活性污泥高质量RNA快速提取方法研究

通过比较RNA产量、纯度、降解程度、特定基因的扩增能力、微生物多样性等评价指标,考察和探讨了5种不同RNA提取方法对活性污泥总RNA提取效果的影响并最终建立了一种快速、有效的活性污泥RNA提取方法,即在TENP和PBS洗涤沉淀污泥的基础上,分别采用溶菌酶和TRIzol裂解活性污泥细菌、氯仿去除细菌裂解液中的蛋白和大部分DNA、异丙醇沉淀核酸和DNase I水解残留DNA后,最后进一步用离心柱纯化RNA.结果表明,这种方法可以有效提取高质量的菌群RNA,不仅提取的RNA总量多(每g污泥可提取169.6μg RNA)、纯度高、降解程度低、完整性好、具有丰富的生物多样性,而且可同时进行16SrRNA和amoA基因的RT-PCR扩增反应;与其它方法相比,性价比高,具有明显的优越性,适用于活性污泥RNA的大量提取,同时,T-RFLP结果证明RNA提取方法对分析样品的微生物种类和丰度分析结果影响较大,不同的RNA提取方法所获得的微生物群落基因多样性及其种类、丰度均不同.本研究建立了一种快速、有效的高质量RNA提取方法,将在监测活性污泥菌群动态变化、菌群代谢功能学、微生物群落芯片等研究上具有重要意义.     

脱氮活性污泥总DNA提取研究

文章就提取SBR脱氮反应器中活性污泥总DNA的预处理、细胞破壁、去除蛋白质等方法进行了比较研究。将不同方法提取得到的DNA样品进行琼脂糖凝胶电泳、紫外吸光度和ERIC-PCR检测。结果表明,采取TENP、PBS溶液和玻璃珠震荡对活性污泥进行预处理,SDS和物理冻融结合破碎细胞,一次酚/氯仿和饱和NaCl溶液离心去除蛋白质的DNA提取操作,可以得到腐殖酸、蛋白质含量较少的活性污泥DNA样品。研究发现:从活性污泥提取的DNA样品中含有对PCR反应体系有明显抑制作用的杂质。通过稀释,控制DNA浓度40～13ng/μL,可以减小杂质的影响,实现将活性污泥DNA样品直接用于PCR扩增。ERIC-PCR得到的DNA产物凝胶电泳结果:条带清晰稳定有特异性,为进一步应用分子生态学方法研究活性污泥的性质奠定了基础。     

乳品废水活性污泥总DNA提取方法的比较

为了从乳品废水活性污泥中快速提取总DNA,本文系统对SDS高盐缓冲液抽提法、冻融+SDS高盐缓冲液抽提法、溶菌酶+SDS抽提法与冻融+溶菌酶+SDS抽提法等4种抽提活性污泥总DNA方法做了比较研究,并对提取的DNA浓度以及通过PCR扩增技术对DNA的质量进行了检测。结果表明:4种方法均可从乳品废水活性污泥中提取出DNA4,种方法提取的DNA总量与纯度存在差异,其中采用冻融+SDS高盐缓冲液抽提活性污泥总DNA效果最好,以该方法提取的总DNA为模板,PCR扩增16 SrDNA,可扩增出分子量为1.5 Kb左右的DNA产物。本文为研究乳品废水活性污泥总DNA的提取提供了一种简便、快速的方法。     

内循环UASB中微生物群落多样性分析研究

应用聚合酶链式反应(polymerase chajn reaction,PCR)结合变形梯度凝胶电泳(denature gadient gel elecophoresis,DGGE)技术对内循环UASB反应器内活性污泥的微生物多样性进行分析。通过OMEGA试剂盒的方式提取活性污泥中微生物的基因组DNA,以细菌通用引物进行16S rDNA基因V3高变异区域PCR扩增,再将PCR产物(约200bp)进行变性梯度凝胶电泳分离(变形梯度为30%⁶0%),从而获得表征污泥样中微生物群落特征的DNA指纹图谱。借助Quantity One软件对不同污泥样进行多样性分析。研究表明,内循环UASB反应器内不同取样口取得的活性污泥虽有着共同的和不同的微生物种属,但DGGE图谱中多为共同带,少有特征带,污泥样品间的相似性很高、微生物群落多样性基本一致。反应器内污泥混合均匀、微生物种类丰富,反应器运行稳定且有很强的抗冲击能力。     

