低质量浓度2-硝基-4′-羟基二苯胺暴露对鲫鱼鳃组织HSP70诱导的影响

采用实验室模拟的方法,以日本锦鲫(Carassiusauratus)作为实验生物,运用SDS变性胶(SDS-PAGE)蛋白电泳和免疫印迹(WesternBlotting)等分子生物学技术,研究了1mgL2-硝基-4′-羟基二苯胺(HCOrangeNo.1)在不同暴露时期对鲫鱼鳃组织应激蛋白HSP70诱导表达的情况,并探讨了鲫鱼鳃组织HSP70作为该有机污染物生物标志物的可行性。结果表明:鲫鱼鳃组织HSP70在暴露2d后相对于空白对照组开始有显著的表达(P<0.05),并随着暴露天数的增加其表达量显著增加;在暴露4d后其表达量达到最大值;在暴露7d后其表达量开始下降,但可能由于长时间的有机物毒性胁迫,造成了鲫鱼鳃组织损伤和病变,HSP70在随后的暴露时间段内表达量明显下降,均显著低于空白对照组(P<0.05),因此,鲫鱼鳃组织HSP70并不适宜作为该有机污染物在自然界水生生态系统中的生物标志物。     

应用应激蛋白HSP70作为生物标志物研究锌、铜及其联合毒性对鲫鱼肝脏的影响

将应激蛋白 (HSP70 )作为生物标志物 ,以银鲫 (Carassiusauratusgibelio)作为实验生物 ,经过 4 0d不同浓度铜 (Cu2 )、锌(Zn2 )及其混合物暴露后 ,运用SDS PAGE和WesternBlotting方法研究了鲫鱼肝脏组织内应激蛋白HSP70的诱导表达情况 .结果表明 :在实验浓度下 ,Cu2 ,Zn2 及其混合物对鱼肝脏内HSP70有显著的诱导 (P <0 0 5 ) ,而将Cu2 和Zn2 实验组与其混合物实验组相比 ,Cu2 ,Zn2 表现为一定的协同作用 .实验还发现 ,在国家渔业水质标准Zn2 浓度下 ,鱼肝脏组织内HSP70已经有明显的表达 ,说明分子生物学指标要比传统的环境检测指标敏感 ,对污染物具有早期预警的作用 ,将其作为生物标志物来监测环境中的重金属污染具有重要意义     

两种典型氯酚对鲫鱼脑组织应激蛋白HSP70的诱导

将鲫鱼(Cracian carp)分别暴露于五氯酚(PCP)、2,4,6-三氯酚(2,4,6-TCP)10d后,运用SDS-PAGE和Western Blot方法检测鱼脑组织内应激蛋白HSP70的诱导表达情况.结果表明,在整个实验浓度范围内(PCP为0.001,0.005,0.01,0.025mg/L,2,4,6-TCP为0.005,0.01,0.05,0.1mg/L),随着PCP和2,4,6-TCP浓度的增加,HSP70的相对灰度值都呈现先诱导后抑制的大体趋势;HSP70对PCP暴露更为敏感,在0.001mg/L时对鱼脑HSP70有较显著诱导作用(P<0.005).     

苯并[a]芘(BaP)暴露对三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)P4501A1、P-gp、HSP70基因表达的影响

以三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)为实验对象,通过水体暴露方式对其进行BaP持续染毒,随后进行消除试验,利用荧光定量qPCR技术研究三疣梭子蟹肝脏中细胞色素P4501A1(P4501A1)、P-糖蛋白(P-gp)、热休克蛋白70(HSP70)等相关基因表达量随BaP暴露时间和暴露剂量的变化特征。结果显示:BaP暴露对P4501A1、P-gp、HSP70基因的表达均起诱导作用,且对P4501A1的诱导最为显著(P0.05);消除期间P4501A1、P-gp、HSP70基因的表达量显著降低,且P4501A1表达量变化更为明显(P0.05)。实验结果表明BaP对三疣梭子蟹肝脏P4501A1基因诱导作用最为显著,可作为BaP暴露的敏感生物标志物,用以监测水环境中多环芳烃的污染。     

