海马齿小热激蛋白SpHSP18.1基因的克隆及盐胁迫表达分析北大核心CSCD

为探究海马齿高盐环境耐受性的分子机制,根据海马齿c DNA文库序列设计引物,采用RACE(Rapid amplification of cDNA ends)技术克隆得到海马齿小分子热激蛋白Sp Hsp18.1基因序列.Blast分析表明,该c DNA序列(968 bp)含完整开放阅读框(ORF)全长为489 bp,编码162个氨基酸.等电点(p I)为6.19,分子量(Mr)大小为1860 5.90.Sp HSP18.1编码氨基酸序列具有分子伴侣蛋白特有的ACD保守区域(Alpha crystallin domain),与拟南芥、西瓜等植物的细胞质I型小热激蛋白具较高同源性(>75%).将Sp Hsp18.1基因克隆到PUCm-T原核表达载体上,得到重组菌株,通过过量表达探究其耐热胁迫能力.结果表明,在37℃下重组菌株与野生型菌株的生长曲线基本相似,但在高温(45℃)下,重组菌株较对照组菌株存活率有显著提高.荧光实时定量PCR分析表明,在不同浓度海水培养条件下,海马齿根部均表达Sp Hsp18.1基因,且随着海水浓度的增加,该基因的表达量呈现上升的趋势.说明Sp Hsp18.1基因在海马齿应答高盐胁迫过程中起到一定的作用.     

瞬时表达比较马铃薯X病毒CP基因3种结构对RNA沉默的诱导效果

RNA沉默是植物抵御病毒侵染的一种防卫机制,病原来源的抗性(pathogen-derived resistance,PDR)被认为是通过RNA沉默起作用的.转化的核酸片段在基因组中的位置、长短和不同排列结构等均影响RNA沉默的效率.用全长马铃薯X病毒(PVX)CP基因构建非翻译的正义、反义和反向重复结构转基因的植物表达载体,通过农杆菌渗入法瞬时表达测试了这些转基因对RNA介导抗性的诱导效率和有效性.结果表明,反向重复的PVXCP是更为有效的RNA沉默诱导因子,同时也证明让目的基因在受试植物中瞬时表达,在转化植物之前能比较快速地检测转基因的表达情况以及表达产物的功能,从而节约时间和资源,并减少盲目性.图3表2参21     

RNAi技术及其在植物中的应用研究进展

RNA干扰（RNA inteffemnce，RNAi）是由双链（double-stranded RNA，dsRNn）所引起的序列特异性基因沉默。是真核生物中一种非常保守的机制．RNA干扰依赖于小干扰RNA（small interference RNA，siRNA）与靶mRBA之间的严格碱基配对，具有高度特异性．本文就RNM的发现、作用机制研究、特点、以及在植物功能基因分析、抗病毒与品种改良等方面的应用进行了综述，并对存在的问题和应用前景作了分析和预测．     

非损伤微测技术在植物生理生态学研究中的应用进展

非损伤微测技术(NMT)作为一项原位动态检测进出活体植株各种分子/离子流动速率和三维运动方向的微电极技术,以完全无损伤方式获取生物样品的实时生理生态信息,对于研究植物体生命活动规律以及植物与环境间的互作关系具有重要的生物学意义.本文综述了NMT在植物生理生态学领域内研究中的应用进展,主要集中于植物蛋白质功能、光合/呼吸作用、营养代谢调节机制、抗逆生理,以及植物生长发育过程、与微生物互作、生态适应性等方面.在研究植物抗逆生理方面,NMT可直观解析植物体内特定离子流的平衡转运过程,促进了植物的抗性性状信号的表达,有助于科学选育抗性优良植物品系;在植物生长发育阶段,离子流的检测能够在微观尺度上研究植物吸收营养的动态过程以及植物正常生长的稳态的内在调节模式;植物的生态适应性主要体现在NMT为剖析不同个体植物的生态耐受机理提供了生物技术支撑,进而可利用超富集植物进行土壤修复与改良.目前NMT自身仍存在局限性,尚未能全方位系统性解析植物的演化进程,在植物体结构与功能方面的应用研究亟待完善.因此积极密切生物学、生态学、环境科学等学科间的综合联动,逐步完善构建动态连续性的NMT分析植物形态结构与生理功能相关信息的技术体系,加强NMT与其他分析技术的结合应用将成为今后的应用研究重点.     