活性污泥中的腐殖酸对实时荧光定量PCR的影响

活性污泥基因组中的腐殖酸会影响实时荧光定量PCR检测的准确性.本研究采用抽提基因组前腐殖酸去除试剂盒、抽提基因组后腐殖酸去除试剂盒、抽提基因组前后共同去除试剂盒3种不同的方法,去除活性污泥基因组中的腐殖酸,经过PCR和实时荧光定量PCR方法的验证找出腐殖酸去除的最适方法;通过DNA酶Ⅰ消化基因组DNA保留杂质腐殖酸,向其中掺入已知浓度的总细菌质粒,5个浓度10倍梯度稀释10 ng·μL~(-1)的定量模板,探究腐殖酸和梯度稀释模板对活性污泥总细菌实时荧光定量PCR的影响.结果显示,在不同处理组中,通过反复洗脱的方式在基因组抽提前去除活性污泥中的腐殖酸,DNA的得率(162.46 ng·μL~(-1))最多,A260/230值为1.34,A260/280值为1.80,腐殖酸的残留最少;去除腐殖酸后外加内标质粒组,梯度稀释10 ng·μL~(-1)模板100倍及以上,腐殖酸的抑制效应显著降低后保持不变(p0.05),100倍以内变化不显著(p0.05);抽提前去除腐殖酸组进行实时荧光定量PCR的抑制效率为6.16%,显著低于对照组的72.68%(p0.05).研究表明,抽提前去除活性污泥腐殖酸,抽提后将基因组模板稀释100倍可显著降低活性污泥实时荧光定量PCR的抑制效率,提高定量结果的准确性.     

活性污泥羟氨氧化还原酶粗酶提取及活性测定方法的优化研究

污水生物脱氮过程中N_2O的产生与活性污泥中细菌的羟氨氧化还原酶(Hydroxylamine oxidoreductase,HAO)活性有着密切关系.但目前活性污泥中细菌的HAO提取和活性测定方法尚未建立.本文首先探索了在25℃、酶活性反应液电子受体供体配比1∶1和终止剂选用2 mol·L~(-1)HCl条件下超声或高压破碎细胞法对HAO粗酶活性的影响,结果表明高压破碎比超声破碎获取的粗酶活性高(p0.01).在此基础上,我们进一步优化了高压破碎下压力大小、破碎次数和裂解液用量的参数.粗酶提取液中DNA含量、酶活力及酶比活力结果进行多因素方差分析表明压力大小(50、110或160 MPa)、破碎次数(1、2或3次)和裂解液用量(2、5或10 m L)均对脱氮活性污泥破碎效果、酶活性和比活力有显著影响(p0.01);综合DNA含量、酶活力及酶比活力结果看,110 MPa压力条件下,加5 m L裂解液破碎2次更适合污水生物处理中HAO的提取和活性测定,既节省时间,又能较好的保持酶活性.     

好氧活性污泥胞外聚合物的影响因素研究

研究了4种活性污泥处理工艺和两种污泥培养基质对好氧活性污泥胞外聚合物(EPS)的影响,包括对EPS总量和组分的影响。EPS的提取总量以TOC来表示,并以DNA的浓度来衡量提取过程中细胞裂解的程度。结果发现,处理工艺不同,导致EPS的含量和组成不相同,主要体现在蛋白质和多糖含量比的不同;淀粉基质培养的污泥的EPS总量平均值比葡萄糖基质培养的污泥的EPS总量平均值略高一些,它们都比实际污水处理厂污泥的EPS含量高。     

