石油污染土壤中的微生物群落结构与降解菌的分离

该文基于高通量技术,研究了石油污染对土壤的细菌和真菌群落结构的影响,采用选择培养基从石油污染土壤中分离石油降解菌并对其进行分子鉴定。结果表明,油污染土壤的微生物多样性减少,且优势菌群发生显著变化,油污染土壤中细菌和真菌在属水平上主要为Nakamurella、Pseudomonas、Proteiniphilum和Exophiala、Rhodotorula、Ochrocladosporium,这些微生物在石油烃类污染物的降解方面发挥了重要作用。以机油为唯一碳源从石油污染土壤中获得能利用机油作为碳源或能源的细菌11株,利用漆酶氧化丁香醛联氮产生的颜色变化筛选出具有较大降解石油潜力的菌株A01和A07,基于16S rRNA基因序列的分子鉴定表明,2菌株分别为不动杆菌和假单胞菌。     

牵牛花对石油污染盐碱土壤微生物群落与石油烃降解的影响

利用磷脂脂肪酸（PLFAs）生物标记法分析野生型牵牛花（Pharbitis nil （Linn.） Choisy）根际土壤微生物群落结构,探讨牵牛花生长对石油烃污染土壤微生物群落与石油烃降解的影响.结果表明,供试土壤微生物群落中,先后出现了24种PLFAs,包括标记细菌的饱和脂肪酸（SAT）、革兰氏阳性菌（G⁺）的末端支链饱和脂肪酸（TBSAT）、革兰氏阴性菌（G^-）的单不饱和脂肪酸（MONO）和环丙脂肪酸（CYCLO）、真菌的多不饱和脂肪酸（PUFA）和放线菌的中间型支链饱和脂肪酸（MBSAT）等六大类型.PLFAs的主成分分析（PCA）表明,牵牛花根际与对照组（未种牵牛花,CK）土壤微生物群落具有明显的差异,微生物多样性在春季增加83%、夏季增加140%、秋季增加50%;微生物的生物量在春季增加97.6%,夏季增加116.3%,秋季增加60.3%.牵牛花根际与对照组相比土壤中石油烃降解率明显提高,在春、夏、秋季分别提高了7.5%、34.2%和19.7%;并且,在牵牛花生长的不同季节石油烃的降解率有明显的差异,春季为22.3%,夏季为51.8%,秋季为38.0%.相关性分析表明,石油烃降解与土壤微生物总生物量具有中等程度的相关性（|r|=0.75）;与G⁺细菌、甲烷氧化菌的生物量具有高度相关性,相关系数|r|>0.8;与G^-的生物量具有中度相关性,相关系数为|r|=0.74;与真菌的生物量具有低度相关性,相关系数为|r|=0.36,与放线菌没有相关性,相关系数为|r|<0.30.     

紫茉莉对石油污染盐碱土壤微生物群落与石油烃降解的影响

以石油污染盐碱土壤为研究对象,利用磷脂脂肪酸(PLFAs)活性微生物标记法,分析紫茉莉(Mirabilis jalapa Linn.)根际土壤微生物群落结构的动态变化,探讨紫茉莉生长对根际土壤微生物与石油烃(TPH)降解的影响.结果表明,供试土壤中先后出现了22种微生物PLFAs,包括标识细菌的饱和脂肪酸(SAT)、标识革兰氏阳性菌(G+)的末端支链型饱和脂肪酸(TBSAT)、标识革兰氏阴性菌(G-)的单不饱和脂肪酸(MONO)和环丙脂肪酸(CYCLO)、标识真菌的多不饱和脂肪酸(PUFA)和标识放线菌的中间型支链型饱和脂肪酸(MBSAT)等六大类型.与未种紫茉莉土壤(CK)相比,根际土壤微生物PLFAs种类变异率在春、夏、秋季分别为71.4%、69.2%和33.3%;TPH降解率在春、夏、秋季分别提高了47.6%、28.3%、18.9%.相关性分析表明,石油烃的降解在CK土壤中与77.8%的PLFAs具有正相关关系(r0),55.6%的种类具有高度正相关关系(r≥0.8),其中,与SAT和MONO类群的相对含量正相关,相关系数分别为0.92、0.60;根际土壤中仅与42.1%的PLFAs正相关,21.1%的种类高度正相关,与TBSAT、MONO和CYCLO类群的相对含量正相关,相关系数分别为0.56、0.50、0.07.说明紫茉莉生长对根际土壤微生物群落结构及TPH降解速率均具有较大影响,且随生长季节的不同而有很大差异.该结果将为开展石油污染盐碱土壤的植物修复技术研究提供理论依据.     