真菌提取物抑制烟草花叶病毒(TMV)研究进展

烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)是一种具有寄主范围广、抗逆性强、在农业生产上造成危害大和难以防治等特点的植物病毒.从真菌中筛选并获得具有抑制TMV的活性物质是当前研究热点.本文综述了国内外关于真菌中活性物质抑制TMV的研究进展,内容包括3个方面:具有抑制TMV活性物质的真菌种类,主要为侧耳、白蘑、红菇等科中的真菌;具有抑制TMV作用的活性物质成分,主要为真菌多糖和蛋白质;抑制TMV的作用机理,主要包括通过钝化病毒和封闭侵染位点抑制病毒的侵染,干扰病毒蛋白质合成和病毒离子装配抑制病毒增殖或扩散,提高防御酶活性和激活抗性相关基因表达从而诱导植物产生抗性.此外对真菌提取物抗TMV田间应用缓慢的原因进行了讨论.随着对真菌中抗TMV的作用物质及其结构、理化性质、表达基因及抗病毒机制的研究深入,人们对环境与安全问题的日益重视以及化学农药的使用限制,真菌源抗TMV物质具有广阔的开发前景.     

诱导型Hsp70在外源性甲醛对小鼠肝肾氧化损伤中的保护作用

为探讨外源性甲醛是否会对小鼠肝脏和肾脏的热休克蛋白70(heat shock protein 70, Hsp70)产生影响,选雄性Balb/c小鼠为研究对象,采用动态吸入方式染毒2周,每周5 d,每天8 h,随机分为空白对照组、3 mg·m-3甲醛染毒组。染毒结束后,计算肝脏和肾脏的脏体比,检测各器官中活性氧(reactive oxygen species, ROS)、丙二醛(malondialdehyde, MDA)、还原型谷胱甘肽(glutathione, GSH)的含量,同时用实时荧光定量PCR(real-time PCR, RT-PCR)法检测Hsp70的基因表达,并通过HE染色观察形态学变化。结果表明:与对照组相比,2种器官的脏体比均显著下降(P0.05或P0.01); ROS、MDA含量上升、GSH含量下降,出现显著性差异(P0.05或P0.01); Hsp70基因表达水平下降且差异显著(P0.05或P0.01); HE切片显示,甲醛暴露使肝脏的中央静脉窦的破损程度增加、细胞核变大,肾脏中肾小中肾小球基底膜变窄、体积缩小甚至分解。上述结果表明,甲醛暴露会对小鼠的的肝脏和肾脏造成不同程度的氧化损伤,小鼠可通过上调Hsp70的基因表达以增强机体的抗氧化能力。     

RBM3重组慢病毒载体的构建、包装和鉴定

构建含有冷休克蛋白RNA结合基序蛋白3(RBM3)基因的慢病毒表达载体,产毒感染ST细胞,以评价重组慢病毒载体提高RBM3蛋白表达的效果.应用分子生物学技术提取仔猪脾脏组织的总RNA,通过反转录方法扩增RBM3基因,将其连入慢病毒载体Plenti6/v5-DEST中,在感受态细胞DH5α中扩增培养,并进行RBM3基因的测序鉴定,将重组的慢病毒质粒转染293T细胞,收获病毒液,感染293T细胞并提取细胞RNA,用逆转录PCR方法检测RBM3 mRNA在感染病毒的293T细胞中的表达,用含有慢病毒空载体pLenti6/V5-DEST的病毒液、含有重组慢病毒载体pLenti6/V5-RBM3的病毒液和无菌去离子水分别感染ST细胞后通过Western blot方法检测RBM3蛋白在感染病毒的ST细胞中的表达.结果表明:构建的慢病毒载体Plenti6/v5-RBM3经测序分析证实基因序列正确.包装后的慢病毒滴度为107 PFU/mL.逆转录PCR方法检测到感染病毒的293T细胞中,RBM3基因在转录水平上有表达,Western blot方法检测到感染病毒的ST细胞中,空载体组与空白对照组相比,RBM3蛋白表达量接近相同(分别为0.312±0.022和0.282±0.028);过表达组与空白对照组相比,RBM3蛋白表达量(0.568±0.045)显著增加(P0.05),RBM3蛋白在翻译水平有表达.因此,本研究构建的携带RBM3基因的重组慢病毒能够感染ST细胞,并使其RBM3蛋白表达量增加.图5参20     