60Coγ-射线诱变活性污泥辅助处理生活污水的研究

利用^60Coγ-射线辐照处理活性污泥，分析测定了辐照处理前后活性污泥的性质参数、废水的氨氮、COD去除率，并研究了活性污泥总DNA含量变化，通过电泳检测DNA主带差异来比较生物群落的变化，并结合ERIC—PCR群落指纹图谱监测分析了辐照处理前后微生物群落结构的变化规律．研究了不同辐照剂量(50～3000Cy)的^60Coγ-射线辐照处理活性污泥对污水处理效果的影响．结果表明，辐照后的活性污泥SV30、SVI、MLSS、污泥增长率均低于对照，特别是污泥增长率，当辐照剂量为500Gy以上时呈直线下降；辐照处理活性污泥的污水COD去除率也低于对照，氨氮去除率在低剂量(50Gy、100Gy)时分别为92．95％和94．11％，处理效率优于对照，但随着剂量加大处理效果变差；活性污泥经一定的^60Coγ-射线照射后生物相发生了变化，其总DNA的含量，电泳图谱与PCR结果均存在不同程度的差异．当辐射剂量为3000Gy时对微生物杀伤较强，造成活性污泥基因组损害较大，其总DNA的PCR结果出现多态性，即微生物群落发生了本质的变化．     

不同好氧颗粒污泥中微生物群落结构特点

为了探讨活性污泥好氧颗粒化过程对微生物种群的影响、不同底物及不同颗粒化方法培养的好氧颗粒污泥中微生物群落结构的差异,以接种污泥、模拟废水好氧颗粒污泥和分别投加粉末活性炭和硅藻土的实际生活污水好氧颗粒污泥为研究对象,利用PCR-DGGE对比分析了接种污泥和好氧颗粒污泥中的微生物群落结构.结果表明:活性污泥好氧颗粒化过程会减少微生物种群多样性,影响颗粒污泥稳定性的细菌被淘汰,而聚磷菌、反硝化菌、难降解有机物降解菌等污水处理功能微生物都在颗粒化过程中得到保留.活性污泥好氧颗粒化过程中能够实现亚硝化细菌(AOB)一定程度的富集.与接种活性污泥相比,好氧颗粒污泥中AOB的多样性指数与均匀性指数均有提高.好氧颗粒污泥中的优势菌群主要分布于变形菌门(Proteobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)和未培养菌(uncultured bacterium).其中AOB均属于β-Proteobacteria的亚硝化单胞菌属(Nitrosomonas).     

基于污泥资源化利用的蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa)培养研究

利用废水或者废弃物培养微藻,不仅可使废弃物得到合理利用,还可为微藻培养提供廉价原料.以蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa)为研究对象,以污泥抽提液部分或全部替代SE(selenite enrichment)培养基,研究基于污泥资源化利用的微藻细胞培养方法.结果表明,当SE培养基与污泥抽提液比例为1∶9和2∶8时,相同条件下接种蛋白核小球藻培养14 d后,在波长为680 nm下其光密度分别为0.858和0.845,显著高于其它处理,当两者比例为0∶10和10∶0时,相应光密度分别为0.571和0.247.通过测定其色素和次生代谢产物含量时发现,当SE培养基与污泥抽提液比例为2∶8时,蛋白核小球藻的叶绿素、β-胡萝卜素和蛋白质含量最高.因此,剩余污泥抽提液可以部分作为培养蛋白核小球藻的良好基质,并且其培养效果明显优于其标准培养基.在本试验条件下,蛋白核小球藻培养的最佳条件是污泥抽提液比例为80%,该条件下蛋白核小球藻的生长状况较好,并且叶绿素与蛋白质含量最高.     

淀粉污泥酸处理产氢特性及微生物多样性研究

以淀粉厂厌氧活性污泥为对象,探讨了经酸处理后污泥的产氢特性.结果表明,酸处理后的活性污泥反应系统,其产氢量均大于未经处理的活性污泥反应系统,其中最适产氢酸处理pH值为4.0、处理时间为0.5 h.通过细胞裂解直接提取活性污泥细菌基因组DNA,PCR扩增细菌16S rRNA基因V3区和变性梯度凝胶电泳分离,获得酸处理活性...     

