根癌农杆菌介导工业化产甘油假丝酵母的遗传转化

通过构建质粒pCAM3300-zeocin,将其电击转化到根癌农杆菌LBA4404中.将含有目的质粒pCAM3300-zeocin的根癌农杆菌和工业化产甘油假丝酵母(Candida glycerinogenes)WL2002-5共培养,利用zeocin抗性基因为筛选标记,实现了pCAM3300-zeocin对产甘油假丝酵母的转化.并根据产甘油假丝酵母的生长特性,对转化条件进行了优化,在共培养时间为24h,产甘油假丝酵母和根癌农杆菌的细胞比例为1∶(500～1000)时最高转化率达到2个转化子/104个酵母细胞.初步建立了根癌农杆菌介导转化产甘油假丝酵母的转化方法.     

产朊假丝酵母CANDIDA UTILIS细胞壁对铜离子吸附位点的研究

目前认为所有生物大分子都对重金属离子有较强吸附性 ,但某些分子可特异地吸附重金属 ,并介导酵母细胞对重金属的抗性[1] .其中细胞表面的高分子聚合物倍受关注 ,酵母细胞壁约含 4 0种蛋白分子 ,但有关这些蛋白质在对重金属离子吸附中的作用目前还未见报道 .产朊假丝酵母Ｃａｎｄｉｄａｕｔｉｌｉｓ是重要单细胞蛋白生产菌株之一 ,因其营养条件要求不高 ,对工业废水有较强耐受和转化能力而广泛用于生产和研究 .我们观察了产朊假丝酵母细胞与分离纯化的细胞壁对铜离子的吸附能力差异 ,并对细胞壁上重金属离子吸附位点进行了研究 .1　材料与方…     

渗透压对产甘油假丝酵母磷酸果糖激酶和6-磷酸葡萄糖脱氢酶的调控

磷酸果糖激酶(PFK)和6-磷酸葡萄糖脱氢酶(G6PDH)分别是糖酵解途径(EMP)途径和磷酸戊糖途径(HMP)途径的关键酶,控制着流入两种途径的葡萄糖流量,对耐高渗产甘油假丝酵母(Candida glycerinogenes)高效合成甘油、抵抗渗透压胁迫非常重要.为考察渗透压对产甘油假丝酵母这两个关键酶的影响,首先克隆得到编码产甘油假丝酵母G6PDH的Cgzwf基因及编码PFK亚基的Cgpfk1和Cgpfk2,并通过生物信息学分析、酶活检测及基因互补实验验证它们的功能.渗透压胁迫发酵(添加50 g/L NaCl)结果显示,菌株生物量未受渗透压影响,但甘油积累量增加了2倍.与对照相比,盐胁迫激活PFK但弱化了G6PDH活性.此外,盐胁迫下PFK活性表现出更为明显的先降低后升高的趋势,而G6PDH活性的变化则与对照基本相似,表明盐胁迫下碳流可能存在EMP-HMP-EMP形式的不同程度偏转.转录水平检测发现,在发酵中的甘油积累过程盐胁迫对上述酶基因转录的影响并不明显,表明细胞可能通过酶活性调节而不是主要依赖于转录调节来调控两种关键酶以适应耐渗长期胁迫和甘油合成的需要.综上,产甘油假丝酵母以调节关键代谢酶活性的方式来实现碳硫偏转,高产甘油,从而适应外界渗透压力,这一结果可为阐明产甘油假丝酵母耐高渗和高产甘油机制提供新的信息,为未来代谢改造该菌株打下基础.     