薇甘菊颈盲蝽谷胱甘肽S-转移酶PmGSTd1基因克隆及表达分析

薇甘菊颈盲蝽(Pachypeltis micranthus)是入侵植物——薇甘菊(Mikania micrantha)的重要天敌昆虫,专食薇甘菊。谷胱甘肽S-转移酶(GSTs)是一种多功能蛋白,在代谢有毒化合物的过程中起着重要作用,探明其在不同部位的表达情况,可为深入研究其在薇甘菊颈盲蝽与寄主互作中的作用奠定基础。采用RACE技术克隆薇甘菊颈盲蝽GST基因,实时荧光定量PCR检测其在不同部位的表达情况。结果表明,Pm GSTd1基因全长977 bp,共编码240个氨基酸,理论分子量为27.28 kDa,N端1-18号氨基酸为信号肽,与温带臭虫(Cimex lectularius)GST基因的亲缘关系最近。该基因在雌、雄虫的各部位均有表达,且皆表现为足部表达量明显高于其他部位;雄虫各部位的表达量(残体除外)均显著高于雌虫,雄虫翅膀、触角、足部、残体中的表达量分别是雌虫相应部位的4.49倍、2.11倍、1.68、1.33倍。雌虫触角和残体中PmGSTd1的表达量基本相同,翅膀中的表达量显著低于其他部位;雄虫触角与翅膀中的表达水平基本相同,残体中的表达水平显著低于其他部位。薇甘菊颈盲蝽PmGSTd1是属于GST Delta家族的分泌蛋白,此基因功能可能包括代谢食物源毒素、降解气味分子及飞翔肌的结构蛋白。     

甜橙CsHAC1基因克隆及其在响应柑橘黄龙病侵染过程中的表达

为揭示甜橙组蛋白乙酰转移酶1基因(CsHAC1)在柑橘黄龙病(HLB)侵染过程中的响应机制,利用PCR和RTPCR分别克隆该基因gDNA和cDNA序列,并进行系列生物信息学分析.同时,还对CsHAC1互作蛋白进行预测并研究它们在感染HLB的柑橘中的表达情况.结果显示,该基因编码序列(CDS)全长为5 307 bp,预测可编码含有1 768个氨基酸、无信号肽和跨膜结构的蛋白质.亚细胞定位预测的结果显示CsHAC1主要定位在细胞核.CsHAC1含有ZnF_TAZ、PHD、HAT_KAT11、ZnF_ZZ等多个保守结构域,蛋白互作预测结果显示CsHAC1与ZC3H19L、SUMOs和HAM1L等蛋白存在互作关系.启动子顺式作用元件预测结果显示CsHAC1启动子除含有大量光响应元件外还含有一些逆境(如低温、防御和应激、厌氧等)和激素(如脱落酸、生长素、水杨酸等)相关元件.通过分析CsHAC1及其互作蛋白编码基因在感染黄龙病的柑橘根和叶片中的表达情况发现,CsHAC1在叶片中的表达受HLB诱导,且与HAM1L的表达呈显著负相关.本研究结果表明CsHAC1可能和它的互作蛋白基因一起通过表观遗传调控参与柑橘对HLB侵染的响应.(图9表3参48)     

