黑曲霉Aspergillus niger SL2-111所产酸性蛋白酶的分离纯化及酶学特性

采用硫酸铵盐析、Sephadex G-25柱脱盐、DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换层析、Sephacryl S-200分子筛层析和高效液相色谱等方法,从黑曲霉菌株Aspergillus niger SL2-111的发酵曲中提取了一种酸性蛋白酶,经SDS-PAGE验证,该酶纯化水平已达到电泳纯.该酶的表观分子量(Mr)约为47×103,最适pH值为3.0,pH稳定性范围为2.5～6.0,最适温度为50℃,温度稳定性范围为30～60℃;Gu2+、Mn2+对其有激活作用,Hg2+、Ag+对其则有轻度的抑制作用;该酶的氨基酸组成为中极性酸性氨基酸占17.29%,极性碱性氨基酸占4.50%,极性中性氨基酸占38.50%,其它为非极性氨基酸;N端氨基酸序列为SKGSAVTTPQ,经序列同源性比对,表明该酶与其它曲霉酸性蛋白酶具有极高的同源性.图4表5参15     

黑曲霉Aspergillsu niger SL2-111所产酸性蛋白酶的分离纯化及酶学特性

采用硫酸铵盐析、Sephadex G-25柱脱盐、DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换层析、Sephacryl S-200分子筛层析和高效液相色谱等方法,从黑曲霉菌株Aspergillus niger SL2-111的发酵曲中提取了一种酸性蛋白酶,经SDS-PAGE验证,该酶纯化水平已达到电泳纯.该酶的表观分子量(Mr)约为47×103,最适pH值为3.0,pH稳定性范围为2.5～6.0,最适温度为50℃,温度稳定性范围为30～60℃;Gu2+、Mn2+对其有激活作用,Hg2+、Ag+对其则有轻度的抑制作用;该酶的氨基酸组成为:中极性酸性氨基酸占17.29%,极性碱性氨基酸占4.50%,极性中性氨基酸占38.50%,其它为非极性氨基酸;N端氨基酸序列为SKGSAVTTPQ,经序列同源性比对,表明该酶与其它曲霉酸性蛋白酶具有极高的同源性.图4表5参15     

黑曲霉β-葡萄糖苷酶的筛选、克隆及表达

从曲霉属10株试验菌中筛选得到一株产β-葡萄糖苷酶活性较高的黑曲霉FTA-008.该菌株在适宜的培养条件下,β-葡萄糖苷酶的最高活性达2.89 U/mL,适宜产酶周期为3 d.通过设计特异引物,以该菌株的总RNA为模板,采用RT-PCR技术获得大小为2 511 bp的cDNA片段,该序列与GenBank中AJ132386的β-葡萄糖苷酶序列相比,氨基酸序列同源性达96.8%.经毕赤酵母表达,β-葡萄糖苷酶比活力达7.85 U/mg.图3表1参13     

一种嗜热细菌来源角质酶的分离纯化及酶学性质

通过跟踪发酵液中pNPB水解酶活性,对角质诱导的Thermobifida fusca 口发酵液进行分离纯化.采用活性炭脱色、硫铵沉淀、Phenyl HP疏水色谱、DEAE sephamse阴离子交换色谱等方法,分离纯化得到电泳纯PNPB水解酶.该酶水解角质可得到角质单体,是一种角质酶.SDS-PAGE电泳结果显示,角质酶表观分子量约为29×10~3.该酶的最适温度为60℃.在40℃和60℃下均具有良好的热稳定性.最适pH为8.0,pH稳定范围为6.0～9.0.该角质酶的生化性质适合在纺织工业中应用.图8表2参17     

产碱杆菌DN25中降氰酶的分离纯化及生化特性

以一株可降氰的产碱杆菌DN25为酶来源,通过超滤、30 mg/mL硫酸鱼精蛋白沉淀、30%～70%硫酸铵盐析和Phenyl-Toyopearl 650M疏水层析等步骤,获得比活力为44 U/mg的纯化酶制剂.在确定酶浓度、反应时间等氰降解活力测定条件后开展酶学性质研究,试图为将来氰降解代谢机理的深入研究和菌株的基因工程改造提供理论基础.研究结果表明,此纯化酶催化氰化物水解的最适pH值为8.0,最适温度为30℃.该酶在pH 7.0～8.0区域稳定,而在pH>9时会很快失活;在30℃保存10 h,酶活力保持稳定,高于60℃,酶快速失活.加入甘氨酸稳定剂,在60℃下保存20 min酶活仍可保留19.6%.酶促反应动力学符合米氏双曲线方程,测得米氏常数Km为3.11 mmol/L,最大反应速率Vmax为0.23 mmolL-1min-1.     

