基因工程

生物的每一性状都是由存在于细胞核里的一种遗传物质——基因负责传递的。基因是遗传物质的最小功能单位,是DNA(脱氧核糖核酸)分子中含特定遗传信息的一个片段,它控制细胞合成某种蛋白质,使生物表现出某种遗传性状。每一种生物体内都有很多基因,如人体就有8万个基因,分别控制着各种各样的遗传性状。一切生物的基因都是由DNA构成的,其基本结构一致,而且几乎所有生物的遗传密码都是通用的。因此,来自两种     

海洋沉积物中硫酸盐还原菌和硫氧化菌群落分析方法的比较

硫酸盐还原菌(sulfate-reducing prokaryotes,SRP)和硫氧化菌(sulfur-oxidizing prokaryotes,SOP)在硫的生物地球化学循环中发挥着极为重要的作用.本文以SRP作为高丰富度高多样性菌群代表,针对于SRP所共有的异化型亚硫酸盐还原酶(dissimilatory sulphite reductase,DSR)中的β亚基基因(dsr B),通过克隆文库技术、454高通量测序技术和Illumina高通量测序技术对其群落特征进行比较分析.结果表明,Illumina高通量测序技术优于454高通量测序技术和克隆文库技术,特别在低丰度物种的检测方面,Illumina高通量测序技术具有明显优势.以SOP soxB基因(~750 bp)作为较长基因片段的代表,分别采用454高通量测序技术和Illumina单端高通量测序技术对SOP群落组成和多样性信息进行比较分析,结果表明,454高通量测序技术在读长上的优势并未体现出来,而Illumina单端高通量测序技术优于454高通量测序技术.     

第二代测序技术的发展及应用

基于双脱氧核苷酸末端终止测序法的第一代测序技术,由于其通量低、成本高的缺点,逐步被第二代测序技术取代。基于高通量测序的第二代测序技术由于其通量大、可定量、成本低廉的优点,在各个领域方面的研究越来越广泛。该文首先详细介绍了以454测序、Solexa测序和SOLiD测序为代表的第二代高通量测序技术的原理、方法,并将以这3种测序方法为基础构建的3种测序平台的优缺点、适用研究对象、测序精确度等进行了对比总结,然后对第二代测序技术目前在土壤、沉积物、人体、海洋和污水方面等领域的应用情况进行了介绍。最后,对第三代测序技术的发展作了相应展望。     

基于玛氏骨条藻(Skeletonema marinoi)转录组的氮代谢途径解析

本研究分别选取了不同生长时期、不同温度培养以及低硅条件培养的玛氏骨条藻（Skeletonema marinoi）,以Illumina Hiseq 2000平台进行转录组高通量测序分析,共获得39,098个转录本。通过NR注释、GO注释和KEGG通路注释等一系列生物信息学手段对该转录组进行了基因注释和代谢途径分析。在此基础上重点分析了玛氏骨条藻的氮代谢途径,发现共存在20种酶和蛋白及6条相关代谢途径。对38个编码这些酶的基因序列比对结果表明,其与假微型海链藻同源基因具有较高的一致性。同时对这些样品进行数字基因表达谱分析,获得不同生长时期氮代谢途径中酶和蛋白的编码基因的差异表达情况:与对数期相比,在稳定期参与硝酸盐同化过程的两种酶（硝酸盐还原酶、亚硝酸还原酶）的基因和参与氨氮代谢的两种酶（氨甲酰磷酸合成酶和氨基甲酸激酶）的基因均有明显的上调表达,这是玛氏骨条藻对所处的不同生长状态下氮元素存在形态的变化所做出的分子响应。由转录组测序构建的代谢途径及相关基因的差异表达信息有助于对玛氏骨条藻氮代谢关键酶基因调控过程的解析,为进一步研究赤潮藻氮素营养限制过程中相关基因的表达调控模式奠定了基础,可为深入了解赤潮藻对营养元素的利用提供依据。     