植物修复土壤重金属污染中外源物质的影响机制和应用研究进展

重金属进入土壤后难以被降解,并通过食物链在生物体内富集,长此以往会导致中毒、癌症、畸形、突变,严重影响了人类生产活动及地球生态系统的稳定。植物修复技术是一种经济有效的重金属污染修复技术,其依靠超富集植物强大的自身抗性机制,从土壤中提取或稳定重金属,达到污染治理的目的。然而修复土壤重金属污染的超富集植物通常生长缓慢、生物量低,其抗性机制也会受到植物本身对重金属胁迫的阈值限制,当胁迫超过这个阈值,植物修复的效率就会大大降低甚至失去修复功能。文章在解析植物重金属相互作用机制的基础上,综述了添加外源物质对重金属毒害植物的缓解效应以及其在强化植物修复土壤重金属污染中的应用研究进展;介绍了应用外源物质调控植物吸收转运重金属的3种途径,分别为提高土壤重金属生物利用度、促进植物生长以及增强植物耐性。提出了应用外源物质作为强化植物修复措施的潜力及今后的研究方向,其未来的研究应着重于以下方面:明确外源物质的应用浓度、时期、方式与植物吸收转运重金属之间的关系;从植物内源激素及信号分子间的互作、抗逆基因表达、内生及根际微生物等不同层面上揭示外源物质对植物积累重金属的调控机理;开展外源物质与其他植物修复强化技术的联合应用研究。这些研究可为土壤重金属污染的植物修复技术及其强化措施研究提供科学依据,同时也对植物修复工程技术的发展实践具有一定的指导意义。     

非洲菊SPFH基因家族的鉴定及表达

SPFH(Stomain,Prohibitin,Flotillin and Hflk/C)超家族蛋白是锚定在膜微区的多样化膜蛋白家族,参与调控植物的生长发育、响应生物或非生物胁迫.基于非洲菊转录组数据,利用生物信息学对SPFH(GjSPFH)家族成员进行鉴定,分析其基本理化性质、亚细胞定位和保守氨基酸序列,构建系统进化树,并进行蛋白互作预测.利用转录组FPKM值分析GjSPFHs在非洲菊健康及感病时期的表达水平;利用荧光实时定量技术检测GjSPFH家族成员在不同组织(根、茎和叶片)和不同激素(水杨酸SA和茉莉酸甲酯MeJA)处理下的表达模式.结果表明,非洲菊包含8个GjSPFH成员,其蛋白长度在285-393 aa之间,蛋白理论分子量在31.22×10³-43.14×10³之间,等电点为5.53-9.80,其中有4个蛋白为稳定蛋白,4个为不稳定蛋白;均定位于线粒体,含有15个保守氨基酸序列;GjSPFH可分为3个亚组;该蛋白家族不仅成员之间可以发生互作,还与其他蛋白互作.非洲菊GjSPFH基因家族能够响应根腐病胁迫,GjPHB6在感病时期表达...     

表达马铃薯Y病毒外壳蛋白基因的转基因烟草抗病机制

根据已报道的马铃薯Y病毒坏死株系(PVY^N)核苷酸序列，克隆了PVY^N外壳蛋白(CP)基因，通过根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)LBA4404介导的方法，转化烟草NC89，获得了38株PCR呈阳性的转基因植株．攻毒试验发现，转基因植株对PVY^N的抗性水平存在着差异，其中有4株表现为高度抗病性．Southern blot表明，PVY^N CP基因已经整合到烟草染色体中，转基因的拷贝数与植株的抗病性成正相关．Northern blot表明，PVY^N CP基因在RNA水平上得到了表达，而且PVY^N CP RNA在细胞中的积累量与转基因植株的抗病性呈明显的负相关．Western blot表明，高度抗病植株未检测到转基因CP蛋白质，而抗病和感病植株都检测到了PVY^N CP蛋白，且不同抗性的转基因植物中转基因蛋白质的积累有一定的差异．实验结果表明，表达PVY^N CP基因的转基因烟草其抗病机制类似于转录后的基因沉默，即抗病件可能是RNA介导的．     

