BnGID1基因过量表达对甘蓝型油菜矮化突变体NDF-1株高的恢复

在正常株高油菜中克隆了与拟南芥矮化突变相关基因AtGID1同源的BnGID1基因全长cDNA目的片段,将其正向插入表达载体pFGC5941上的CaMV35S启动子下游,构成该基因过量表达载体pFGC5941-BnGID1.经根癌农杆菌介导,导入甘蓝型油菜矮化突变体NDF-1基因组,通过PCR及半定量RT-PCR检测,确定得到抗性转基因植株23株.移至大田生长,观察结果显示,转基因植株明显高于对照矮化突变体NDF-1,平均高出49.05cm.结果表明,BnGID1基因过量表达能够使甘蓝型油菜矮化突变体NDF-1株高得到较大程度的恢复.图7表2参16     

甘蓝型油菜半胱氨酸蛋白酶cDNA的克隆及组织特异性表达分析

采用SSH (Suppression subtractive hybridization)和Race-PCR (Rapid-amplification of cDNA ends)技术克隆得到来自甘蓝型油菜(Brassica napus L.)矮化突变体'NDF-1'的一个差异表达基因编码区的全长cDNA序列,命名为Bncp5.该基因全长1 224 bp,含有1 080 bp的完整开放阅读框,编码359个氨基酸.该基因编码区与甘蓝中一个与衰老相关的半胱氨酸蛋白酶基因(登录号AF454960)同源性达97%,氨基酸序列同源性达到100%. Bncp5编码的蛋白相对分子质量为39.5×103,等电点为5.57.对其活性位点的分析表明其具备真核生物半胱氨酸蛋白酶的活性中心,且有很高的功能区段保守性,推测为一跨膜蛋白.相对定量PCR的检测结果表明, Bncp5在野生型和矮化突变体的根、茎、子叶和真叶中都有表达,但是表达量存在显著性差异.在野生型高秆油菜中,根的表达量最低,在真叶的表达量最高;在矮化突变体中,根、茎中的表达明显高于野生型,而在子叶和真叶中的表达量与野生型油菜的表达量基本一致.     

苯系物联合暴露仿刺参管足转录组差异表达基因分析

为了分析苯系物(BTEXs)联合暴露后仿刺参(Apostichopus japonicus)管足转录组差异表达基因,采用Illumina Hi SeqTM2000测序技术,对1.0 mg·L~(-1)苯系物(B)联合暴露12 h后和对照组(C)的仿刺参管足组织分别进行转录组测序。经Trinity软件进行de novo组装,获得了145 675条unigenes。利用公共数据库进行同源比对,共注释了35 330条unigenes。对比分析苯系物联合暴露组和对照组的转录组测序结果,获得了2 418个差异表达基因(DEGs)(|Log2Fold changes|≥1且FDR≤0.001),其中,上调表达和下调表达基因分别为1 049和1 369个。GOseq分析结果显示,158个DEGs显著富集在149个GO terms中,包括103个生物学过程、17个细胞组分和29个分子功能(P0.05);KEGG代谢通路分析结果显示994个差异基因映射到268条代谢通路,这些差异表达基因参与的生理过程与其他生物的同源基因参与的信号传导、癌症、外源性化合物的生物降解代谢等过程相类似。上述结果为在转录组水平筛选苯系物的生物标志物,解析苯系物对仿刺参毒性作用的分子机制提供了科学参考。     