外加碳源促进微生物群落降解土壤中的石油烃

为探究外加营养中碳源种类和碳源添加方式对石油污染土壤修复的影响,该文进行了为期80 d的石油污染土壤修复实验。考察了添加营养制剂后的石油烃生物降解效果,分析了石油降解菌数量、活性、群落结构以及功能基因预测。结果表明,双碳源（乙酸和葡萄糖）营养制剂对石油降解菌的刺激效果优于单碳源营养制剂,当营养制剂中作为碳源的乙酸和葡萄糖添加比例为3∶1时,强化了石油降解菌对碳源和氮源的利用,使其数量和活性快速恢复并进行石油烃降解,石油降解菌数量高达9.89 logCFU/g,活性高达为0.66 mol/kg,石油烃降解率高达77.5%。此外,双碳源营养制剂对土壤微生物多样性造成的负面影响低于单碳源营养制剂,并且促使形成以KCM-B-112属和Obscuribacterales属为主要优势菌属的石油降解菌群落,相关石油烃降解的功能基因丰度占比高,石油降解菌的代谢能力强。     

采油井场土壤微生物群落结构分布

为了评价采油井场石油污染的微生物修复潜力,选取油井旁持续污染区(W)、井场曾经污染区(S)、原泥浆池区(M)和周边农田区(F)这4个不同位置,对0~400 cm不同深度土壤进行调查取样.利用高通量测序技术,对样品16S rRNA基因V4区序列进行测定,结合石油含量、三氮等物化性质,分析了微生物的生物多样性、群落组成及其和环境因子的关系.结果表明,石油污染减少了土壤的生物多样性,石油含量、盐度是造成微生物群落结构差异的最主要环境因子.通过组间差异分析发现,W和M土壤不仅存在着大量的石油降解细菌,其中的高盐样品中还含有嗜盐石油降解古菌.S与F具有相似的群落结构,表明石油烃的自然衰减.因此,该井场具有丰富的石油修复菌种资源,具有很好的微生物修复潜力.     

石油污染土壤的生物修复技术及微生物生态效应

利用投菌法和生物刺激法对陕北子长石油污染土壤进行微生物修复研究.通过利用红外分光光度法测定不同处理方法对石油烃的去除效果确定了修复陕北石油污染土壤的最佳方案.修复过程中利用最大可能计数法(MPN)、PCR-琼脂糖电泳法、PCR-DGGE法分别测定了石油烃降解菌数目、催化基因、土壤微生物多样性对土壤微生物生态效应进行研究.结果发现石油污染土壤不同生物处理修复效果为:生物刺激(加入N、P营养物质)生物强化(投加降解菌)其他.土壤中石油烃降解率与可降解石油烃的催化基因含量之间存在正相关关系,修复过程中土壤中的石油烃和烷烃降解菌数量显著多于多环芳烃降解菌数量,投加外源降解菌SZ-1可以显著提高土壤细菌群落的多样性.研究结果有助于深入理解生物修复石油土壤过程中的微生物生态效应变化.     