PCR-DGGE技术在城市污水化学生物絮凝处理中的特点

通过PCR-DGGE等分子生物学技术可以不经过常规培养直接从活性污泥和生物膜样品中提取DNA,对16Sr DNA V3区进行PCR扩增,结合DGGE(变性梯度凝胶电泳),从而分析活性污泥与生物膜中微生物种群结构.研究证实,活性污泥培养前后微生物种群结构发生很大的改变.同时对2种污水处理工艺中微生物种群结构进行了对比研究,对同一反应器不同位置微生物分布以及不同工况下的微生物种群结构进行了初步探讨.测定了活性污泥中部分菌种的16S rDNA V3区片段序列,通过NCBI(美国国立生物技术信息中心)基因库比对,初步确定细菌的属.结果显示,PCR-DGGE结合测序技术是一种完全可行的快速进行环境学样品微生物研究的分析方法.     

MBR活性污泥培养驯化过程中生物多样性研究

以MBR反应器启动调试阶段的活性污泥为主要研究对象,系统考察了传统活性污泥法(Conventional activated sludge,CAS)污泥接种至MBR反应器内污泥培养驯化过程中生物多样性情况及微生物群落结构的演变规律.同时,在传统污水污泥检测指标的基础上,对各阶段污泥中总细菌基因组DNA进行提取,应用PCR-DGGE分子生物学技术获得了相应的凝胶电泳图谱并进一步分析了菌群间的相似性.结果表明,以CAS污泥为接种污泥在MBR反应器内培养驯化过程中微生物的多样性变化突出,细菌群落结构演替明显,不同阶段菌群间的相似性说明了各阶段菌群的演变关系:污泥培养驯化是一个逐步有序的过程,微生物随反应器内不同时期及环境的变化而调整,逐渐演变成适应MBR工艺的群落结构.     

两种苯甲酸处理系统细菌群落结构的ARDRA分析

利用ARDRA(扩增rDNA限制性分析)的方法对两种驯化条件产生的苯甲酸活性污泥中细菌的群落结构进行了分析。提取污泥样品总DNA以后,利用细菌16SrDNA通用引物进行PCR扩增。结果显示:两种活性污泥分别有20.4%和24.3%的酶切类型是自身特有的,可见在微生物群落结构上差别显著。并且利用这种方法分别检测到了103和107种的微生物类型,而利用传统的纯培养手段则只分别分离到了7种和8种微生物,分别只占ARDRA方法的6.8%和7.5%,充分显示了分子生物学的方法在进行微生物群落结构研究方面所具有的优越性。     

壳聚糖活性污泥复合吸附剂的制备研究

为了提高污泥细胞吸附重金属离子的应用能力,采用壳聚糖包埋固定活性污泥,制备了粒径2~3 mm的壳聚糖活性污泥复合吸附剂SCTS.以吸附溶液中CrO2-4的吸附率为指标,通过单因素实验对制备过程中采用的2种固化液及5种发泡剂进行比选,考察了固化液浓度、发泡剂量、交联剂量、活性污泥与壳聚糖用量比值及发泡温度对SCTS吸附能力的影响,由正交实验确定影响因素主次顺序及最优水平组合.结果发现,固化液浓度、发泡剂量、污泥与壳聚糖用量比值及发泡温度对SCTS吸附能力影响较强,影响次序为固化液浓度发泡剂量活性污泥与壳聚糖用量比值发泡温度.最优水平组合为4 g·L-1三聚磷酸钠(STPP)固化液、剂量为吸附剂质量10%的NH4HCO3发泡剂、活性污泥与壳聚糖用量比值0.5、发泡温度100℃,此时CrO2-4吸附率最高可达97.3%.该吸附剂的制备研究为污泥的资源化利用探索了新的途径.     