高效固氮大豆根瘤菌SMH12的全基因组测序及比较基因组分析

费氏中华根瘤菌SMH12(Sinorhizobium fredii SMH12),生长代时较短,属于快生型大豆根瘤菌. SMH12具有高效固氮、宿主范围广、匹配性强、遗传物质稳定等特点,为充分开发该菌应用潜力和研究价值,有必要解析SMH12的基因组序列.采用Illumina Hiseq与Pacbio测序技术相结合对SMH12菌株进行全基因组测序.进一步使用相关软件对测序数据进行基因组的组装、基因预测与功能注释、COG/GO聚类分析以及比较基因组分析.测序结果显示,SMH12基因组包含1条染色体和2个质粒,染色体大小为4 022 924 bp,质粒pSfSMH12a大小为2 394 395 bp,质粒pSfSMH12b大小为556 376bp,序列已提交至GenBank数据库,登录号为CP035038-CP035040.基因预测与rRNA、tRNA查找显示,SMH12基因组含有6 836个基因,有9个rRNA和55个tRNA.比较基因组分析的直系同源基因比对与共线性分析显示,SMH12与S. fredii HH103大部分基因相同,亲缘关系最密切;只有约17%的基因不同.COG分类比较分析显示,SMH12中转座因子和碳水化合物的转运与代谢这两类相关基因的占比明显高于Bradyrhizobium diazoefficiens USAD110.本研究首次报道SMH12基因组序列并分析了其基因组基本特征,与其他代表性大豆根瘤菌进行了比较基因组分析.结果丰富了根瘤菌基因组数据库,也为构建高效固氮的大豆根瘤菌工程菌提供了一定依据和基因资源.(图6表2参35)     

林丹通过MAPK和UPR通路与干扰线粒体功能诱导黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)肿瘤细胞迁移

环境污染物增加癌症死亡率的潜在机理研究尚需开展。选择与癌症致死显著相关的林丹作为目标物质,将黑腹果蝇作为受试生物进行暴露,对1 000μg·L~(-1)和对照组的果蝇样本进行实时聚合酶链式反应(RT-PCR),检测发现参与调控癌症细胞迁移的丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路中的MEKK和p38α、未折叠蛋白反应(UPR)中的ATF4、Ire1、PERK和XBP1等基因的表达量呈现显著下调(P0.05)。通过肿瘤迁移品系果蝇统计林丹暴露下肿瘤细胞迁移率,结果显示肿瘤细胞迁移率随林丹浓度升高而增加,1 000μg·L~(-1)林丹暴露组与对照组的果蝇肿瘤细胞迁移率分别为69.2%和45.9%,具有显著性差异(P0.05)。进一步的RNA测序结果表明,高浓度暴露组与对照组之间存在380个基因具有显著性差异(P0.05),其中含169个上调基因和211个下调基因。差异基因主要涉及水解酶催化活性(42个基因)、神经系统(20)、对化学刺激的感知(6)和线粒体(5)。差异基因的富集分析表明林丹的暴露主要改变蛋白水解过程(83个基因)、胞外区域(84)和催化活性(311),其对应的平均富集因子分别为1.59、1.52和1.24(P0.001)。差异基因的表达解释了林丹的暴露不仅致使线粒体功能障碍,而且影响蛋白水解酶活性,加速胞外基质降解,为肿瘤细胞迁移供能并提供微环境。     

苏云金芽胞杆菌YBT-1520中SigL及其增强子结合蛋白的结构与功能分析

为揭示SigL及其增强子结合蛋白(EBPs)在苏云金芽胞杆菌(Bt)中的调控功能,在全基因组测序的基础上,采用生物信息学方法,对YBT-1520菌株的SigL及其EBPs的结构和功能进行深入分析.结果表明,YBT-1520基因组中存在1个SigL和6个EBPs,而且EBPs在结构上具有丰富的多样性,包含了EBPs的所有可能的结构域组织类型.SigL所调控的基因涉及11个假定的COG代谢途径,其中包括能量代谢、氨基酸代谢、翻译与细胞周期等.根据EBPs在基因组的位置推测,YBT-1520的EBPs参与γ-氨基丁酸代谢途径、精氨酸代谢途径、支链脂肪酸降解途径、多糖分解代谢等代谢途径的调控.本研究将为揭示Bt杀虫晶体蛋白大量表达的调控机制提供新的思路.     