多环麝香污染胁迫对蚯蚓特异性蛋白基因表达的影响

为了探讨蚯蚓特异性蛋白基因表达在监测多环麝香低水平长期暴露污染中的应用,选择蚯蚓热休克蛋白(HSP70)、钙网蛋白(CRT)、亲环素A(cyPA)、翻译控制肿瘤蛋白(TCTP)等代表性蛋白基因作为供试基因.采用自然土壤污染模拟实验,基于mRNA表达分子水平,研究吐纳麝香(AHTN)与佳乐麝香(HHCB)长期(28 d)污染胁迫对以上各特异性蛋白基因响应表达的影响.通过序列同源性比较与荧光定量PCR熔解曲线结果分析,表明设计的引物适合供试基因mRNA表达水平的检测.染毒暴露28 d后,当AHTN染毒浓度小于30μg.g-1或HHCB浓度小于50μg.g-1时,蚯蚓HSP70基因表达水平无显著变化,而AHTN浓度等于或大于30μg.g-1和HHCB浓度等于或大于50μg.g-1时,HSP70基因表达水平呈显著下调趋势;而各AHTN或HHCB浓度处理组中蚯蚓CRT基因显著上调表达;cyPA和TCTP基因表达水平与对照组比较均无呈现显著性差异.研究结果表明,HSP70与CRT等基因的响应表达有望成为表征多环麝香土壤污染暴露水平及生态毒理效应的潜在生物标志物.     

四溴双酚A的鲫鱼血清蛋白生物标志物研究

以鲫鱼为供试生物,对四溴双酚A(TBBPA)的急性毒性、血清蛋白潜在生物标志物以及相应的毒性靶器官组织病理进行了研究,结果表明TBBPA对鲫鱼96 h的半致死浓度LC50是3.13 mg/L,TBBPA诱导下鲫鱼血清蛋白可区分为11个组分,各组分随时间和浓度的变化规律存在差异。组分11条带清晰,表达量变化幅度最大,在低浓度TBBPA暴露下表达量先降低后升高,第16天达到最高;高浓度时表达量在第2天达到最高。组分11的分子量为24 kDa,可能为鲫鱼斯坦尼小体(CS)中降血钙因子的解聚物。组织病理切片结果显示,鲫鱼肝脏和肾脏均表现出时间-剂量依赖性,且与组分11的诱导差异性表达呈现相应的病理损伤。因此,鲫鱼血清蛋白组分11对TBBPA的诱导具有浓度和时间响应敏感性,且易于识别和鉴定,可作为TBBPA暴露的鲫鱼血清蛋白潜在生物标志物。     

Cu2+和Cu-EDTA对鲫鱼脑组织应激蛋白HSP70诱导的影响

以鲫鱼(Carassius auratus)作为实验对象,经过40d不同浓度铜(Cu²⁺)及其配合物(Cu-EDTA)的暴露后,运用SDS-PAGE和Western Blotting方法检测鱼脑组织内应激蛋白HSP70的诱导表达情况.结果表明:在实验浓度下,与对照组相比,Cu²⁺和Cu-EDTA对鱼脑内HSP70有显著的诱导(p<0.05),而将Cu²⁺和Cu-EDTA实验组相对比,络合剂EDTA一定程度上改变了Cu的生物可利用性,从而降低了其毒性.实验还发现,Cu²⁺浓度在国家渔业水质标准0.01mg/L下时,鱼脑组织内HSP70已经有明显的表达,说明运用分子生物学指标要比传统的环境监测指标更敏感,具有对污染物早期预警的作用.     

石油污染对僧帽牡蛎(Ostrea cucullata)抗氧化酶的影响

在厦门岛及附近海域的轮渡码头、杏林湾、同安湾、黄厝4个地点现场采集牡蛎样品，研究牡蛎全组织石油烃含量与其消化腺、鳃超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）活性之间的关系，并探讨了将僧蛎抗氧化酶作为监测海洋石油污染的生物标志物（biomarker）的可能性。结果表明：（1）采自轮渡码头、杏林湾、同安湾、黄厝的牡蛎全组织石油烃含量分别为380．68、112．34、27．31、20．37μg/g；（2）牡蛎消化腺SOD、CAT活性均高于鳃；（3）牡蛎消化腺和鳃CAT、SOD活性均随石油烃含量的增加而增强，由相关系数来判断两者相关性显著，适合作为海洋石油污染的生物标志物。     

鲫鱼肝脏代谢酶和血清性激素对低浓度五氯酚的响应

研究了低浓度五氯酚暴露后鲫鱼体中几种重要分子生态毒理学指标的响应。结果表明,暴露7和15d后,五氯酚对鲫鱼血清睾酮含量产生了显著的诱导作用,并且暴露15d的睾酮含量高于暴露7d的睾酮含量,对鱼体造成了一定的繁殖损伤。暴露7d后,EROD和GST活性无显著升高,但暴露15d后,EROD和GST活性随浓度增加显著被诱导,其活性增高。研究结果也可揭示睾酮、EROD和GST对低浓度五氯酚具有高度的响应,建议作为监测和评价低浓度五氯酚对水生生态系统污染的生物标志物。      