污泥高温好氧消化过程的生物多样性分析

模拟单级污泥高温好氧消化工艺进行批式试验,分析了不同消化时期污泥中挥发性固体物质(VSS)的去除率.同时,运用现代分子生物学手段对活性污泥中提取的细菌基因组DNA进行PCR扩增,扩增产物经变性梯度凝胶电泳(DGGE)分离,获得微生物群落的DNA特征指纹图谱,初步探讨了高温消化时微生物多样性对污泥稳定化的影响.结果表明:污泥高温好氧消化时,VSS降解速率较快,消化120h即可达到38%以上的去除率;温度对消化体系中微生物的种群结构影响较为明显,芽孢杆菌是高温(55℃)消化时的主要种群;消化过程中,体系内部优势微生物种群结构发生了较大改变,这种及时调整使整个消化体系能尽快适应外部环境变化,从而加快污泥稳定化进程.     

剩余活性污泥中微生物蛋白质的提取工艺研究

利用剩余活性污泥中含有大量的微生物的特点,从中提取蛋白质是有效减少污泥二次污染的重要途径。运用单因素实验的方法,以蛋白质的"盐提-酸沉"为主要提取思路,同时结合研磨、离心、搅拌等多种工艺手段。改变提取液盐浓度、提取pH、样品和提取液的体积比、提取温度、沉淀pH、沉淀温度等参数对活性污泥中提取蛋白质效果的影响进行了研究。     

PCR-DGGE技术解析生物制氢反应器微生物多样性

为了揭示发酵法生物制氢反应器厌氧活性污泥的微生物种群多样性 ,从运行不同时期取厌氧活性污泥 ,通过细胞裂解直接提取活性污泥的基因组DNA .以细菌 16SrRNA基因通用引物F338GC/R5 34进行V3高变异区域PCR扩增 ,长约 200bp的PCR产物经变性梯度凝胶电泳 (DGGE)分离后 ,获得微生物群落的特征DNA指纹图谱 .研究表明 ,不同时期的厌氧活性污泥中存在共同种属和各自的特异种属 ,群落结构和优势种群数量具有时序动态性 ,微生物多样性呈现出协同变化的特征 .微生物多样性由强化到减弱 ,群落结构之间的相似性逐渐升高 ,演替速度由快速到缓慢 .优势种群经历了动态演替过程 ,最终形成特定种群构成的顶级群落 .     

同时提取土壤微生物DNA和RNA方法的研究

获得高浓度、大片段、多样性程度高的土壤微生物总DNA是研究土壤微生物群落结构的分子生态学基础.研究采用PBS缓冲液洗涤土壤样品,结合SDS裂解微生物细胞的方法,同时提取分别添加小麦秸秆粉和油菜秸秆粉的两种土壤样晶的微生物DNA和RNA.对提取出的DNA和RNA进行酶切,基因组PCR和反转录PCR,实验结果表明该法提取的...     

好氧污泥絮体与厌氧颗粒污泥的剪切稳定性分析

通过标准的剪切实验装置检测了好氧污泥絮体和厌氧颗粒污泥在不同剪切条件下剥离的分散胶体浓度的变化.结果表明,厌氧颗粒污泥的剪切敏感性(KSS)比好氧活性污泥高1个数量级,证明了好氧活性污泥的剪切稳定性更好.好氧活性污泥絮体在剪切下剥离的分散胶体平衡浓度(md,∞)分别随着污泥悬浊液的固体浓度(mT)和剪切强度(G)的增加而增加.AE模型的模拟结果显示,好氧活性污泥絮体样品1在剪切作用下粘附-剥离的平衡常数(Km)比样品2的高,相应的DG0adh/RT值更小,证明其在剪切作用下的粘附过程更易发生.修正AE模型可以更好地模拟不同剪切强度下污泥絮体上分散胶体的剥离过程,其不仅能够给出未施加剪切的稳定状态时因布朗运动而导致的分散胶体浓度,而且能确定与污泥絮体上分散胶体的剥离能量相关的DH/R值.模拟结果表明,好氧活性污泥絮体样品1上分散胶体的剥离需要更多的能量,剪切强度的升高对样品2的影响更加明显.活性污泥剪切稳定性的差异证明了其与污泥结构、性质以及污水处理厂运行效果之间的关系比较复杂.