铅暴露U251细胞差异表达基因及相关通路(The Interrelated Pathways in Brain Human U251 Glioma Cells by Lead Exposure)

为探讨铅对体外培养的人神经胶质瘤U251细胞(human U251glioma cells,U251)暴露后基因表达的变化以及相关基因通路,选用乙酸铅暴露U251细胞.细胞在乙酸铅中暴露8h和24h后提取RNA,使用cDNA芯片分析基因表达情况,芯片扫描结果经归一化处理,设定Ratio值<0.5或≥2.0为表达有差异基因.结果表明,铅暴露U251细胞导致2840条基因差异表达,使用KEGG和BioCarta数据库分析代表性基因网络.结果发现,铅暴露U251细胞导致大量基因差异表达,涉及多个代谢及信号通路,与神经组织相关的主要信号通路有Ca2+信号通路、Jak-STAT信号通路、MAPK信号通路、Wnt信号通路等,还涉及配体-受体、细胞因子相互作用等.这些通路相互联结,构成复杂的网络系统,调控细胞的生物学功能.     

植物镉耐性/富集基因的筛选方法

植物耐受/富集镉（Cd）是一个复杂的过程,涉及转运蛋白家族、螯合蛋白家族、抗氧化系统等多个方面的参与。文章综述了植物Cd耐性/富集基因的筛选方法,包括抗性表达文库、Cd抗性突变体的图位克隆、基因差异表达、电子克隆。筛选Cd抗性植物cDNA酵母表达文库可鉴定与金属束缚、隔离及外排相关的膜转运蛋白;筛选重金属敏感拟南芥突变体和图位克隆突变基因可鉴定与谷胱甘肽和植物螯合肽合成相关的酶;第二代测序技术、基因差异表达分析则是鉴定Cd响应基因以及揭示金属型植物与非耐性植物表型差异分子基础的有效方法;电子克隆也被应用在模式植物中鉴定重金属转运蛋白家族的编码基因。在此基础上,简述了Cd耐性/富集基因在改良植物Cd耐性或富集上的应用。     

水稻不同亚家族SR蛋白的相互作用

精氨酸和丝氨酸富集蛋白(Arginine/ser ine-rich proteins,SR proteins)是剪切复合体中的重要成员.SR蛋白能够通过C端结构域相互作用并参与前体信使RNA的组成性剪切及可变剪切加工过程.为了揭示水稻SR蛋白间的相互作用网络,利用GAL4酵母双杂交系统,对来自不同亚家族的6个水稻SR蛋白进行相互作用分析.结果发现,来自两个不同亚家族的SR基因SCL30a和SC34共转化酵母能在相应缺陷培养基上生长,α-半乳糖苷酶活性约为对照的17倍,表明两者存在直接的相互作用关系,同时也暗示水稻可能通过SR蛋白直接相互作用,对重要基因的剪切加工及表达进行再次精细调控以应对外界复杂的环境变化.     

转基因不结球白菜实验地中外源基因流动及在不向作物中的自然渗入

首次报道了转基因不结球白菜实验地中 ,以除草剂抗性基因bar为标记基因的外源基因流动以及在芸薹属不同栽培作物中的基因渗入情况 .结果表明 ,外源基因能随花粉的散布流动 ,距离转基因花粉源越远 ,流动频率越低 .距离转基因白菜 0～ 3m处为花粉的主要流动区域 ,其频率占总流动率的 5 0 %左右 .2 0m隔离带后基因的流动频率仅为10m隔离带后的 1/2 0 .自然条件下 ,白菜中的外源基因在芸薹属同基因组作物中具有较高的渗入频率 ;在基因组具部分同源性的甘蓝型油菜中具一定的渗入频率 ;不能渗入甘蓝基因组中 .基因的渗入频率与作物间的亲缘性、隔离距离等多因素相关 .探讨了基因流动频率与基因渗入频率的差异 ,提出在有显性标记基因及花粉的供体、受体完全亲合的情况下 ,可以用基因的渗入频率来反应田间的基因流动情况 .图 4表 4参 12     