石油烃污染非均质场地微生物群落结构及降解作用

为探究冲洪积扇上游强非均质性石油烃污染场地中微生物降解作用强弱,深入分析场地微生物修复的可能性,选取潮白河上游某典型废弃加油站为研究对象。受冲洪积扇条件控制,区内非均质性强,地下水埋深较大。现场采集土样进行微生物高通量测序分析;装填土柱进行室内淋滤实验,开展微生物降解对比分析。结果表明:未受污染区域（T1）的优势菌门为厚壁菌门（Firimicutes）,优势菌属为Paenisporosarcina,其相对丰度分别为40.1%和34.8%;污染区域可识别的优势菌门为变形菌门（Proteobacteria）,优势菌属为芽孢杆菌属（Bacillius）,其相对丰度分别为35.1%~52.2%和7.7%~16.8%,石油烃污染物较大程度上改变了区域的微生物群落结构和多样性,埋深和含水条件也是重要的影响因素。微生物降解对比实验表明,吸附作用是初始阶段石油烃污染物的主要去向,柱间出水石油烃浓度差值显示:0~200 h阶段微生物降解作用较为强烈,起主导作用,但去除量小于吸附作用。自然条件下,强非均质石油烃污染场地中石油烃降解优势菌的结构占比较低,数量较少,微生物降解作用微弱。     

PCR-DGGE技术分析塔式蚯蚓生态滤池微生物群落结构

利用PCR-DGGE技术研究塔式蚯蚓生态滤池微生物群落结构变化,结果表明,微生物的变化与滤池体积大小、水力停留时间和污染物负荷有关,微生物群落结构在不同滤池层中变化较大.12个样品泳道中的总细菌的Shannon-Wiener多样性指数从0.25变化到1.27,一级滤池微生物多样性指数从0.29变化到1.05,二级滤池微生物多样性指数从0.75变化到0.97,三级滤池微生物多样性指数先从0.87减少到0.25,后由于葡萄糖的加入增加到1.27.二级滤池出水中葡萄糖的加入,加强了系统内微生物的活性,从而三级滤池砂石和青石层细菌条带变亮变多.经过克隆测序和系统发育树分析,塔式蚯蚓生态滤池内的微生物多为单细胞菌属、假单细胞菌属、革兰氏阴性菌属和不可培养杆菌属,不同细菌条带在不同级滤池内差异变化明显.     

矿区土壤中砷污染对微生物群落的影响研究

采用梯度培养和PCR-DGGE技术,对大柳塔矿区矸石山及周边土壤的砷含量及其对土壤微生物群落的影响进行了研究,并通过测序研究了土壤微生物群落的结构。结果表明,矸石山及其周边自然表土的含水量较少,且十分相近;全磷和有机质含量普遍较高,p H呈中偏碱性;不同风化程度矸石山土壤砷含量对土壤微生物群落有显著的影响,不同砷污染负荷土壤中微生物群落的丰度存在差异;矸石山复垦年限不同,土壤理化性质会发生变化;土壤中砷含量的增高,对植物生长起关键作用的Gemmatimonas(甲烷单毛菌属)等微生物群落受到不同程度的抑制;Proteobacterium(变形菌门)具有较强的耐砷性;矸石山土壤特有的理化性质可为GASP-WA2W2_F11等微生物群落的演替创造了条件。     

PCR-DGGE研究沸石植生混凝土微生物群落结构

采用PCR-DGGE技术研究了滨水区和非滨水区沸石植生混凝土内部微生物群落结构,结果表明:沸石植生混凝土内部微生物多样性指数和物种丰度值均很高,滨水区和非滨水区植生混凝土内部微生物多样性指数与物种丰度总体持平,但是各部分微生物丰度差异明显.滨水区微生物丰度值根部5~10cm>根部10~15cm>沸石表面生物膜.非滨水区微生物丰度沸石表面生物膜>根部5~10cm>根部10~15cm.基因测序结果和系统发育树分析可知.滨水区和非滨水区以及沸石混凝土内各部分之间优势菌种各不相同,在滨水区,沸石表面微生物膜中优势菌种为丙酸杆菌、都柏林克罗诺杆菌和葡萄球菌属,根部5~10cm中优势菌种为黄杆菌和沙门氏菌属,根部10~15cm中优势菌种为慢生根瘤菌属;非滨水区,沸石表面微生物膜中优势菌种为芽孢杆菌和红假单胞菌属,根部5~10cm中优势菌种为沙门氏菌、微球菌亚目的Agromyces和酸杆菌属,根部10~15cm中优势菌种为沙门氏菌属.     