稳定代谢葡萄糖和木糖产乙醇的重组酿酒酵母工程菌初步构建

分别克隆了休哈塔假丝酵母(Candida shehatae)的木糖还原酶基因XYL1和热带假丝酵母(Candida tropicalis)的木糖醇脱氢酶基因XYL2,构建出重组表达质粒pACT2-xy11和pDR195-xy12,并使其分别转化酿酒酵母受体细胞.酶活测定结果显示,转化子中木糖还原酶和木糖醇脱氢酶均在宿主菌中得到活性表达.并将这两个基因连同各自重组表达质粒上的表达元件进行了克隆,进而构建出重组酵母染色体整合质粒YIp5.kanR-x12,以期今后通过同源重组的原理将上述基因整合到发酵性能良好的酿酒酵母基因组中,得到稳定代谢葡萄糖和木糖产乙醇的重组酵母菌株.图3表1参15     

流加发酵及添加L-半胱氨酸对产朊假丝酵母高密度培养合成谷胱甘肽的影响

通过7L罐考察了不同葡萄糖流加速率以及添加L-半胱氨酸对产朊假丝酵母(Candida utilis)WSH02-08高密度发酵生产谷胱甘肽(GSH)的影响.结果表明,在恒定速度(5.5g L-1h-1)流加葡萄糖30h的基础上,发酵45h后细胞干重最高达到73g L-1,此时向发酵罐中一次性添加L-半胱氨酸40mmol L-1,最终GSH产量和胞内GSH含量分别达到了1458mg L-1和2.26%.图4表1参11     

T-2毒素的毒性效应及致毒机制研究进展

T-2毒素是由多种镰刀菌产生的单端孢霉烯族化合物中毒性较强的一种毒素,广泛存在于谷物和谷类食品中.经食物连续摄入T-2毒素会对人类和动物的健康造成潜在危害.目前,T-2毒素对人和动物健康的影响受到了社会的广泛关注,已成为毒理学领域研究的热点课题之一.在综述了T-2毒素的生物转化、代谢途径及其毒理学效应与机制基础上,对现...     

玉米培养物中T—2毒素的分离提取

本文研究了玉米培养物中T-2毒素的分离提取条件及T-2毒素在不同展开剂下的薄层色谱行为.建立了从发霉玉米中分离提取T-2毒素的方法,其中包括乙腈浸泡、石油醚去酯及甲苯-正丁醇(9:1)硅胶桂层析分离提纯T-2毒素.     

镰刀菌素对小鼠脂质过氧化的影响以及硒的保护作用

小鼠饮用含有0.25ppm Kappa-硒化卡拉胶硒的饮水两个月,全血硒含量和GSH_(px)活性均显著提高,与对照相比,血清荧光产物降低22％,肝脏荧光产物降低5％;而饮用含有10ppm镰刀菌素饮水的小鼠血清荧光产物提高了22％,肝脏荧光产物提高了13.6％;饮水中同时含有0.25ppm Kappa-硒化卡拉胶硒和10ppm镰刀菌素时,硒完全抑制了镰刀菌素促进脂质过氧化的作用.血清荧光光谱和全血红外差光谱提供了大分子结构变化的信息.     

景观水质净化菌剂的筛选、复配及净化效果优化

采用微生物技术解决城市景观水体自我净化能力差和富营养化严重问题是生物技术重要方法之一,本实验从安徽农业大学小池塘底泥中选育出具有超强水质净化能力的3株菌株,并标记为p1、XLX1和XLY1,通过形态、生理生化试验和基因序列比对分析,分别鉴定为沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris),解糖假苍白杆菌(Pseudochrobactrum saccharolyticum)和热带产朊假丝酵母(Candida tropicalis),并将其与本实验室已获得乳酸菌,施氏假单胞杆菌和枯草芽孢杆菌进行复配和净化效果优化的研究.结果表明,6株菌株之间无拮抗性,其最佳复配比例为p1∶HJ132∶XLY1∶XLX1∶HJ025∶HJ136=1.5∶0.5∶1∶1.5∶0.5∶1,复配后的水质净化菌剂在30℃,初始pH值为6.5,接种量为9%,培养时间为72 h,氮源为酵母膏+NH_4Cl,碳源为淀粉时净化效果最好,氨氮和COD的去除率分别达到了97.3%和77.7%.     