甘蓝型油菜脂肪酸链延长酶基因FAE1的克隆与原核表达

脂肪酸延长酶1(FAE1)是广泛存在于植物中并定位于内质网上的一种能催化脂肪酸碳链延长的酮脂酰CoA合成酶.根据Genbank上已知的植物FAE1基因设计引物,以从甘蓝型油菜叶片中提取的总DNA为模板,进行PCR扩增,获得了1380bp的片段.回收该片段,并连接到pMD18-T载体测序.序列比对结果说明了该片段与植物中已知的FAE1序列有极高的相似性,并且不存在内含子序列.将该片段通过高保真酶扩增,EcoRⅠ酶切消化后定向克隆到pGEX-2T表达载体中,在IPTG诱导下于28℃表达出Mr76×103的蛋白质条带.用兔抗GST多克隆抗体做第一抗体进行Western-blot检测,并获得阳性检测结果.这为甘蓝型油菜脂肪酸链延长酶基因FAE1功能的进一步研究奠定了基础.图4表1参14     

龙眼BRI1基因家族的全基因组鉴定及光照响应表达

为了解龙眼BRI1基因家族的生物学功能及响应光照机制,对其BRI1基因成员鉴定、基因结构、蛋白保守结构域、启动子顺式作用元件、互作miRNA预测、不同体胚发生阶段和不同组织器官的FPKM值及其响应光照表达模式等进行分析.结果表明:DlBRI1基因家族包含4个成员,分别命名为DlBRI1-1、DlBRI1-2a、DlBRI1-2b和DlBRI1-3.DlBRI1是一种无内含子基因,无内含子基因在转录的过程中不需要经历内含子的剪切步骤,是响应外界因素的一种快速应答基因.龙眼BRI1蛋白家族为植物富亮氨酸重复类受体蛋白激酶的一种,其在植物激素信号转导和非生物胁迫中具有重要调控作用.龙眼BRI1四个家族成员启动子均含有大量的光响应元件、激素应答元件、非生物胁迫响应元件,表明龙眼BRI1家族基因可能是连接光信号转导与激素信号转导的重要纽带. DlBRI1-3为miR390e的靶基因. FPKM值分析表明,DlBRI1-1和DlBRI1-3在体胚发生过程和不同组织部位中均呈现高表达,推测DlBRI1-1和DlBRI1-3可能在龙眼整个生长发育过程中起到更为关键的作用.荧光定量PCR结果推测,蓝光信号使得miR390的表达量显著减少,导致靶基因BRI1-3的表达量增加,从而影响油菜素内脂从属基因BZR1、转录因子PIF4,进而影响龙眼功能性代谢产物积累.本研究表明DlBRI1具有功能多样性,可能在龙眼响应光信号、激素信号、非生物胁迫及代谢调控中发挥作用.(图8表3参46)     

贝莱斯芽孢杆菌ES2-4的生防潜力及全基因组分析

葡萄座腔菌（Botryosphaeria dothidea）引起的苹果轮纹病易对苹果贮藏造成严重经济损失.从果园土壤中分离到一株细菌ES2-4,平板对峙试验显示其对葡萄座腔菌的抑制率为79.5%（扫描电镜观察到菌丝畸形）,其无菌发酵滤液处理苹果果实亦可显著抑制苹果轮纹病的发病程度.为探究其拮抗机制,采用Illumina和Pacbio第三代测序技术对菌株进行全基因组测序分析,基于管家基因gyrA测序鉴定,结合平均核苷酸一致性（ANI）和数字DNA杂交（dDDH）的比较基因组分析,将ES2-4鉴定为贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）. ES2-4基因组长3 929 792 bp,平均GC含量46.5%,共编码基因4016个,不含质粒.antiSMASH共预测到次级代谢产物基因簇14个,其中9个与surfactin、iturin、fengycin、macrolactin、difficidin、bacillaene、bacilysin、bacillibactin、amylocyclicin化合物合成相关基因簇完全一致或高度相似.此外,其基因组存在能够降解真菌细胞壁的糖苷水...     