不同污泥龄膜生物反应器内微生物的群落结构特征

为研究不同污泥龄MBR(膜生物反应器)内的微生物群落结构特征,构建了SRT(污泥龄)分别为10、20、40和80 d的4个平行的MBR,通过PCR-DGGE技术获得各MBR内微生物的DNA指纹图谱,并对条带进行切胶测序. 结果表明,SRT不影响MBR对废水的处理效果,不同SRT下MBR对NH₄+-N和COD_Cr的去除率均能达到90%以上. DGGE结果表明,在运行过程中,各MBR内的微生物群落结构均发生了明显变化,并且不同SRT的MBR内总细菌群落结构变化特征相同;SRT影响同一微生物在各MBR中的出现速率;总细菌Shannon-Wiener多样性指数和丰富度指数均随着SRT的增加而升高,SRT为80 d的MBR内Shannon-Wiener多样性指数最高. 测序结果表明,不同SRT的MBR内的优势种属不同,其中Arcobacter sp.、beta proteobacterium及Thiothrix sp.为不同SRT的MBR中共同存在的关键菌属,对MBR的运行起着重要作用.      

砷污染湿地生境下土壤微生物多样性及群落结构特征

为研究As（砷）污染对微生物多样性的影响,找寻有利于As污染修复的抗As菌种,利用高通量测序技术分析As胁迫〔w（As）分别为0、80、100、150、200和400 mg/kg,依次记为AT0组、AT80组、AT100组、AT150组、AT200组和AT400组〕对湿地生境中土壤微生物多样性及群落结构特征的影响.结果表明:As污染会引起微生物多样性和群落结构的变化,但并不是简单的负相关.在各处理组中,AT80组的土壤中微生物多样性最高,OTU（operational taxonomic units）数高达1 849,较未经As处理的AT0组增加了58.9%,说明低As胁迫在一定程度上会刺激As敏感微生物的生长繁殖,如Desulfovibrio（脱硫弧菌属）和Allobaculum等菌属,使群落结构更加复杂多样.高w（As）（400 mg/kg）对微生物有明显的抑制作用,导致某些物种消亡和多样性下降.As胁迫会诱导抗As微生物〔如Pseuomonas（假单胞菌属）〕成为优势类群,群落结构趋于稳定、单一.微生物群落结构对不同w（As）胁迫有明显的响应特征,可作为As污染湿地土壤质量评价的灵敏指标.在AT400组中存在大量的Pseudomonas veronii,可为As污染湿地微生物修复提供借鉴.研究显示,微生物对As污染具有较为敏感的响应,其中,Proteobacteria（变形菌门）和Firmicutes（厚壁菌门）为As污染生境中微生物优势门类并且与非专性吸附态As和谷胱甘肽含量呈正相关.      

磺胺甲(口恶)唑污染土壤中微生物群落结构与抗生素抗性基因的分布特征

采用盆栽实验模拟磺胺甲■唑污染,通过Illumina高通量测序研究了土壤微生物群落组成的变化,应用普通PCR和微滴数字PCR技术分析了6种抗生素抗性基因的64个抗性基因亚型的分布特征.结果表明,土壤受不同浓度磺胺甲■唑污染120 d后,土壤真菌的多样性无明显变化(P0.05),但土壤细菌的多样性显著降低了(P0.05),土壤细菌和真菌群落结构均发生显著改变,且不同浓度磺胺甲■唑处理土壤的优势细菌与真菌在属水平上存在明显差异.磺胺甲■唑污染使土壤中抗生素抗性基因的多样性增加,且能显著提高磺胺抗性基因sul1的丰度(P0.05),但对磺胺抗性基因sul2、喹诺酮抗性基因floR与cmlA 1、四环素抗性基因tet(34)、tetG 2、tetG 1、tetM与tetA/P的丰度均无显著性影响(P0.05).     

