慢生型大豆根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum)聚羟丁酸合成酶基因(phbC)突变体的构建及其特性

通过转座子Tn5诱变和同源重组，构建了Bradyrhizobium japonicum USDA110聚羟丁酸合成酶基因(phbC)突变体．序列测定确定了转座子插入的精确位置，所获得的4个转座子诱变的质粒其Tn5插在phbC基因内两个相距仅9bp的位点．被Southern和PCR证实的突变体菌株仍能产生相当于野生型菌株12．97％—25．10％的PHB，并且在突变体和野生型菌株总DNA杂交图上都呈现出一条约5kb的阳性带，推测在B.japonicum基因组中存在不止一个聚羟丁酸合成酶基因．图3表4参17     

煤层水中一株产甲烷菌的分离与系统发育分析

为了解煤层中产甲烷菌的生理生化特性,结合厌氧培养箱和平板划线分离技术从山东兖煤菏泽能化公司赵楼煤矿距离地表936 m处坑道顶板取得40℃煤层水样品中微生物进行富集分离纯化.结果表明:在该条件下存在产甲烷微生物,并分离得到一株产甲烷菌株M-3,该菌株呈短杆状,菌体大小约(1.0-2.0)μm×0.5μm;革兰氏染色显阳性;在平板上生长出圆形黄色菌落,边缘光滑整齐;可以利用乙酸、甲酸、甲醇和H2+CO2(V/V=2:1)作为唯一碳源生长;最适生长温度为45℃;对酸碱具有良好的适应性,中性条件下甲烷产量最多;最适NaCl浓度为0.2-0.6 mol L-1.对菌株M-3的16S rRNA基因序列同源性分析表明该菌株与Methanobacterium bryantii同源性高达99%,G+C含量32.9%.本研究通过形态、生理生化特性以及16S rRNA分析,鉴定菌株M-3为M.brytantii.     

焦化厂污染场地表层土壤有机-矿质复合体中多环芳烃的分布

采用湿法物理分级方法将湖南省某焦化厂遗留场地表层土壤分成4种粒级的有机-矿质复合体组分,即粘粒(<2μm)、粉粒(2—20μm)、细砂(20—200μm)和粗砂(>200μm),并研究了美国EPA优先控制的16种多环芳烃(PAHs)在其中的分布特征及土壤不同有机-矿质复合体组分中有机质和矿物质组成的差异对PAHs赋存分布的影响.研究结果表明,不同粒级有机-矿质复合体中PAHs的含量顺序为粗砂>粉粒>细砂>粘粒,低环PAHs(环数≤3)在粘粒中的含量较高,达到56.3%,而高环PAHs(环数≥4)在粉粒、细砂和粗砂中的分布较高含量分别是79.37%、72.7%和71.63%,各粒级矿质复合体中PAHs含量与土壤有机碳有较好的相关性.通过对有机-矿质复合体进行X射线衍射分析发现,场地土壤粘粒和粉粒中粘土矿物含量较高,这也在一定程度上影响了污染物质在其中的分布.     

河北平原农田土壤重金属形态分布特征及控制因素研究

土壤重金属污染防治已迫在眉睫,国内外对重金属污染研究热度不减。本文选择河北平原农田为研究区,对采集325个根系土样品中的Cd、Cr、Pb、As、Hg等5种重金属进行了各形态含量统计与分析,并用Arc GIS制作了有效态空间分布图。最后运用相关性分析法探讨了5种重金属各形态与全量及pH值、Fe_2O_3、总有机碳(TOC)、阳离子交换容量(CEC)、粘粒的相关性。研究表明:Cd的有效态(水溶态和离子交换态)含量占全量比重最大,为18.06%,Cr、Pb、As、Hg均低于10%,这4种金属以残渣态为主,占全量的50%以上;As元素各形态与全量、pH值、Fe_2O_3、TOC、CEC、粘粒的相关程度最高,成正相关关系;Cr的3种形态(铁锰氧化态、强有机结合态、残渣态)与Fe_2O_3、TOC、CEC、粘粒呈显著正相关关系,Cr碳酸盐结合态、腐殖酸结合态与pH呈正相关关系,与Fe_2O_3、TOC、CEC、粘粒呈显著负相关关系;5种重金属铁锰氧化态与pH均呈正相关关系。     

荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)工程菌株田间残留和扩散的追踪检测

分别在北京和江苏省连云港市对携带Btcry基因的荧光假单胞菌工程菌进行了田间残留与扩散的追踪检测 .对越冬前后的试验地和保护地土壤样品进行抗生素抗性平板分离 ,能检测到极少量的具有与出发菌株相同抗性的荧光假单胞菌菌落 ,但没有发现工程菌株的残留与扩散 .对江苏试验地样品还进行了工程菌株质粒卡那霉素和壮观霉素抗性标记基因的抗性菌落分离 ,绝大多数样品中都能分离到包括荧光假单胞菌在内的抗性菌落 ,土样中菌密度n(cfu) =10 4 ～ 10 5g-1,但进行Btcry基因PCR -RFLP检测时没有从样品中得到特异扩增产物 .研究结果表明 :工程菌株抗性标记基因在自然界广泛存在 ,工程菌在株环境中没有残留和扩散 ,具有良好的生物安全性 .表 4参 8     

过量表达水稻OsP5CS1和OsP5CS2基因提高烟草脯氨酸的生物合成及其非生物胁迫抗性(英文)

为了解水稻OsP5CS基因在非生物胁迫中的生物学功能及其生理生化作用,将P5CS基因的两个水稻同源基因OsP5CS1和OsP5CS2同时构建到植物表达载体pHB上,并通过农杆菌介导的遗传转化法转入烟草,经过鉴定转基因植株,成功获得9个独立的转基因阳性植株.选取野生型和其中的3个转基因植株后代,分别测定它们在不同的胁迫条件下幼苗的根长、鲜重以及脯氨酸、过氧化氢和丙二醛的含量.结果显示:在200 mmol/L NaCl、300 mmol/L甘露醇(Mannitol)、300μmol/L CuSO4胁迫条件下转基因植株的平均根长、平均鲜重、平均脯氨酸、平均过氧化氢含量和平均丙二醛的含量分别为野生型的1.3-2.3、1.9-3.9、1.8-3.2、51%-61%和62%-76%.因此在烟草中过表达OsP5CS基因,可以显著增加脯氨酸含量,降低烟草在非生物胁迫条件下的氧化损伤.图6参31     

产类胡萝卜素菌株的筛选及其培养条件初探

从土壤、植物落花、细菌污染的组织培养二三角瓶里的培养基上及被细菌污染的LB琼脂平板上分离筛选出十几株产类胡萝卜素的菌株，其中从污染的LB琼脂平板上分离的一株菌落颜色为黄色的菌株PBH，分类鉴定为库特氏菌属(Kurthia sp.)．菌株在以葡萄糖为碳源，添加番茄汁(3．6mL／L)、芝麻油(1．6mL／L)、Na2CO3(6g/L)和磷酸缓冲盐的液体培养基中28℃振荡培养5d，每mL培养液细胞生物量湿重达到65．57mg，类胡萝卜素产量达到9．896μg，菌体每g湿重细胞胡萝卜素含量为150．9μg．图10参13     

多不饱和脂肪酸与粘红酵母低温适应性的关系

以一株粘红酵母(Rhodotorula glutinis)YM25079为研究对象,分析其低温生长适应性与细胞膜流动性、膜脂脂肪酸含量的变化以及多不饱和脂肪酸合成关键基因——Δ12-脂肪酸脱氢酶基因mRNA转录水平的关系.结果显示,YM25079在5-30℃温度条件下均能生长,最适生长温度为15℃.在15℃培养条件下,YM25079细胞膜流动性没有明显降低,但是多不饱和脂肪酸含量显著提高,由25℃时29.4%增加到15℃时的55.39%,而且15℃时Δ12-脂肪酸脱氢酶基因mRNA转录水平提高了5倍.这些研究结果表明,粘红酵母YM25079的低温生长适应性可能是通过提高多不饱和脂肪酸合成相关基因的表达水平,增加膜脂中多不饱和脂肪酸含量,维持低温条件下细胞膜的流动性来形成的.     