蓝藻水华粗提物对小鼠肝脏HSP70,GRP78表达的影响

为研究在活体条件下自然水环境中蓝藻水华对生物体的毒性效应,将小鼠连续7d经灌胃暴露于不同浓度的蓝藻水华粗提物,通过western-blotting法测定小鼠肝组织中热应激蛋白HSP70、与内质网应激相关的GRP78、CHOP以及caspaser-12蛋白表达水平.结果显示,随着暴露浓度的提高,在最高浓度组,HSP70,GRP78的表达水平显著提高,但未见CHOP和caspaser-12表达的明显改变.研究结果表明,蓝藻水华粗提物使小鼠肝组织处于内质网应激状态.     

4-氯-3-甲基苯酚(PCMC)暴露对成年斑马鱼内源性物质的影响

建立了4-氯-3-甲基苯酚（PCMC）的水生生物斑马鱼暴露毒理学模型,研究了斑马鱼PCMC暴露后内源性代谢物的变化.同时,在斑马鱼PCMC半数致死浓度LC₅₀的基础上,以1/10 LC₅₀为暴露浓度进行代谢组学分析.最后,经超高效液相色谱串联三重四级杆飞行时间质谱（UHPLC-Triple-TOF-MS）检测,结合主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘法判别分析（OPLS-DA）进行代谢谱分析.结果发现,空白对照组和暴露组在代谢水平上有明显差异.进一步分析后筛选出9种上调物质和11种下调物质作为潜在生物标志物,主要包括氨基酸、嘌呤、糖类和脂质.根据差异代谢物生理功能分析发现,PCMC主要通过影响嘌呤代谢、甘油磷脂代谢、淀粉和蔗糖代谢、组氨酸代谢、丙酮酸代谢及苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成,对斑马鱼的心血管系统、神经系统、蛋白代谢和能量代谢等方面产生毒性效应.本研究建立的代谢组学方法能全面评价氯酚类消毒剂对水生生物的毒性效应,为进一步阐明氯酚类消毒剂的毒性机制提供了理论基础.     

苯并[a]芘对鲫鱼生物标志物的影响研究

研究了苯并[a]芘暴露对鲫鱼(Carassius auratus)的几种生物标志物的影响.在鲫鱼接受3个不同质量分数苯并[a]芘(BaP)的腹腔注射14 d后,分析了其肝脏7-乙氧基-3-异吩噁唑酮-脱乙基酶(EROD)活性,以及超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)等抗氧化酶活性和红细胞核异常(NA)率变化.结果显示:w(BaP)为1 mg/kg处理组的EROD活性显著升高(P＜0.001).w(BaP)为0.1和1 mg/kg处理组SOD活性显著低于对照组(P＜0.001),在暴露结束时,w(BaP)为1 mg/h处理组CAT活性显著低于对照组(P＜0.01),而w(BaP)为0.1和1 mg/kg处理组GPx活性被显著抑制(P＜0.001).表明BaP对EROD活性有诱导作用,而对SOD,CAT和GPx等抗氧化酶活性的抑制作用明显.所有处理组NA率与对照组均无显著差异.因此,鲫鱼EROD,SOD,CAT和GPx等酶活性的改变适于作为生物标志物,可以用来显示暴露于多环芳烃有机污染物鱼类的生活状态.      

运用蚕豆幼苗叶片生物标志物评价铅污染土壤

以蚕豆（Vicia faba L.）幼苗为供试植物,通过室外盆栽实验研究了暴露5周后的蚕豆幼苗叶片应激蛋白（HSP70和HSP60）等相关生物指标对土壤铅胁迫的响应.结果表明,随着外源铅的增加,叶片总铅含量、超氧阴离子自由基（O^·-₂）和膜脂质过氧化产物都在不同程度上得到增加.相关性分析表明,O^·-₂与膜脂质过氧化产物（R=0.973, p<0.01）之间存在显著的相关性.超氧物歧化酶、过氧化物酶、过氧化氢酶和抗坏血酸过氧化物酶活力均被相应的诱导.HSP70和HSP60对铅污染的响应比上述其它生物指标更加敏感.可见,土壤铅进入叶片后,可能通过O^·-₂的作用诱导了膜脂质过氧化,而4种抗氧化酶活力的提高缓解了活性氧的氧化损伤.HSP70和HSP60可作为土壤铅污染早期诊断的潜在的生物标志物,同时还应该考虑铅的暴露剂量并综合利用其它生物指标.     