植物挥发性有机化合物研究方法进展

植物产生的挥发性有机化合物在调节植物与周围环境间的信息交流中起着重要作用,是生态系统中重要的化学信号物质。植物挥发性有机化合物在植物间的化学通讯、植物化感作用,植食性昆虫的寄主选择及天敌对植食性昆虫的定位等生态过程中发挥着重要的作用,是植物和昆虫长期协同进化、互相适应的结果。文章主要介绍植物挥发性有机化合物的收集方法——固相微萃取法和固体吸附法的原理、方法和应用注意事项等,比较了不同收集方法的优缺点。同时介绍了植物挥发性有机物化合物常用的气相色谱或气相色谱-质谱联用分析测定方法及植物挥发性有机化合物对昆虫和天敌行为的影响等,并在此基础上展望了今后植物挥发性有机化合物研究方法方向,为下一步开展植物挥发性有机化合物研究方法提供参考依据。     

植物镉耐性/富集基因的筛选方法

植物耐受/富集镉（Cd）是一个复杂的过程,涉及转运蛋白家族、螯合蛋白家族、抗氧化系统等多个方面的参与。文章综述了植物Cd耐性/富集基因的筛选方法,包括抗性表达文库、Cd抗性突变体的图位克隆、基因差异表达、电子克隆。筛选Cd抗性植物cDNA酵母表达文库可鉴定与金属束缚、隔离及外排相关的膜转运蛋白;筛选重金属敏感拟南芥突变体和图位克隆突变基因可鉴定与谷胱甘肽和植物螯合肽合成相关的酶;第二代测序技术、基因差异表达分析则是鉴定Cd响应基因以及揭示金属型植物与非耐性植物表型差异分子基础的有效方法;电子克隆也被应用在模式植物中鉴定重金属转运蛋白家族的编码基因。在此基础上,简述了Cd耐性/富集基因在改良植物Cd耐性或富集上的应用。     

龙眼miR167家族分子特性及其潜在靶标在体胚发生早期的表达模式

为了解miR167家族成员的分子特性及其可能互作的靶标在龙眼体胚发生早期的调控机制,采用生物信息学分析方法进行龙眼miR167基因家族序列分析、二级结构预测、分子进化树分析、靶基因预测及其靶标特异表达的FPKM值分析,并采用实时荧光定量PCR技术(quantitave real-time PCR,qPCR)检测miR1...     

龙眼MADS-box基因家族的全基因组鉴定及表达模式

为了解龙眼MADS-box(DlMADS-box)家族的分子进化特性及其对光质、激素的响应,以及该家族成员在龙眼不同组织部位及体胚发生早期的表达模式,对DlMADS-box家族成员进行全基因组鉴定,采用生物信息学方法对其理化性质、进化树、基因结构、保守基序、启动子顺式作用元件、蛋白互作网络进行分析及预测,并分析其在龙眼体胚发生早期、不同组织部位、光照及激素处理下的FPKM值.共鉴定出91个DlMADS-box成员,分为type-Ⅰ型（62个）和type-Ⅱ型（29个）.大部分DlMADS-box为不稳定亲水性蛋白;type-Ⅰ型大部分成员含1个或不含内含子,type-Ⅱ型大部分成员含7个内含子;DlMADS-box所有成员均含有MADS-box结构域（motif1）,大部分type-Ⅱ型蛋白含有K-box结构域（motif10）. DlMADS-box启动子区含有光、植物激素和生长发育等顺式作用元件,且发现DlMADS-box蛋白可与该家族成员或其他家族成员之间发生互作.利用转录组数据对DlMADS-boxs成员的表达模式分析显示,大部分DlMADS-box在非胚性愈伤组织阶段中高水平...     