复垦土壤团聚体稳定性和胶结物质对不同施肥的响应北大核心CSCD

土壤团聚体的组成和稳定性是评价土壤质量的重要指标,土壤胶结物质是团聚体形成的物质基础,两者密切相关.通过研究不同施肥处理下团聚体胶结物质含量的变化,阐明采煤塌陷区复垦土壤团聚体的分布与形成机制.设不施肥(CK)、施化肥(NPK)、单施有机肥(M)和有机无机肥配施(MNPK)4个处理,另取未复垦生土(RS)和周边未破坏多年种植的熟土(US)作为参照.采集耕层(0-20 cm)非扰动的土样,利用干筛法分析团聚体(> 2、0.25-2、0.053-0.25 mm)和粉黏粒组分(<0.053 mm)的分布比例,测定团聚体有机胶结物质(多糖、富里酸、胡敏酸和有机碳)和无机胶结物质(碳酸钙和颗粒组成)的含量.结果表明,同RS相比,各施肥处理均显著提高了> 0.25 mm机械稳定性团聚体的数量(R0.25),增幅为5.32%-5.94%,但是均显著降低了平均重量直径(mean weight diameter,MWD)(除M处理外),降幅为7.51%-9.83%,而M处理显著提高了几何平均直径(geometric mean diameter,GMD),增幅为5.65%.同CK相比,各施肥处理对大团聚体(> 0.25 mm)以及粉黏粒组分(<0.053 mm)的分布比例无显著影响,仅M和MNPK处理显著降低了微团聚体(0.053-0.25 mm)的分布比例,降幅为49.45%-62.40%.各施肥处理对富里酸含量无显著影响.NPK处理仅显著降低了土壤有机碳含量.M处理显著提高了土壤有机碳和碳酸钙含量,却显著降低了土壤黏粒含量.而MNPK处理显著提高了土壤各胶结物质含量(除富里酸和黏粒外).胶结物质与机械稳定性团聚体的分布比例和稳定性的冗余分析结果表明,各胶结物质中,仅胡敏酸对机械稳定性团聚体的分布比例和稳定性变化的解释率达到了显著水平(P <0.05),能够解释57.1%机械稳定性团聚体的分布比例和稳定性变化,并且其单独贡献率为75.9%.综上所述,经过6年培肥,同未复垦土壤相比,各施肥处理显著提高了大团聚体的数量,但同周边农田土壤相比,仍有待进一步培肥提高团聚体稳定性;MNPK处理是提高该复垦土壤有机胶结物质含量最有效的措施,胡敏酸是影响该复垦土壤机械稳定性团聚体的分布比例和稳定性变化的唯一显著的胶结物质.(图5表6参36)     

四膜虫omc基因的克隆及在滴滴涕(DDT)暴露下的表达分析

针对环境激素类污染物滴滴涕(DDT)危害大和分子机理复杂等问题,以之前筛选出的一个DDT暴露下差异表达的基因——酮戊二酸/苹果酸载体蛋白基因(2-oxoglutarate/malate carrier,omc)为研究对象,克隆得到该基因转录mRNA的全长为1060bp,其中5′、3′非翻译区分别为46bp和99bp;实时定量PCR方法测定不同浓度DDT暴露下该基因的表达水平下降了20%～50%.四膜虫omc基因上游数个AP-1和NF-kappaB位点的存在,提示该基因表达受DDT调控的模式可能是与高等动物类似的雌激素受体间接调控途径;同时根据omc基因存在多个与三羧酸循环和电子传递链相关的共表达基因的结果推测,DDT可能通过调控omc等基因来影响线粒体正常功能,进而对细胞产生毒害作用.图3表1参28     

13株真菌对聚β-羟基丁酸酯膜的降解特性

从不同来源的活性污泥中分离筛选出13株可降解聚β—羟基丁酸酯(PHB)的真菌，分别编号为DS9701、DS9702、DS9703、DS9704、DS9705、DS9706、DS9707、DS9708、DS9709、DS9710、DS9711、DS9712、DS9713．对DS97系列真菌降解PHB膜的特性进行了研究．结果表明，各菌株平均降解PHB膜速率之间的差异均达到极显著水平；13个菌株对PHB膜的降解可分为四种类型，即缓慢降解—快速降解—缓慢降解；缓慢降解—快速降解；缓慢降解—等速降解；缓慢降解—中速降解—快速降解。     