近江牡蛎热休克蛋白70基因对三丁基锡的响应

为研究TBT(Tributyltin,三丁基锡)在双壳贝类HSP70s(热休克蛋白70)分子的高表达响应,以近江牡蛎(Crassostrea hongkongensis)为材料,用不同质量浓度(0、10-2、10-1、100、101、102、103 ng/L)的TBT对近江牡蛎处理不同时间(12、24、48、96、192 h)后,采用实时荧光定量PCR检测其3种器官(消化腺、外套膜和鳃)中HSP70和HSC70基因mRNA的表达水平. 结果显示:10-1～102 ng/L的TBT能诱导近江牡蛎HSP70和HSC70基因mRNA水平显著高于对照组(P<0.05),其表达水平均为先升后降,在96 h达到峰值;103 ng/L的TBT也能诱导近江牡蛎HSP70和HSC70基因显著高表达(P<0.05),但随着处理时间延长,mRNA表达出现抑制现象. 能诱导HSP70和HSC70基因表达水平显著高于对照(P<0.05)的TBT临界浓度均在10-2~10-1 ng/L范围内,可见2种基因对TBT的响应灵敏度高且相同,反应强度也没有显著差异(P>0.05). 3种器官对TBT的响应灵敏度也相同,但在消化腺和鳃中的响应强度都极显著(P<0.01)高于外套膜. 研究表明,近江牡蛎HSP70和HSC70基因对极低质量浓度的TBT就有高表达响应,可以作为TBT污染的早期预警指标;近江牡蛎较适宜的指示器官是消化腺和鳃,其次是外套膜.      

三丁基锡对文蛤鳃酸性磷酸酶、碱性磷酸酶和Na+,K+-ATP 酶活性的影响

在实验生态条件下,观察浓度分别为0．1、10和10ng／L的三丁基锡（TBT）暴露2、8、20d以及恢复7d和20d后对文蛤鳃酸性磷酸酶（aaciphatase,ACP）、碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,AKP）以及Na^＋,K^＋-ATPase活性的影响。结果显示在暴露早期TBT不影响ACP、AKP活性,暴露时间延长则主要表现出诱导作用。TBT具有抑制Na^＋、K^＋-ATPase活性作用,可观察效应直浓度为0.1ng／L。Na^＋、K^＋-ATPase可作为一种潜在的有机锡污染监测的生物标志物。     

虹鳟鱼鳃及肝脏多种CYP1基因表达模式作为生物标志物监测海河水污染状况

以虹鳟鱼为受试生物,以鳃与肝脏多种CYP1基因为生物标志物,在天津境内开展了野外监测实验,分析多种CYP1转录物的表达量变化及它们在不同监测位点的表达模式.实验通过鱼类吊网在特定水域进行野外监测.结果表明,葛沽与海河入海口的6种CYP1基因表达模式很相近,但表达量不同,表明两地的污染成分相近似但水中污染物负荷不同.除了在马厂减河外,CYP1C1/C3在葛沽与入海口受到明显诱导作用,表明马厂减河中存在的污染物种类不同于其它监测位点.因此,利用虹鳟鱼鳃与肝脏中多种CYP1基因表达模式作为生物标志物监测污染物有着很好的前景,不仅可以作为研究环境污染物对水环境和鱼类健康影响的重要手段,还可以为进一步解释化学混合物成分与多种生物反应之间关系提供理论基础.     