环境样品中亚硝酸细菌amoA基因的克隆与测序

对从环境样品中分离的亚硝酸细菌(Ammonia oxidizingbacteria)amoA基因进行克隆与测序,为构建基因工程菌打下基础。采用亚硝酸细菌选择性培养基,从4个不同的畜牧养殖污水处理厂采集的样品(分别编号为1,2,3,4)在室温下富集培养2个月后,采取酚氯仿抽提的方法提取DNA。根据已报道的亚硝化单胞菌(Nitrosomonassp.)amoA基因序列,设计引物AMOB AMOE,并在AMOB,AMOE的5′-端分别加上了BamHⅠ和HindⅢ的限制性酶切位点,以利于进一步酶切和克隆。用AMOB AMOE对4种样品的DNA进行PCR扩增,PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析。结果表明,4种样品中1号和3号样品扩增得到预期长度的DNA片段,2号和4号样品扩增没有得到预期片段。回收纯化PCR产物与pGEM-T载体连接,构建amoA基因测序载体,并转化E.coliM15。测序结果提交GenBank进行Blast分析。结果显示,扩增得到的DNA片段均与Nitrosomonassp.GH22的amoA基因有99 7%的同源性,可从环境中分离的亚硝酸细菌中克隆出amoA基因。      

基于16S rRNA基因测序法分析北京霾污染过程中PM2.5和PM10细菌群落特征

2013年1月8~14日,北京出现了严重的霾污染.霾污染时高浓度的大气颗粒物增加了暴露人群的健康风险,而大气中的微生物也可能带来一些风险,但目前对霾污染时大气中微生物组成了解较少.本研究选取了2013年1月8~14日北京7d的PM2.5和PM10采样样本,通过对细菌16S rRNA基因V3区扩增和Mi Seq测序,得到PM2.5和PM10中的细菌群落结构特征,并将结果与相同采样样本的宏基因组测序结果及三项国外基于16S rRNA基因测序方法的大气中细菌研究结果进行了比较.研究发现7 d连续采样条件下,PM2.5中细菌群落结构在门和属的水平上均差别不大.在属级别上,节杆菌属(Arthrobacter)和弗兰克氏菌属(Frankia)是北京冬季大气中细菌群落的主要类群.16S rRNA基因测序与宏基因组测序结果对比分析发现,在属级别上,两种分析方法中有39个相同的属类群(两种分析方法丰度前50的细菌类群合并所得),弗兰克氏菌属(Frankia)和副球菌属(Paracoccus)在16S rRNA基因测序分析结果中相对含量较多,而考克氏菌属(Kocuria)和地嗜皮菌属(Geodermatophilus)在宏基因组测序结果中相对含量较高.在门和属的水平上,PM2.5和PM10中细菌群落结构特征呈现出相似的规律.在门水平上,放线菌门(Actinobacteria)在PM2.5中的相对百分比较大,而厚壁菌门(Firmicutes)在PM10中的相对百分比较大.在属水平上,梭菌属(Clostridium)在PM10中的相对百分比较大.与三项国外基于16S rRNA基因测序研究结果对比发现,尽管在采样地点和采样时间上有较大差异,大气中普遍存在一些相同的细菌类群,且近地面大气细菌群落结构特征相似度较高,区别于高空对流层中细菌群落结构特征.     

pUCD-recA重组发光菌构建及对遗传毒性污染物响应作用

基因重组发光菌在水质毒性的评价中具有重要的作用,本研究从分析污染物毒性损伤的机制出发,构建新型pUCD-recA基因重组发光菌.用PCR法从大肠杆菌W3110中扩增recA基因,将其与pGEM-T easy载体连接后测序.测序正确的recA片段及pUCD615载体均用BamHⅠ、EcoRⅠ双酶切,连接后电转化导入宿主菌JM109.挑取克隆,提取质粒用PCR鉴定,阳性克隆再进行测序.将构建成功的pUCD-recA载体转化入大肠杆菌RFM443,加入相应的遗传毒性污染物,观察发光响应作用.结果表明,recA基因PCR扩增出的片段为293 bp,测序结果与GenBank中的recA序列进行BLAST比对,同源性为99%,表明扩增序列正确.与pUCD615载体连接后的测序结果表明,recA基因已正确地插入到pUCD615的多克隆位点,方向和读码框正确,重组发光菌载体构建成功.将构建好的重组载体转化入RFM443宿主菌,加入遗传毒性污染物观察响应效果.丝裂霉素C(MMC)对pUCD-recA重组发光菌诱导效果最好,0.01 mg/L即可有很好的响应曲线;N′-甲基-N′-硝基亚硝基胍(MNNG)则在50~100 mg/...     

