5 mmol,硫酸亚铁0.9μmol,氯化钙0.4 mmol,硫酸镁1.5 mmol;最佳发酵条件为:接种量为14%,装液量为60 mL/250 mL,温度为35℃。在此条件下,菌群对氨氮的去除效果较优化前提高了155%。     

纤维素降解细菌筛选及降解特性分析

基于获得高效纤维素降解细菌的目的,通过LB培养基的培养以及刚果红培养基的筛选,从牛粪堆肥中筛选获得2株高效纤维素降解细菌。经鉴定,分别为枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)和地衣芽胞杆菌(Bacillus licheniformis)。所筛选得到的菌种具有很高的滤纸降解能力,可在6d内使滤纸剧烈崩溃,振摇成均匀糊状;其中,地衣芽胞杆菌的羧甲基纤维素钠酶活峰值在发酵第4天达到峰值(237U/g)。     

太湖水体附着细菌和浮游细菌的丰度与分布特征

为了探讨太湖水体附着细菌及浮游细菌丰度的变化规律,明确细菌丰度与环境因子的关系,应用荧光显微技术对太湖4个湖区细菌丰度及分布特征进行了研究,并探讨了其与总氮(TN)、总磷(TP)、叶绿素a(Chla)、总悬浮颗粒物(TSS)等环境因子之间的关系.结果表明,太湖水体中附着细菌占优势,占总细菌的65％(总细菌平均值为6.53×106cells/mL,附着细菌平均值为4.25×106 cells/mL,浮游细菌平均值为2.28 × 106 cells/mL);附着细菌与浮游细菌数丰度具有相似的时空分布规律,附着细菌与浮游细菌丰度都是河口区(10#)最高,其次梅梁湾(3 #)、湖心区(8#)和东太湖(24#)较低;春夏季高,秋冬季低;水温、TP对太湖水体中附着细菌及附浮游细菌的丰度影响比较大,它们与水体中附着细菌丰度及附浮游细菌均呈显著的正相关(p＜0.05).太湖不同湖区附着细菌及浮游细菌的数量空间差异是由太湖不同湖区生态环境的异质性引起的.     

一种未见报道的厌氧氨氧化菌分子生物学鉴定

以(NH4):SO4和NaNO2作为基质,富集厌氧氨氧化污泥.提取厌氧氨氧化污泥中细菌总DNA,纯化后使用特异性引物对厌氧氨氧化菌16S rDNA进行PCR扩增.扩增产物连接到pMD19-T载体,将载体转化到感受态细胞大肠杆菌JM109中,并对其16S rDNA基因进行测序.将测序结果进行系统发育树分析,发现富集得到的厌氧氨氧化菌与Candidatus Anammoxoglobus propionicus进化关系比较接近,是一种尚未见报道的厌氧氨氧化菌.     

短程硝化-厌氧氨氧化组合工艺对氨淋洗液的处理效果

为证明短程硝化-厌氧氨氧化组合工艺处理氨淋洗液的可行性,采用生物滴滤池(BTF)进行氨淋洗液的短程硝化,然后利用厌氧氨氧化上流式厌氧污泥床(UASB)对淋洗液进行脱氮处理。结果表明：当氨浓度为0.03~0.31 mg·L⁻¹时,80%以上的氨被淋洗至液相,淋洗液中28%~84%的氮素可通过后续厌氧氨氧化过程被去除;在低、高氨负荷(0.072~0.72 kg·(m³·d)⁻¹)时,BTF均可实现对氨淋洗液的短程硝化,证明亚硝酸的积累与氨负荷无明显关系;利用淋洗液中游离氨、游离亚硝酸对氨氧化细菌和亚硝酸氧化细菌的抑制作用以及O₂传质的限制作用实现短程硝化。保证短程硝化BTF中亚硝酸积累、氨吸收效果、氨生物转化效率的最佳回流比为1∶2。上述研究结果可为采用短程硝化-厌氧氨氧化组合工艺处理氨淋洗液提供参考。     

偶氮染料直接大红GBE脱色细菌的筛选及研究

从保定市某印染厂曝气池废水中分离到一株对染料直接大红GBE有高效脱色效果的菌株HD－1，经鉴定，该菌为沙门氏菌属（Salmonella)，在25－37℃都有较高的脱色率，最佳脱色温度为37℃，在pH6－8范围内对染料具有明显的脱色效果，最佳脱色pH值为7.0，氧气对脱色具有一定的抑制作用。染料脱色产物的紫外－可见光谱分析表明，可见光区488nm处的吸收峰完全消失，而在紫外区出现了两个吸收峰。     

氨的超临界水氧化研究进展

在超临界水氧化过程中,氨作为含氮有机物氧化的中间产物,其氧化是有机物在超临界水中氧化降解速率的控制步骤.综述了氧化剂、温度、过氧量、停留时间和催化剂等因素对氨的超临界水氧化降解效果的影响,并总结了目前常用的两种反应动力学模型.与双氧水或氧相比,NO-3氧化荆具有更强的氧化能力;通过提高温度、过氧量和停留时间都可以促进氨的超临界水氧化降解.在氨的超临界水氧化中,当无催化剂作用时,氨的降解率很低;加入MnO2/CeO2等催化剂,可以显著提高氨的降解率.为加快超临界水氧化法处理含氮有机废水的应用进程,未来应侧重氨氧化机制的研究和催化剂的开发.     