土壤微生物群落对多环芳烃污染土壤生物修复过程的响应

采用聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳(PCR-DGGE)方法,研究了土壤微生物群落多样性对生物表面活性剂强化的植物-微生物联合修复多环芳烃(PAHs)污染土壤的响应.结果表明,细菌群落的Shannon-Weaver指数修复前为3.17,修复后为3.24～3.45,多样性整体呈上升趋势,其中以植物-菌根真菌-降解菌处理最高,但各处理间无显著差异(P>0.05).聚类分析结果显示,植物、植物-鼠李糖脂、植物-菌根真菌和植物-菌根真菌-鼠李糖脂这4个处理的群落相似度在90%以上,植物-降解菌处理与这4个处理群落结构最近,此外,植物-降解菌-鼠李糖脂、植物-降解菌-菌根真菌-鼠李糖脂群落相似度在80%以上.通过测序比对,DGGE图谱上优势及特征性条带分别为Bacillus、Pseudomonas、Acidobacteria、Sphingmonas、Rhodopseudomonas、Firmicutes和Methylocytaceae等,可能是与PAHs降解密切相关的种属.生物表面活性剂强化的植物-微生物联合修复污染土壤过程中,在提高PAHs生物有效性基础上,改变了土壤微生物群落结构和丰度,从而可以有效提高PAHs的降解率.     

黄土高原典型林木根际土壤微生物群落结构与功能特征及其环境指示意义

通过研究黄土高原典型林木根际土壤微生物群落结构,为正确评价该生态恢复区土壤环境恢复状况提供理论依据.利用湿筛倾析法、涂平板法和BIOLOG法研究了陕北黄土高原4种典型林木丛枝菌根真菌(arbuscular mycorrhizal fungi,AMF)孢子密度与土壤微生物群落结构多样性.结果表明,沙棘AMF孢子密度为刺槐的2.24倍,顺序为沙棘>狼牙刺>柠条>刺槐,不同林木土壤细菌和放线菌数量达极显著差异(p<0.01),真菌数量差异不显著(p>0.05).同一林木土壤细菌对BIOLOG-ECO板中碳源的利用优势种类和利用程度呈现明显的差异性;主成分分析表明对主成分1和主成分2贡献大的碳源为14种和8种,柠条和沙棘土壤典型变量值的变异(离散)较小,而狼牙刺和刺槐土壤典型变量值的变异较大.相关性分析表明,AMF孢子密度与细菌数量、氨基酸类、多胺类和芳香化合物类碳源呈极显著正相关(p<0.01),与真菌数量、放线菌数量和细菌总代谢活性呈显著正相关(p<0.05),但是与羧酸类、糖类和多聚物类碳源相关性不显著(p>0.05).AMF孢子密度可以作为评价陕北黄土高原林木土壤细菌生理代谢类群及其多样性的环境生物学指标.     

利用PCR-DGGE分析未开发油气田地表微生物群落结构

利用PCR-DGGE和克隆测序技术,分别对未开发油田、气田和非油气田对照区域,地表30、60、100、150、200 cm深度的土壤微生物分布进行研究,目的在于了解未开发油气田区域土壤微生物的分布特征,寻找潜在的油气资源指示菌.结果表明,不同深度土壤样品间的菌群相似度很低(26～69.9).在150 cm和200 cm处,DGGE图谱具有更好的丰富度(≥19)、多样性(≥2.69)和均匀度(≥0.90).油田区域富含γ-Proteobacteria(75%),此外还包括α-Proteobacteria、Actinobacteria、Acidobacteria,其相似菌株主要为石油相关菌和烃降解菌,如食烷菌、噬甲基菌.气田含有α、β、γ、δ-Proteobacteria和Bacteroidetes,γ-Proteobacteria含量较小(24%),所获16S rDNA条带相似菌株大多不具有烃降解能力,部分具有甲烷相关性,如甲基孢囊菌.在此类研究中,150 cm、200 cm更适于作为统一取样深度进行大范围取样调查;甲基孢囊菌可用来作为潜在的气田指示菌,食烷菌和噬甲基菌可作为潜在的油田指示菌,但仍需进一步地大范围取样验证.     