基于454和Illumina高通量测序平台对长江口邻近海域沉积物微生物群落的比较分析

作为第二代测序技术的主要平台, 454和Illumina测序方法在微生物核酸分析方面有着广泛应用。本研究以16S rRNA基因为标靶, 分别采用454和Illumina测序技术对长江口邻近海域表层沉积物中的微生物DNA进行分析, 通过对序列长度、微生物群落多样性及组成进行比较, 分析两种方法在沉积物微生物群落结构研究方面的适用性。结果表明, Illumina测序获得的序列数和OTU数要多于454, 其中获得的OTUs中以非优势菌群为主。Illumina与454相比能够检出更多微生物菌群, 且检测到的稀有菌群占有较大比例。综上可知, Illumina测序技术在分析微生物群落多样性及物种组成方面要优于454测序技术, 454的长序列优势并未能体现出来, 且454测序技术可能低估了微生物组成及其多样性。     

新世纪的忧患:基因污染

在上个世纪70年代基因工程技术兴起的时候，基因重组实验必须在“负压”实验室进行。在这里设立了各种等级的物理屏障以及生物屏障，以防止基因重组的生物（当时主要还是一些微生物）不致进入人体或逃逸到外界。虽然以后对非病原体基因工程实验的规定有所放宽，但有关生物安全的原则不变。对于基因重组实验，各国政府仍颁布了相应的操作规程，以防范重组生物进入人体或扩散到实验室外面。20年前，人们绝对不会想到今天有如此巨大数量的基因重组生物，堂而皇之地进入大自然之后，又进入了人体，且正在变异、重组、装配人类的基因。不可否认，国外现有已推广的几十种基因工程作物，虽然在审批时都认真考虑过它们对人体和对环境的安全性，但事实证明过去的考虑并不充分，认识也有局限性，更缺乏长期的数据。为了说明问题，我们先看看下面几则实例。这些资料都是美国依阿华州费尔菲德基因鉴定中心发布的。需要说明的是，该中心系世界上第一个专门为基因工程生物提供测试服务的机构，得到官方批准，其测试结果被公认为具有权威性。     

杨焕明持续解读生命密码

音乐家使用音符组成美妙的音乐;诗人凭借字句的安排咏出千古绝唱;基因测序研究者,则利用基因解读生命的密码,向人类探索生命本源的终极梦想不断迈进。     

北仑河口红树林沉积物微生物在潮间带的分布状况

以16S rRNA基因为分子标记,通过高通量测序方法分析了广西北仑河口高、中和低3个潮间带中红树林沉积物微生物群落结构。结果表明:北仑河口潮间带红树林沉积物中微生物多样性丰富,微生物Shannon指数变化范围在10.2~10.4之间。潮间带红树林微生物优势类群为Proteobacteria,Chloroflexi,Bacteroidetes,Planctomycetes和Acidobacteria。OTUs的维恩图表明3个潮间带中红树林微生物组成相似性较高。然而,热图和三相图分析发现潮间带的微生物种属特异性具有差异。高通量测序还发现北仑河口红树林中存在一些微生物参与有机物污染物降解和碳氮等元素循环。     

镍对人体健康的危害效应及其机理研究

镍是人体必需的生命元素,但过量的镍会对人体造成危害。本文主要从镍可引起炎症、癌症、神经衰弱症、系统紊乱、降低生育能力、致畸和致突变等方面概述镍对人体健康的危害效应,并从镍能影响遗传物质的合成、影响多种酶和内分泌腺的作用、引起基因点突变、基因丢失、基因扩增、产生“镍指”、形成N i2＋-肽复合物、诱导产生活性氧及其影响电解质中的离子含量等多方面阐述了镍对人体健康危害效应的机理,以期对防治重金属对人体的危害提供一些理论依据。     

基于转录组分析外源H2S对拟南芥芥子油苷生物合成的影响

外源硫化氢(H₂S)喷施拟南芥幼苗后,利用高通量测序技术对植株地上组织进行转录组测序,分析差异表达基因的生物学功能和代谢通路,探究H₂S对芥子油苷生物合成的调控作用.结果表明,100μmol/L H₂S处理3d后,拟南芥植株共有3160个基因差异表达,涉及细胞代谢、结合、催化、转录调控、物质转运、信号转导等过程.通过KEGG富集分析发现,差异表达基因在多个初生代谢和次生代谢通路显著富集,其中芥子油苷生物合成途径中9个基因差异表达(8个上调和1个下调),均为参与脂肪族芥子油苷合成的关键酶基因,而吲哚族芥子油苷合成相关基因表达无明显改变.同时,硫代谢、半胱氨酸和甲硫氨酸代谢、谷胱甘肽代谢途径中多个基因上调表达,说明外源H₂S可增强体内硫相关代谢活动,进而促进植物体内脂肪族芥子油苷的合成.转录因子差异表达分析显示,正向调控脂肪族芥子油苷合成的MYB29基因表达上调,而抑制其合成的MYB51基因表达水平降低,说明H₂S可通过调控MYB转录因子的表达来调节植物体内脂肪族芥子油苷的合成.对...     

邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯对罗非鱼肝脏转录组影响研究

邻苯二甲酸二（2-乙基己基）酯（DEHP）作为生产量和使用量最多的一种邻苯二甲酸酯类化合物,其对水生生物具有多种毒性.本研究选用中国南方地区最重要的经济鱼类尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus）作为实验对象,研究DEHP（50mg/kg bw）作用下罗非鱼肝脏组织内转录组的响应特征.利用IlluminaTM HiSeq 4000测序平台对DEHP处理组和对照组尼罗罗非鱼肝脏RNA样品分别进行转录组测序.对照组和DEHP暴露组分别获得30.10Mb和30.16Mb待分析数据（clean reads）,对转录组数据进行组装并去冗余后得到58,585个Unigene.将DEHP处理组和对照组的转录组数据进行比较一共获得5,008个差异表达基因,其中上调表达基因和下调表达基因分别为3,217个和1,791个.通过GO和KEGG功能分析后发现这些差异表达基因主要为机体免疫、生殖内分泌以及脂类代谢相关基因,这表明DEHP对尼罗罗非鱼肝脏毒性主要表现为免疫毒性、生殖毒性和脂类代谢紊乱.另外,实时荧光定量PCR验证结果发现转录组分析数据基本可靠.上述结果为在转录组水平筛选DEHP生物标志物,解析DEHP对罗非鱼毒性作用的分子机制提供了科学参考.     

海洋沉积物中细菌DNA和RNA水平群落差异

海洋沉积物中的微生物在生物地球化学循环中具有重要作用.目前,细菌群落的研究多基于16S rRNA基因(DNA)展开,但DNA不仅包括活性微生物DNA也包括非活性微生物DNA,而RNA水平则可表征环境中具有活性的微生物种群.本研究采用荧光定量PCR和Illumina高通量测序技术,在DNA和RNA水平上研究了渤海和南黄海表层沉积物中细菌群落结构.结果表明,细菌DNA基因丰度比RNA基因丰度高1～2个数量级,DNA水平群落多样性高于RNA水平,二者群落结构差异显著.沉积物中的细菌具有活跃的化能异养、硫酸盐还原和硝化作用.基于16S rRNA基因的测序在探索微生物群落功能时可能会误判重要的功能微生物,总细菌群落中的"稀有生物圈"可能包含转录活跃者,发挥着重要的生物地球化学作用.总体而言,在分析来自稳定沉积环境的细菌群落结构时,基于16S rRNA的研究更能反映真实的生态状况.     

水产养殖尾水中抗生素抗性基因的去除及磺胺类耐药细菌研究

水产养殖环境中抗生素的大量使用促进了抗生素耐药细菌（antibiotic resistant bacteria,ARB）和抗生素抗性基因（antibiotic resistance genes,ARGs）的出现及传播.利用荧光定量PCR分析了浙江省某水产养殖尾水集中处理系统中8种ARGs的分布特征.结果表明,出水中ARGs的绝对丰度降低了0.91个数量级.磺胺类抗性基因（sul1、sul2）在所检测的抗性基因中占主导地位,且绝对丰度在出水中依然维持较高水平(4.94×10⁹、1.79×10⁹copies·L^-1).16S r RNA基因高通量测序结果显示变形菌门、蓝藻门、拟杆菌门、厚壁菌门和放线菌门是优势菌门,变形菌门和绿弯菌门与sul1、sul2和sul3呈显著相关.筛选出一株对磺胺类抗生素具有耐药性的弗氏柠檬酸杆菌,该菌株为条件致病菌,全基因组测序结果显示该菌株共携带了17个ARGs,其中sul1、sul2、tet A、bla_TEM-1等ARGs均位于1个Inc FIB质粒上,质粒图谱揭示了磺胺...     