侵染大豆的蚕豆萎蔫病毒研究

从杭州市郊的大豆病株上获得一病毒分离物Ｓ１,温室人工摩擦接种７科１６种植物,Ｓ１能侵染其中的５科１４种植物．Ｓ１能由桃蚜、豆蚜以非持久性方式传毒,该分离物的钝化温度为５０～５５℃,稀释限点为１０－３～１０－４,体外保毒期为３～４ｄ（２５℃）．用昆诺藜作繁殖寄主可提到大量球状病毒粒子,ｄ为２５～３０ｎｍ．病毒外壳蛋白主要由两种亚基构成,Ｍｒ分别为４４．７×１０３和２１．９×１０３,病毒基因组由两条ＲＮＡ分子组成,大小分别为６．２ｋｂ与３．８ｋｂ,Ｎｏｒｔｈｅｒｎｂｌｏｔ结果显示３．８ｋｂＲＮＡ与ＢＢＷＶ２蚕豆分离物ＲＮＡ２ｃＤＮＡ有明显杂交反应．病毒粒子电泳后产生相似于豇豆花叶病毒科的快、慢两个电泳型．琼脂双扩散试验中,Ｓ１和ＢＢＷＶ２均能与蚕豆萎蔫病毒２（ＢＢＷＶ２）抗血清形成明显沉淀线,且沉淀线互相融合,Ｗｅｓｔｅｒｎ检测亦表明,此分离物的大小亚基均可与ＢＢＷＶ２抗血清反应．根据以上特性,Ｓ１分离物被鉴定为ＢＢＷＶ２．     

水稻RBX1基因cDNA的分离及其过量表达载体对水稻的转化

RBX1蛋白是基于Cullin蛋白的E3复合体中的一个亚基,对于基于Cullin蛋白的E3复合体结合E2及Cullin蛋白的活化具有重要作用.利用RT-PCR分离到水稻RBX1cDNA,序列比对分析显示,水稻RBX1与拟南芥、人、果蝇及酵母中该同源蛋白的氨基酸序列一致性分别为80%、74.4%、72%和51.2%.酵母双杂交实验显示,水稻RBX1与水稻Cullin4蛋白有着相互作用.将水稻RBX1cDNA插入植物表达质粒pHB,利用农杆菌介导法将构建好的植物表达载体导入水稻,获得植株38株.以基因组DNA为模板对潮霉素抗性基因片段进行扩增,初步确定其中32株为转基因植株.图5表1参17     

BDE-47对人胚肾细胞HEK293的毒理效应及作用机制

2,2’,4,4’-四溴联苯醚(BDE-47)是生物体中含量最高且毒性最强的PBDEs之一,有关BDE-47对肾细胞的毒性及其作用机制的研究仍有待补充。选取3个剂量组(低:10-6mol·L-1、中:10-5mol·L-1、高:10-4mol·L-1)及溶剂对照组,研究了BDE-47对人胚肾细胞(HEK293)的细胞凋亡率及活性氧(ROS)水平的影响;并从分子水平对细胞氧化损伤、凋亡相关蛋白(APE1及p53)及凋亡相关基因m RNA(p53、Bax、Caspase 3、Caspase 8)的表达量进行测定。实验结果显示:与对照组相比,中、高剂量组细胞凋亡率显著增加(P0.05);ROS水平在中剂量组显著上升(P0.01);随BDE-47浓度的变化,APE1蛋白表达量与细胞ROS水平存在一致性;p53、Bax、Caspase 8 m RNA表达量与BDE-47的浓度间存在剂量-效应关系。结果表明,BDE-47可诱导HEK293细胞凋亡及氧化应激,APE1可能是细胞ROS升高与细胞凋亡间重要的中介因子;BDE-47可以通过影响Caspase 8及线粒体途径中p53及Bax的表达诱导细胞凋亡。     

荧光假单胞菌高效广谱载体的构建及分析

为促进高GC含量基因在荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)中表达效果更加理想、操作更加简便,本研究首先采用不依赖基因序列和连接反应的克隆(Sequence and ligation independent cloning,SLIC)方法将载体pCIBhis上与复制相关的序列和标记基因片段构建成克隆载体pCIBS1.然后优化荧光假单胞菌转化方法,用电转化法将pCIBS1导入荧光假单胞菌BL915中,随后又将T7和tac基因启动子分别插入pCIBS1中,成功构建了表达载体pCIBS3和pCIBS2.研究发现载体pCIBS1在大肠杆菌和荧光假单胞菌中均较为稳定,并且将绿色荧光蛋白基因插入表达载体中,在大肠杆菌BL21(DE3)中获得表达,验证了表达载体功能.本研究构建的表达载体和建立的荧光假单胞菌BL915电转化方法,为高GC含量基因在荧光假单胞菌中的表达奠定了基础.