Pseudomonas sp.L19抗除草剂AHAS基因的克隆、表达及特性

乙酰羟酸合酶(AHAS)是磺酰脲类、咪唑啉酮类、三唑嘧啶类、磺酰胺类和嘧啶水杨酸类等乙酰羟酸合酶抑制剂类除草剂的作用靶标,获得能抗此类除草剂的AHAS突变基因资源具有非常重要的理论和应用价值.从长期使用甲磺隆的农田土壤中分离到1株对乙酰羟酸合酶抑制剂类除草剂有广谱抗性的菌株L19,根据表型特征、生理生化特性和16S rDNA序列系统发育分析,将其鉴定为假单孢菌属(Pseudomonas sp.).利用PCR技术从Pseudomonas sp.L19的总DNA中克隆AHAS基因,氨基酸序列比对结果表明,L19与对除草剂敏感菌株P.putida KT2440的AHAS调节亚基氨基酸序列完全相同,而催化亚基有4个氨基酸位点不同:[Val 29→Ala(L19→KT2440),Pro93→Ser,Val 345→Ala,Pro 484→Arg].分别将菌株L19与KT2440的AHAS催化亚基克隆到pET29a(+)的多克隆位点,构建了表达载体pET-L19AHASc和pET-KT2440AHASc,通过镍柱亲和层析纯化得到带有组氨酸标签的乙酰羟酸合酶.抗性试验结果表明菌株L19的乙酰羟酸合酶对四大类乙酰羟酸合酶抑制剂类除草剂的抗性均要强于KT2440的乙酰羟酸合酶,对甲磺隆、咪唑乙烟酸、唑嘧磺草胺和嘧草醚的抗性倍数分别达到53.6、9.3、8.2和9.5倍.菌株L19的乙酰羟酸合酶比活力、对ThDP和Mg2+的Kc值相应地比KT2440乙酰羟酸合酶的要低;而对底物丙酮酸钠的米氏常数Km值要比KT2440乙酰羟酸合酶的要高近1倍.     

两种启动子对聚γ-谷氨酸降解酶基因在地衣芽胞杆菌中的加强表达效果

聚γ-谷氨酸(γ-PGA)是一种应用前景良好的生物高分子材料.比较了蔗糖诱导的枯草芽胞杆菌果聚糖蔗糖酶基因(SacB)启动子和地衣芽胞杆菌α-淀粉酶基因启动子对γ-PGA降解酶基因ywtD在地衣芽胞杆菌中加强表达的影响.分别用SacB基因启动子和α-淀粉酶启动子构建了穿梭表达载体pHY300-SYT和pHY300-PYT,通过电转化地衣芽胞杆菌WX-02获得重组子SYT和PYT.酶活测定结果显示SYT和PYT中γ-PGA降解酶基因ywtD得到加强表达,摇瓶发酵结果显示两个重组菌株的γ-PGA相对分子质量都由1 000 000~1 200 000降低为800 000~900 000,PYT的γ-PGA产量较对照菌株PLK提高了33%,由13.50 g L-1提高到17.97 g L-1,而SYT的γ-PGA产量则降低为10.85 g L-1.因此,α-淀粉酶启动子更适合于在地衣芽胞杆菌WX-02菌株中表达γ-PGA降解酶基因,从而获得高产低分子量γ-PGA的工程菌.     

植物络合素及其合酶在重金属抗性中的功能研究进展

Under heavy metal stress, higher plants initiate a set of defense responses, among which biosynthesis of phytochelatins (PCs) is important. PCs are rich in cystein and biosynthesized by phytochelatin synthase. The chemical structure of PCs and their ability to form complexes with a large range of metal ions is clear. Up to now, these peptides are known to play an important role in both endogenous metal ion homeostasis and heavy metal ion detoxification. The mechanism of cadmium tolerance is illustrated in detail. A model of this mechanism suggested that the detoxification process of cadmium include such steps as PCs induction, transport of cadmium into the tonoplast, formation of the HMW-Cd-PCs complexes and sequestration in vacuole. At the same time, PCs also have other functions, such as detoxification of arsenic, protecting enzyme from metal ion inhibition and supplying metal ion as a cofactor to the enzyme potentially. However, a lot of questions about its biological function remain to be answered. In 1999, three independent labs isolated the genes encoding the PCs synthase. This breakthrough of plant heavy metal tolerance research gave us a chance to further study the heavy metal tolerance mechanism. All the results from the reserch of PCs have a ffreat application potential in phytoremidation. Fig 1, Ref 25     