冬季河流中抗生素抗性基因和微生物群落相关性研究

为分析冬季河流中tetA、tetB、sul1和sul2抗性基因的分布特征与微生物群落的相关性,用Miseq高通量测序分析和荧光定量PCR技术进行。冬季河流地表水中抗性基因丰度比沉积物中的高2个数量级,磺胺类抗性基因丰度比四环素类的高1个数量级。4种抗性基因总丰度变化范围为3.65×10~2～7.94×10~7copies/L。河流中Proteobacteria和Bacteroidetes为绝对优势菌群,河流地表水与沉积物中优势菌群略有不同。4种抗性基因对样本的影响较大,微生物群落与抗性基因之间相关性较大。4种抗性基因与河流地表水样本均呈正相关,沉积物中仅有sul1与WS1、QS1呈正相关,其他均呈负相关。抗性基因的传播仅与特定的菌群有关,大多数菌属是影响抗性基因分布丰度的主要因素,且对四环素类抗性基因影响的菌群较多。     

用于环境污染物遗传毒性评价的重组发光细菌载体的构建

基因重组发光菌在水质毒性的评价中具有重要的作用,本研究从污染物遗传毒性损伤的机制出发,构建2种遗传毒性新型基因重组发光菌载体PUCD-uvrA、PUCD-alkA.用PCR法从大肠杆菌W3110中扩增uvrA、alkA基因,将其与pGEM-T easy载体连接后测序.测序正确的uvrA、alkA片段及PUCD615载体均用BamH Ⅰ、EcoR Ⅰ双酶切,连接后电转化导入宿主菌JM109.挑取克隆,提取质粒用PCR鉴定,阳性克隆再进行测序.结果表明,uvrA、alkA基因PCR扩增出的片段为237　bp、326　bp,测序结果与GenBank中uvrA、alkA序列进行BLAST比对,同源性均为99％,表明扩增序列正确.与PUCD615载体连接后的测序结果表明,uvrA、alkA基因已正确地插入到PUCD615的多克隆位点,方向和读码框正确,2种载体构建成功.通过优化连接及转化条件,可将大片段的PUCD615载体与短片段的插入序列连接成功,构成重组载体.     

基于hzsB功能基因研究典型湿地沉积物中厌氧氨氧化细菌的群落结构

采用基于厌氧氨氧化细菌功能基因hzs B(联氨合成酶关键基因)PCR扩增的高通量测序,研究了典型湿地沉积物中厌氧氨氧化细菌的群落结构.结果表明,沿纬度梯度分布的10个典型湿地沉积物样品的测序序列经处理后共得到190578条序列,在90%的相似度下聚类得到77个OTUs.基因丰度值显示,10个样品的基因拷贝数在5.42×10~4~4.20×10~6copies·g~(-1)之间.群落组成结果表明,在典型湿地沉积物中,序列主要隶属于‘Ca.Brocadia’(54.09%)、‘Ca.Jettenia’(30.97%)、‘Ca.Kuenenia’(6.95%)、‘Ca.Scalindua’(7.91%).相对丰度结果显示,各样点的主导菌属有差别.多样性分析(OTUs水平)表明,在本研究的湿地沉积物中,低纬度样点的多样性普遍高于高纬度样点.PCo A分析(OTUs水平)表明,各湿地样点厌氧氨氧化细菌的群落组成表现出明显的差异性.相关性分析(α=0.10)表明,在典型湿地沉积物中,厌氧氨氧化细菌的丰度与有机质、总氮、总碳、总硫呈负相关.冗余分析表明,‘Ca.Jettenia’与NH_4~+显著正相关,‘Ca.Scalindua’与盐度显著正相关,‘Ca.Kuenenia’在所有测定理化因子中与盐度的正相关性最显著.综上,针对厌氧氨氧化细菌hzs B功能基因扩增进行高通量测序较好地揭示了典型湿地沉积物中厌氧氨氧化细菌的多样性、群落组成及其与环境因子的关系.     

当今世界环境科学研究的前沿领域：美国的生态风险评价研究

美国环境保护局研究与发展办公室以及农药与有毒品办公室正在实施一项庞大的生态风险评价研究计划。该计划的第一阶段从1986年到1990年,投资340万美元,由28个子课题组成,分别由环保局所属的四个研究所承担。一、问题的提出该项研究是建立一系列有关环境中有毒化学品生态风险性的科学评价方法。用这种方法将能针对化学物质的各种用途评价其风险性,为保护生态和人体健康提供基准数据。当今世界是一个化学物质的世界。据联合国有毒化学品登记中心统计,世界上已存在的化学物质达600万种以上;每年还以10