胺碘酮通过诱发免疫紊乱加剧小鼠肝毒性

胺碘酮(amiodarone)是临床上广泛使用的第三类抗心律失常药物,临床研究已经发现长期服用胺碘酮会对人体造成副作用,包括肝毒性。鉴于人体与共生微生物形成了一个复杂的共生生态系统,口服胺碘酮对机体的影响,从药物吸收到直接或间接的药物作用,反映了药物与机体以及共生生态系统相互作用的结果。然而,胺碘酮对肝功能的影响及其潜在机制仍然知之甚少。本研究为探讨胺碘酮对肝脏的影响,建立了胺碘酮诱导小鼠模型,采用Lieber-Decarli液体饲料,分别设置200 mg·kg^-1的低剂量组和600 mg·kg^-1的高剂量组。研究发现胺碘酮处理28 d后,诱发小鼠肝脏转录谱发生改变,与对照组相比,胺碘酮处理组有1 634个差异基因表达显著变化,差异基因富集的KEGG信号通路包括PPAR信号通路、脂肪酸代谢信号通路、胆汁酸分泌、代谢外源物质的细胞色素P450信号通路等。此外,胺碘酮处理组肝脏结构和功能受到损伤,组织病理学分析显示肝脏出现微泡型脂肪肝,脂质新生相关的基因Acaca、Fasn和Srebf1表达上调。血清生化检测结果表明丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天...     

草菇6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶基因可变剪接体克隆与表达分析

6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶(6PGDH)是磷酸戊糖途径的限速酶,影响着细胞生命活动所需要的NADPH的产生.为揭示草菇菌丝生长的分子基础,通过克隆草菇6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶编码基因(6gpdh)的可变剪接体,测序后进行生物信息学分析,利用表达谱和qPCR测定了它们在同核体和异核体菌株的表达量.结果显示,草菇6gpdh序列全长2 315bp,含10个内含子,第6个内含子存在内含子保留的可变剪接.在同核体和异核体菌株中,内含子保留的可变剪接体表达量低,且菌株间没显著差异,而内含子被剪接的剪接体表达量高,且异核体菌株高于同核体菌株.两种可变剪接体具有6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶保守结构域和相似的三维结构.因此,初步分析两个可变剪切体是同工酶,内含子保留是组成型表达,表达量与菌丝生长快慢无关,内含子剪接是主效剪接方式,菌丝生长快的菌株表达量高,生长慢的菌株表达量低.图6表1参26     

提高天冬氨酸β-脱羧酶在酸性环境中催化活力的分子改造

克隆了德阿昆哈假单胞菌(Pseudomonas dacunhae)来源的L-天冬氨酸β-脱羧酶基因(Asd),实现其在Escherichiacoli中的异源表达,但该酶在酸性环境中活性较低,不利于工业生产.为通过定点突变技术提高该酶在酸性环境中的活力,选择底物通道区域内的5个氨基酸残基作为突变位点,构建6个突变体,随后分析突变体的酶学特性.结果表明,相比于野生型Asd,大多数突变体的比酶活显著下降,只有突变体N34D比酶活(71.67 U/mg)比野生型(65.95 U/mg)略高;另外,突变体N34D在3.5 pH 5.5酸性环境中的酶活力与野生型Asd相比均得到了提高,其中pH5.0条件下突变体N34D相对酶活达到82%,而野生型Asd相对酶活只有50%左右;而在pH 5.5-8.5范围内突变体N34D的酶活力与野生型相当.最后将突变体N34D应用于催化合成L-丙氨酸,在最适催化条件(pH 5.5)下,突变体N34D催化合成L-丙氨酸的产量是野生型Asd的1.5倍.本研究通过对德阿昆哈假单胞菌来源的N34位点进行突变,成功提高了天冬氨酸β-脱羧酶在酸性环境中的酶活力,并提高了其合成L-丙氨酸的能力,这对酶法生产L-丙氨酸具有重要的指导意义.     