基于高通量测序分析的生物修复石油污染土壤菌群结构变化

利用高通量测序技术对微生物修复石油污染土壤过程中的微生物群落结构变化进行研究.结果表明,经修复处理的土壤微生物群落结构及多样性发生明显变化.利用生物强化修复处理(BA)的土壤中,微生物丰富度与均匀度明显降低,土著菌群受到抑制,外加变形菌门(Proteobacteria)成为主要的优势菌门,相对丰度由修复前的37. 44%增加为87. 44%.假单胞菌属(Pseudomonas)成为土壤中的优势菌属,丰度由2. 99%增加为76. 37%;进行生物刺激修复处理的土壤(BS)菌群丰富度和均匀度与原污染土壤相比略有降低.菌群结构组成上,原优势菌门变形菌门(Proteobacteria)丰度由37. 44%降低为10. 90%,厚壁菌门(Firmicutes)丰度由9. 16%增加为35. 32%,属水平上,原优势菌属微小杆菌属(Exiguobacterium)和原小单胞菌属(Promicromonospora)丰度由8. 49%和18. 96%分别降低为2. 19%和14. 97%,诺卡氏菌属(Nocardioides)和芽孢杆菌属(Bacillus)丰度由5. 56%和0. 29%分别增加至28. 95%和22. 70%,成为主要优势菌属.生物强化修复处理引起土壤菌群多样性和结构发生明显变化,生物刺激修复处理可基本保持土壤菌群结构多样性不被破坏,土壤菌群结构的稳定有利于石油烃的生物降解.     

南淝河细菌群落结构的研究

为了研究受污染城市河道南淝河在进行修复前微生物群落的多样性,于2009年10月(秋季)和2010年1月(冬季)在南淝河河道中采集水样,直接从水中提取总DNA,用细菌16S rDNA的通用引物对V3区进行PCR扩增,PCR产物经DGGE(变形梯度凝胶电泳)分离后,获得水体细菌群落的DGGE指纹图谱;同时运用平板计数法对水体的异养细菌进行计数。结果表明:不同季节,不同位点南淝河的细菌群落的多样性都很丰富,但不同季节优势种有差异;相同季节临近位点细菌种群结构的相似性较高,且有顺河而下相近位点相似性增高的趋势。南淝河水体异养细菌数量秋季为20.3×103～616.3×103CFU/mL。冬季为2.3×103～53.6×103CFU/mL,冬季异养细菌数量比秋季低一个数量级,并且从上游到下游逐渐增多。但与其他同等富营养化水平的水体相比,其异养细菌含量较低。     

厌氧氨氧化启动过程及微生物群落结构特征

采用UASB反应器以体积比1∶2接种实验室培养的具有厌氧氨氧化(ANAMMOX)功能的厌氧污泥和城市污水厂的好氧污泥,耗时17 d成功启动ANAMMOX反应,启动阶段分为菌体水解期、活性提高期和稳定运行期.稳定运行后,逐步提高反应器容积负荷富集厌氧氨氧化菌,当容积负荷由0.10 kg·(m~3·d)~(-1)增至0.44 kg·(m~3·d)~(-1)时,总氮(TN)去除负荷也随之由0.09 kg·(m~3·d)~(-1)提高到0.42 kg·(m~3·d)~(-1),反应器污泥逐渐由浅红色加深,粒径大于0.2 mm的污泥所占比例由10.90%增至38.37%.采用高通量测序对接种污泥和负荷提高期的污泥进行检测,其中绿曲挠菌门(Chloroflexi)、变形菌门(Proteobacteria)、WWE3门、放线菌门(Actinobacteria)、浮霉菌门(Planctomycetes)等占据主导.随着厌氧氨氧化菌富集程度的增大,脱氮功能菌中的变形菌门所占比例逐渐减少,从21.60%降至14.20%,而浮霉菌门随之增多,相对丰度由0.73%升至15.50%.当反应器的容积负荷增到0.44 kg·(m~3·d)~(-1)时,浮霉菌门中,Candidatus Brocadia属、Candidatus Jettenia属和Candidatus Kuenenia属是主要菌属,Candidatus Brocadia属占13.40%,是主要的厌氧氨氧化菌属.