美洲大蠊可培养真菌多样性

为了解养殖环境下美洲大蠊携带真菌情况、促进其饲养和利用中真菌的卫生安全防控,以饲养和野生样品为材料,分离培养其体表和体内真菌,基于菌落形态,通过ITS rDNA片段测序和聚类分析进行菌种鉴定,并分析不同环境下美洲大蠊体表和体内真菌多样性和相似性.研究共分离鉴定211个菌株,划分为63个OTUs,至少隶属45属27科18目,以子囊菌门和担子菌门为主,其中酵母菌占绝对优势(76.8%),丝状真菌占分离菌株的23.2%.野生环境下美洲大蠊的真菌数量和多样性(131株,Shannon-Wiener指数H=3.391)均高于饲养环境(80株,H=3.140),二者物种相似度较低(Sorenson系数为0.3421);无论饲养还是野生其体表真菌数量和多样性均高于体内,体内真菌物种半数以上(饲养61.1%,野生57.9%)在体表同时检出,其中假丝酵母属、链状假丝酵母、尼泊尔德巴利酵母和哈萨克斯坦酵母属4个类群分布最广,在饲养和野生美洲大蠊的体表和体内均有检出.上述结果表明,美洲大蠊携带真菌与其生长环境具有相关性,控制饲养环境可降低虫体带菌数量;野生和饲养美洲大蠊体表体内均检出多种与条件致病菌和产毒真菌相关的物种,开发利用时应加以重视.(图4表3参37)     

Thermobifida fusca产角质酶摇瓶发酵条件研究

研究了环境和营养条件等对嗜热放线菌Thermobifida fusca WSH03-11生长及产角质酶的影响;并考察了苹果角质对角质酶诱导效果,分析了该菌产角质酶的机理.摇瓶研究确定了角质酶发酵的最佳种子培养基组成为90 g L-1可溶性淀粉、5 g L-1牛肉膏、5 g L-1酵母膏、5 g L-1NaCl、2 g L-1K2HPO4和1%微量元素液,生物量最高达18.5 gL-1,种龄取35～40 h.最佳环境条件为pH 8.0、5%接种量、培养温度50℃.最佳发酵培养基组成为1.5%乙醇、5 gL-1蛋白胨、5 g L-1酵母膏、2 g L-1K2HPO4、5 g L-1NaCl和1%微量元素液.发酵培养基中添加角质对角质酶合成与分泌有诱导作用,T.fusca的产酶机制为诱导型.采用上述最佳培养条件产角质酶为3.8 U mL-1.图4表3参9     

粮食及饲料中T-2毒素的测定

家畜及人类常因食用越冬饲料及发霉粮食而严重中毒,T-2毒素是霉菌毒素中毒性最大的一种。本文提出一种灵敏可靠的检查及分析粮食中T-2毒素的方法。即样品用乙腈提取、石油醚脱脂、旋转蒸发至干,残渣溶于丙酮中,经三甲基硅烷试剂衍生化后,进行定性定量分析。     

影响甜菜黑腐丝囊霉的几种生态学和生物学因子

通过对河西灌区甜菜(Beta vulgaris L.)黑腐病(Sugar Beet Black Rot)为期3a的研究，探讨了甜菜栽培品种与病害发病率及病原菌黑腐丝囊霉（Aphanomyces cochlioides)分离频率的关系以及3种环境因子即温度、pH值、不同天然培养基与甜菜黑腐丝囊霉的关系。结果表明：各栽培品种在田间的发病率与室内病原分离频率不同，其中工农2号田间发病率为1．3％，室内分离频率为93％，工农5号分别为1％和7．2％，宁甜301分别为2％和6．1％，工农2号具有更大的耐病性；甜菜黑腐丝囊霉的生长温度范围为5—30℃，最适温度为25—27℃，对高温敏感，33℃为其致死温度；甜菜黑腐丝囊霉可在pH3．5—11范围内生长，最适pH为5—9．9；甜菜黑腐丝囊霉在PDA、玉米粉琼脂、甜菜汁、麦芽糖—胨、麦芽糖酵母汁及燕麦琼脂培养基上均可生长，其中在甜菜汁培养基上生长最好．图4表3参11     