Cloning and expression analysis of geosmin synthase gene from Aphanizomenon gracile北大核心CSCD

Geosmin is a secondary metabolite responsible for earthy odors. The occurrence of geosmin has great impact on the quality of water environment. The gene essential for geosmin biosynthesis have been identified in several species. But little is known about the mechanism of geosmin synthesis in Aphanizomenon gracile. This study attempted to clone the gene involved in geosmin biosynthesis of Aphanizomenon gracile a nd a nalyze t he geosmin production u nder d ifferent e nvironments. T he high-efficiency thermal asymmetric interlaced PCR (hiTAIL-PCR) was used to amplify the full-length of geosmin synthase gene from Aphanizomenon gracile (WH-1). Real time PCR (RT-PCR) was applied to quantify the geosmin production in different light and temperature. As a result, geo, a geosmin synthase gene from Aphanizomenon gracile (WH-1) was cloned by hiTAIL-PCR. The full-length open reading frame (ORF) of geo was 2 262 bp, coding for a protein of 753 amino acids. Meanwhile, WH-1 was treated with different environment conditions and mRNA expression levels of geo were quantified by RT-PCR. It was found that low temperature (15 °C), high light intensity (35 μmol m-2 s-1) and continuous light illumination were beneficial to the expression of geo. The successful amplification of geosmin synthase gene verified that hiTAIL-PCR is an effective and simple procedure of low cost. The result provides fundamental knowledge on the monitoring and prevention for odorants.     

桃ACC合酶基因组DNA（pACSG01）的序列分析及其表达

以桃基因组DNA为模板,用套式PCR技术扩增并克隆了桃ACC合酶基因片段,将其克隆（定名为pACSG01）并进行序列测定,表明该自然全长1320bp,并富含HindⅢ和EcoRⅠ位点,与其它ACC合酶基因结构序列有一定的相似性,内含有两个内含子,编码的氨基酸序列与已克隆桃ACC合酶cDNA推导的氨基酸序列的同源性分别为57．4％和56．8％,pACSG01与我们已克隆的两个桃ACC合酶cDNA基因表达有所不同,RNA点杂交和RT－PCR结合Southern杂交分析表明,该基因在成熟和乙烯处理的果实均不表达,伤处理、LiCl和生长素处理也不能诱导核基因的表达,在衰老花瓣中也不表达,图3参18。     

中药青蒿鲨烯合酶的大肠杆菌表达、纯化与功能鉴定

利用PCR方法,将经RACE方法克隆到的中药青蒿鲨烯合酶cDNA(AF302464)开放阅读框的3′末端截短99bp,插入到原核表达载体pET30a( )的NcoⅠ和BamHⅠ酶切位点之间,构建N端和C端均携带有HIS6表达标签的鲨烯合酶重组表达载体pETSSA.将pETSSA转入大肠杆菌BL21(DE3),0.5mmol/LIPTG(isopropyl-beta-D-thiogalactoside)28℃诱导重组鲨烯合酶的表达.表达产物经镍琼脂糖柱纯化.纯化蛋白加入酶促反应体系(含FPP和NADPH),GC-MS分析酶促反应体系的正己烷萃取物,结果显示重组鲨烯合酶可以催化FPP向鲨烯的转化.青蒿鲨烯合酶的功能鉴定为进一步利用反义或RNAi技术限制甾类生物合成,从而提高青蒿中的青蒿素含量提供了基础.图5参15     

MoO3掺杂WO3催化剂的制备及其光催化性能

采用低温水热法制备掺杂MoO3的WO3粉体,利用XRD,XPS,DRS和PL光谱对产物进行表征,以太阳光为光源对番红花红T溶液进行光催化降解研究.结果表明:MoO3掺杂含量为10%的WO3粉体对番红花红T溶液的脱色率为89.65%,COD去除率为88.9%.借助DRS和PL光谱分析结果,初步探讨了MoO3掺杂WO3粉体对番红花红T光催化降解的过程与机理.