大气污染物复合暴露后血浆microRNA芯片分析

随着miRNAs在循环系统中被检测出来,血浆miRNAs可以作为临床疾病早期诊断的生物标记物.为了探究交通和煤炭工业源大气污染可能对中枢神经系统产生的不良影响,本研究通过建立小鼠SO_2、NO_2及PM_(2.5)复合染毒模型,利用miRNAs芯片技术发现复合暴露后小鼠血浆中发生明显变化的miRNAs,并通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)方法验证芯片结果,使用miRanda、miRDB、miRWalk及Targetscan软件对发生明显改变的miRNAs进行靶基因预测,分析靶基因富集的基因功能(Gene ontology,GO)和信号通路(Pathway).结果提示,SO_2、NO_2及PM_(2.5)复合染毒可诱导小鼠血浆miRNA表达谱发生明显改变,低浓度暴露组与对照组相比共有19个miRNAs上调,7个miRNAs下调,高浓度组有64个上调,8个下调(变化倍数大于2),选择在两个浓度处理组中变化倍数均为最大的miR-144-3p及miR-122-5p用于生物信息学分析.qRT-PCR结果表明,miR-144-3p及miR-122-5p变化趋势与芯片一致.生物信息学分析显示差异表达miRNAs所调控的靶基因明显富集于30个GO(包括中枢神经系统发育、树突棘和神经棘等)和2条信号通路(轴突导向和癌症通路),揭示了差异表达miRNAs可能通过调控靶基因参与复合暴露介导的中枢神经系统发育.     

奥奈达希瓦氏菌(Shewanella oneidensis) MR-1对氟西汀降解过程的转录组及功能基因分析

该文研究了厌氧条件下奥奈达希瓦氏菌(Shewanella oneidensis)MR-1对氟西汀的降解性能,并从转录组学分析遗传分子代谢机制。结果表明,Shewanella oneidensis MR-1在厌氧条件下可有效降解体系中93.12%的氟西汀,降解速率达0.94 mg·L^-1·h^-1。采用Illumina高通量测序平台对降解氟西汀后的细菌与对照组细菌进行测序,通过基因本体数据库(GO)和京都基因与基因组百科全书数据库(KEGG)富集分析,结合筛选的高表达高上调的差异表达基因,得到了耐受和降解氟西汀的功能基因,其中包膜应激反应膜蛋白基因、ABC转运蛋白基因、噬菌体休克蛋白PspA基因、氧化应激防御蛋白基因等在Shewanella oneidensis MR-1对环境的耐受中起重要作用;细胞色素C基因、硝基还原酶NfsB基因、乳酸利用蛋白基因等在氟西汀的降解转化中起关键作用。该研究从转录组水平分析了氟西汀的降解机制,可为Shewanella oneidensis MR-1在环境修复中的应用提供参考依据。     

甘蔗蔗糖合成酶基因的克隆

促使蔗糖进入各种代谢途径的关键酶之一是蔗糖合成酶,它也是蔗糖代谢关键酶中极其重要的一种酶.以甘蔗基因组DNA为模板,用PCR技术分段扩增并克隆了甘蔗蔗糖合成酶(Sucrose synthase)基因片段,并进行序列测序,表明该基因全长约为7.5 kb,与Lingle S.E等报道的甘蔗蔗糖合成酶(SuSy2)基因序列相似性达到99.5%,推导的氨基酸序列同源性达到100%.该序列包含约1.9 kb的上游启动子调控区域, 16个外显子, 15个内含子, 3'不翻译区等,开放读码框(ORF)编码802个氨基酸,氨基酸序列中存在糖代谢关键酶家族保守的14-3-3蛋白磷酸化位点Ser/Thr,为进一步在转录水平上阐明蔗糖合成酶的表达调控机制奠定了基础.     

D.radiodurans kat A和kat B基因的结构分析与功能鉴定

以简并引物PCR获得的Cat酶基因片段探针,结合生物信息学方法,探明了耐辐射奇球菌（D.radiodu-rans)基因组中存在两个编码过氧化氢酶（Catalase,Cat)的基因：katA和B.katA和katB基因长2277bp和1611bp,各编码758和536个氨基酸,用pKK223-3表达载体连接katB基因,转入Cat酶缺陷型大肠杆菌（E. coliUM2)进行表达.katB基因表达产物具有Cat酶活性,电泳迁移位置与D.radiodurans CatB酶位置相符,并可重建E.coliUM2对低浓度H2O2损伤的耐受力。