产甘油假丝酵母甘油分解代谢CgGCY1、CgGCY2和CgDAK基因的克隆、敲除及其功能

产甘油假丝酵母(Candida glycerinogenes)能够利用甘油大量生长菌体而无有机酸、醇等代谢物积累,是潜在的优良宿主细胞.为了解C.glycerinogenes甘油分解代谢途径,成功克隆得到二羟基丙酮(DHA)途径的编码基因Cg GCY1、Cg GCY2和Cg DAK.利用"Ura-Blaster"敲除盒分别构建的缺失突变菌Cggcy1?/gcy2?和Cgdak?均不能在甘油培养基中生长.q RT-PCR及酶活测定结果显示,与葡萄糖培养相比,甘油培养下细胞通过强化糖异生、HMP途径积累生物量,下调EMP途径和副产物合成关键酶表达以弱化有机酸、醇的合成,同时上调TCA循环以补偿EMP途径下调带来的能量和还原力不足,使得生物量提高24.5%而不积累有机酸、醇等代谢物.以甘油为共底物进行木糖发酵,木糖醇产量和转化率达到39.4 g/L和89%,与葡萄糖为共底物相比分别提高了79%和32.8%.本研究表明C.glycerinogenes甘油分解代谢仅依赖于DHA途径,以甘油为共底物更有利于木糖醇的合成和转化;结果可为代谢改造C.glycerinogenes以甘油为共底物合成高附加值化合物打下基础.     

环境CO2浓度升高对海洋有毒微藻生长及产毒的影响研究进展

近年来,由人类活动引起的近海环境污染不断加剧,这使得有害藻华(harmful algal blooms, HABs)暴发的范围及危害不断扩大,其中有毒微藻藻华也因其毒性效应而逐渐受到关注。18世纪后期以来,全球气候变化加剧了有毒藻华的发生和发展,其中有毒藻华暴发的潜力和危害性也可能增加,环境二氧化碳(CO₂)就是其中一个影响因素。到2019年为止,环境CO₂浓度已达到工业化(1750年)前的148%,对有毒藻华的发生、发展产生了重要影响。CO₂浓度的升高能够缓解微藻的碳限制,促进产毒藻类的固碳和生长;同时,CO₂溶于海水使得海水pH降低,也有可能对某些有毒藻华微藻的生长产生影响。CO₂浓度升高还会影响有毒微藻藻毒素的合成,提高产毒效率或促使毒素由低毒性组分转化为高毒性。本文综述了环境CO₂浓度升高对有毒藻华微藻生长和产毒等的研究进展,探讨了CO₂升高背景下有毒藻华暴发的潜力及危害性,以期为深入研究全球变化对有毒藻华的影响提供参考,并为...     

八种镰刀菌毒素的电子捕获气相色谱分析

通过对各种反应条件的选择,建立了八种主要镰刀菌毒素同时检测的电子捕获气相色谱分析方法(GC-ECD法).在SE-54涂布的弹性石英毛细管交链柱上,八种镰刀菌毒素达到完全分离。T-2毒素,HT-2毒素、新茄病镰刀菌烯醇、二乙酰蘸草镰刀菌烯醇,玉米赤霉烯酮等的最低检测限为5×10~(-11)g,脱氧雪腐镰刀菌烯醇、雪腐镰刀菌烯醇、镰刀菌烯酮-X的最低检测限为3×10~(-12)g.     