全氟辛酸诱导斑马鱼脾脏损伤及白细胞介素表达紊乱的免疫毒效应研究

全氟辛酸(PFOA)是新型持久性有机污染物,在水生生态系统多介质环境中广泛分布,其对水生生物的致毒机理备受关注.本文应用透射电镜和实时荧光定量PCR技术,研究了PFOA(0.05、0.1、0.5和1 mg·L-1)在7 d和14 d两个不同暴露时间段对斑马鱼脾脏的损伤效应及对白介素指标IL-1β、IL-4和IL-21表达的影响.结果表明,PFOA能够明显导致斑马鱼脾脏损伤,脾脏细胞呈现细胞膜皱缩和空泡化等特征.PFOA能够明显干扰斑马鱼脾脏白介素的表达.对于7 d暴露组,IL-1β和IL-4在m RNA水平的相对表达量随着暴露剂量的增加呈现出明显的先上升后下降的趋势;而IL-21的相对表达量随着暴露剂量的增加不断上升.对于14 d暴露组,IL-1β和IL-21在m RNA水平的相对表达量随着暴露剂量的增加呈现出明显的先上升后下降的趋势;而IL-4的相对表达量随着暴露剂量的增加不断上升.线性相关性分析表明,当暴露时间为7 d时,IL-1β表达量与IL-4表达量的相关系数为0.53;当暴露时间为14 d时,IL-1β表达量与IL-21表达量的相关系数为0.50,这说明PFOA诱导不同时间段后,斑马鱼脾脏IL-1β的表达量分别受IL-4和IL-21表达的影响.综上,本研究证实全氟辛酸能够通过诱导白介素表达的紊乱而导致斑马鱼免疫系统损伤,存在明显的剂量-效应特征.白介素IL-1β、IL-4和IL-21可以作为监测PFOA对水生生物健康风险评价研究的重要生物标志物.     

利用文蛤生物标志物评价尾水-海水混合体系污染水平

采用不同浓度（体积比0%～40%,经天然海水稀释而成）的市政污水处理厂（MSTP）尾水对文蛤（Meretrix meretrix）连续培养9d,通过测定9种生化因子水平评价污染暴露对双壳类的生物学效应包括：内脏中的超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）、谷胱甘肽还原酶（GR）、谷胱甘肽（GSH）、乙酰胆碱酯酶（AChE）、金属硫蛋白（MTs）、硫代巴比妥酸反应物（TBARs）以及血细胞的溶酶体膜稳定性（LMS）.SOD、CAT除外的所有生化因子均能对尾水污染产生敏感响应,其中,GPx、MTs、AChE和LMS的响应与尾水浓度呈显著相关（P<0.05或P<0.01）,适于作为尾水污染的生物标志物;依据这些生物标志物计算的综合生物标志物响应指数值（IBR_v2=0.61～2.65）随尾水浓度上升而增大,且两者间存在显著相关性（P<0.01）.研究结果表明,基于生物标志物响应值计算IBR指数的方法适于MSTPs尾水-海水混合体系的综合污染评价.     

缢蛏对潮间带原油污染的氧化应激及IBR评价

通过研究不同浓度原油污染对缢蛏(Sinonovacula constricta)鳃和内脏团抗氧化酶活性、脂质过氧化及鳃结构的影响,结合综合生物标志物响应(IBR),探讨潮间带原油污染对生物的毒性效应.结果显示:在剂量-效应方面,2种组织超氧化物歧化酶(SOD)活性和内脏团中谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)总体上表现为低浓度诱导、高浓度抑制效应;SOD诱导与过氧化氢酶(CAT)抑制同时出现,规律大致相反.在时间-效应上,SOD活性呈升高-降低-升高的趋势, CAT与GPx呈先降低后升高的趋势;谷胱甘肽硫转移酶(GST)在鳃中呈现先升高后降低的趋势,酶活性最高为371.663U/mgprot.暴露前期(6h)缢蛏2种组织中丙二醛(MDA)含量显著增加,鳃和内脏团中MDA含量最高值分别为5.030和10.705nmol/mgprot,后期逐渐平稳.IBR结果表明鳃中生物标志物对原油污染敏感度更高.原油暴露会使鳃丝结构发生变形或引起鳃丝脱离等现象.研究表明,缢蛏鳃更适宜作为潮间带原油暴露生物监测与评价的器官.     

氯代硝基苯胺对鲫鱼(Carassius auratus)血清抗氧化酶的影响

研究了2-氯-4-硝基苯胺、4-氯-3-硝基苯胺，2-氯-5-硝基苯胺对斑马鱼的急性毒性，96hLC50分别为6.99,2.58,8.63mg/L，为阐明氯化硝基苯胺类化合物对水生生物抗氧化酶的早期影响，将鲫鱼暴露于梯度浓度的2-氯-4-硝基苯胺，4-氯-3-硝基苯胺，2-氯-5-硝基苯胺中，研究鲫鱼血清SOD和GSH-PX活性短期（48h)内的变化，研究结果表明，在实验设置浓度下，随着暴露浓度升高，与空白对照组相比，3种化合物对SOD活性表现为先轻微激活后抑制，对GSH-PX活性先激活再抑制后有所回升，表明3种化合物对鲫鱼血清SOD和GSH-PX活性有显著影响，与3种化合物96hLC50相比，引起生化效应的暴露浓度明显降低，且反应快速，可考虑SOD和GSH-PX酶活性相结合作为该类化合物对水环境污染胁迫的敏感生物指示物。