寒地黑土中阿特拉津降解菌的筛选及降解特性

从长期施用阿特拉津的寒地黑土耕层(0～10 cm)取样。利用富集培养的方法,筛选到2株阿特拉津降解菌,编号Z₉和Z₄₂。Z₉以阿特拉津为惟一碳氮源生长,Z₄₂以阿特拉津为惟一氮源生长,15 d对阿特拉津的降解率分别为77.7%和65.6%。对其初步鉴定并对降解特性进行研究,结果表明,细菌Z9为微杆菌属（Microbacterium sp.）,细菌Z₄₂为节杆菌属(Arthrobacter sp.)。在室内进行降解条件优化实验,得出2株降解菌对100 mg/L阿特拉津的最佳降解条件为：温度30℃,Z₉ pH值为7,Z₄₂ pH值为8。     

超声波-缺氧／好氧污泥消化反应器中氨氧化细菌群落结构的演变

为了揭示超声波-缺氧／好氧污泥消化反应器中氨氧化细菌群落结构多样性的演变过程,采用变性梯度凝胶技术（PCR—DGGE）研究不同运行时期氨氧化细菌群落结构的变化。DGGE分析表明,反应器中氨氧化细菌群落比较丰富。在反应器运行的不同时期,氨氧化细菌的群落结构发生了一定的变化,反映了种群的动态演变。UPGMA聚类分析将DGGE图谱分为3大类群并对应于各自的运行时期。测序结果表明,反应器中的优势种群属于变形菌门（Proteobacteria）,包括α-proteobacteria,β-proteobacteria,γ-proteobacteria和ε-proteobacteria4个纲,其中β-proteobacteria占45％,γ-proteobacteria占40％。在始终保持明显优势地位的种属中,5株为反硝化细菌,它们对提高反应器脱氮效率具有重要作用。     

新型异养氨氧化菌的分离鉴定及氨氧化特性

从青岛海岸采集淤泥．通过富集培养,以硅胶平板点种分离．经纯化得到一株氨氧化菌H9菌株。该菌可以在营养培养基中生长,是一株异养氨氧化菌,经形态、生理生化特性、16SrRNA序列分析等初步鉴定该菌属于假诺卡氏菌属（Pseudonocardia sp．H9）。该菌株具有将氨氧化为硝酸的能力,明显不同于自养型的硝化作用过程需要亚硝化细菌和硝化细菌的密切协作才能把氨氧化成硝酸的特点。此外,该菌可以在无有机碳的培养基或在有机碳C／N达7或更高的培养基中氧化氨至硝酸;在亚硝化培养基与LB的混合培养基中,在LB占15％以下时,LB越高越有利于氨的氧化和菌的生长。该菌株的生长和氧化氨的最适温度为30℃;pH5．0～10．0,最适为8．0;氨离子摩尔浓度1～40mmol／L,最适为8mmol／L;氯化钠质量分数为0％～8％,最适为3．5％。由于该菌株具有以上的特性和优点．在污水的脱氮处理以及养殖海水的氨氮处理中有较高的应用前景,同时也是研究氨的生物氧化机制的理想菌株。     

污泥接种策略与联氨促进垃圾渗滤液厌氧氨氧化工艺快速启动及其运行效果

针对厌氧氨氧化工艺启动速度慢及在垃圾渗滤液中脱氮效率低的问题,探究了厌氧氨氧化工艺在处理高氨氮、低C/N比垃圾渗滤液中的快速启动及稳定运行策略。结果表明,厌氧氨氧化工艺接种反硝化污泥:anammox颗粒污泥=9:1的启动效果最佳,100 d时TN去除率可达75.1%。但由于垃圾渗滤液中COD较高,异养反硝化菌生长迅速且严重影响厌氧氨氧化菌活性。通过投加6 mg·L⁻¹的N₂H₄之后,异养反硝化菌活性受到抑制,反应器内厌氧氨氧菌占据主导地位,Candidatus Kuenenia菌相对丰度由0.2%提升到10.6%,TN去除率及氮去除速率分别达90.6%和0.143 kg·(kg·d)⁻¹以上。在厌氧氨氧化工艺中投加适量N₂H₄可实现垃圾渗滤液的稳定高效自养脱氮。     

NUA-DAS生态滤池中氨氧化菌群特征及脱氮效果

研究酸中和残渣（NUA）和脱水铝污泥（DAS）生态滤池中脱氮效果及氨氧化菌群（AOB）特征。为了解内在驱动因子,对脱氮效果进一步探究,从多样性和相似度角度研究AOB菌群时空分布规律以及对滤料环境的适应效果。系统在运行稳定后,装置总出水中NH3-N、TN的平均去除率达到75%和70%。结果表明,装置在不同运行时间、不同位置均存在AOB,随着系统的运行稳定,多样性较初始滤料中都有所增加。2种滤料都能够为AOB提供很好的生长环境,并且在pH显中性的DAS滤料中更加适合于AOB的生存繁殖。     

厌氧氨氧化的研究及其应用

厌氧氨氧化是近年来发现的一种新的氮素转化途径。与部分硝化相结合,应用于污水脱氮,具有运行成本低、节约能源和资源等优点。厌氧氨氧化是一生物过程,已确定的细菌有2种:Candidatus Brocadia anammoxidans和Candida-tus Kuenenia stuttgartiensis。描述了其生理学特性、生物化学途径,介绍了其2种应用途径:全自养亚硝酸型脱氮(CANON)和SHARON-ANAMMOX。