固定化微生物对养殖水体中NH_4~ -N和NO_2~--N的转化作用

采用聚乙烯醇 (PVA) (ρ=gL-1)的方法对沼泽红假单胞菌、诺卡氏菌和假丝酵母 3种菌株进行固定化 ,所得的凝胶颗粒机械强度好 ,经久耐用 .运用这 3种菌株的固定化细胞对养殖水体中NH 4 N和NO-2 N进行转化 ,其最适作用温度范围为 2 5～ 30℃ ,最适pH范围分别为 :6 .5～ 8.5 ,7.0～ 7.5及 5 .5～ 7.0 ,且对水质初始氮浓度有很强的适应性 .3菌株经固定化后 ,其对养殖水体中NH 4 N和NO-2 N的转化效率明显优于其游离细胞 .若将 3菌株按 2 :1:2组合成复合菌株并固定化 ,其对养殖水体中的NH 4 N和NO-2 N转化效果将更佳 .图 3表 3参 9     

环境和营养条件对煤油生物降解的影响

研究了南极假丝酵母（Candida antarctica)JWSH-112降解煤油烃的影响因素。利用正交试验方法，确证了最优条件为煤油14（ψ/%），NaNO32.0gL61,NaH2PO40.1gL^-1，蛋白胨2.0gL^-1，初始pH6.5，其中蛋白胨是影响JWSH－112降解煤油烃的重要因素。采用优化后的条件进行验证实验，煤油烃的生物降解率（49．2％）和细胞生长质量浓度（1.9gL^-1)均加高于正交试验中的最高生物降解率（47．9％）和细胞生长质量浓度（1.5gL^-1)。通过气相色谱定性分析发现，生物降解后煤油中的部分组份消失或含量明显降低。图6表5参13     

硒胁迫螺旋藻(Spirulina platensis)集落形成及富硒稳定性

探讨在琼脂糖半固体培养基中硒胁迫螺旋藻(Spirulina platensis,SP)集落形成及其富硒稳定性.培养基中添加亚硒酸钠,硒含量分别为2.5mmolL-1、5mmolL-1和10mmolL-1,培养并观察螺旋藻集落形成,挑取藻集落进行富硒培养,多次转种后,测定生长率、硒含量,筛选稳定的富硒螺旋藻.从含硒5mmolL-1的培养皿中挑选12个典型藻丝集落接种培养,发现其中6个生长率达到对照的80%,有两个藻集落(编号为SP0803和SP0809)硒含量较高,干藻硒含量分别为ρ(Se)=924μg/g和ρ(Se)=831μg/g,连续3次转种培养,藻体含硒量保持稳定.以上结果表明,利用琼脂糖半固体培养基进行微藻集落培养是可行的,并成功筛选到富硒螺旋藻.图3表2参12     

一株具有高产孢率的头孢霉型虫草菌

编号为CR 95 11的头孢霉型真菌 ,来自一种生长力和出子座率均高的大型新种虫草 ,是该虫草的无性阶段 .对这株真菌在PDA、Czapek’s和Sabouraud’s培养基上的生长性状和形态特征进行了初步的鉴定研究 .连续测定它的动态产孢数量 ,显示CR 95 11具有先缓而后上扬增速极快的产孢趋势 ,比之其它菌株有异常强劲的后续产孢能力和生长力 ,这是菌株对寄主昆虫强侵染力的一个标志特征 .其转折点出现在培养d 7～ 8附近 ,其中在PDA培养d 8的孢子日增加度 (斜率 )达到 2 .7× 10 7,此后加速升高 .将CR 95 11对 2 2株包括细菌、放线菌、丝状真菌和酵母在内的致敏菌株进行抗异实验 ,结果显示 ,CR 95 11只对枯草杆菌、产气杆菌和绿色木霉等 3株显示出明显的抑制能力 ,因而其抗菌活性的规律仍不明确 .然而 ,该菌能与一些酵母类共生 ,生长得到促进 ,是其具备较强生长力和感染力的又一种保证机制 .图 1表 2参 7