嗜热子囊菌光孢变种β-葡萄糖苷酶的基因克隆、表达及酶学性质分析

从嗜热子囊菌光孢变种(Thermoascus aurantiacus var.levisporus)RNA中通过RT-PCR克隆出β-葡萄糖苷酶基因bgl Ⅰ的全长序列,cDNA序列为2 672 bp.Genbank登录号为EU269025,将该片段插入巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris分泌型表达载体pPIC9K中,获得重组质粒pPIC9K/bgl,经线性化后用电穿孔法导入毕赤酵母GS115中,在醇氧化酶AOXI基因启动子作用下,获得高效表达β-葡萄糖苷酶的毕赤酵母工程菌株.经DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子层析纯化了该重组表达蛋白.SDS-PAGER测得该重组蛋白相对分子质量(M)约为120×103.经甲醇诱导,培养基中β-葡萄糖苷酶的活力可达1.2 U/mg,小规模发酵量达0.45 mg/mL.该酶的最适反应温度为60℃,最适反应pH为5.0.于70℃保温30 min仍保持80%的酶活力,具有较高的热稳定性,在pH 3.0～9.0的条件下酸碱耐受性强.图6表1参22     

经DNA改组的植酸酶纯化和酶学性质

经DNA改组的重组植酸酶通过有机膜超滤、DEAE -SepharoseF .F离子交换层析两步纯化 ,其纯度可达90 %左右 .SDS -PAGE分析表明 ,重组植酸酶的分子量Mr 约为 85 0 0 0 .酶学实验结果表明 :该酶反应最适pH为 4 .5 ,最适温度为 4 0℃ ,Km为 0 .11mmolL-1,Vmax为 96 4mmolL-1min-1,植酸酶活性不依赖任何金属离子的存在 .向酶液中分别添加MgSO4、阿拉伯糖、果糖、半乳糖、乳糖、海藻糖、蔗糖及葡萄糖 (10 0 g/L)后 ,植酸酶在 90℃处理 10min的活性比对照增加了 1～ 3倍 ,说明这些物质为酶保护剂 ;在 37℃下以植酸钠为底物的SDS对酶活性具有强烈的抑制作用 ;金属离子如Cu2 ,Zn2 ,K 以及EDTA对酶活性具有较弱抑制作用 ;金属离子如Mn2 ,Mg2 、Fe2 、Ba2 、Ca2 、Co2 低浓度时对酶活性有促进作用 ,当Mg2 浓度增加到 10mmolL-1时 ,则对酶活性起抑制效应 .图 4表 4参 19     

苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)几丁质酶的分离纯化及酶学性质

以苏云金芽胞杆菌为材料 ,通过硫酸铵沉淀分级分离、DEAE - 32离子交换柱层析初步纯化 ,获得比活力为15 0 .5Umg-1的酶制剂 .研究酶催化胶体几丁质水解的反应时间和酶量对酶活力的关系 ,探讨酶催化胶体几丁质的最适条件 .温度和 pH对酶活力的影响和酶的热稳定性及酸碱稳定性的结果表明 :酶催化胶体几丁质水解的的最适pH为 5 .6、最适温度为 5 8℃ .该酶在pH 4 .5～ 6 .5区域稳定 ,而在pH >8能很快失活 ;在 5 5℃以下处理 30min ,酶活力保持不变 ;高于 5 5℃ ,酶快速失活 .图 5参 11     

一种新的中温酸性α-淀粉酶的分离纯化及酶学性质

从Bacillus sp.中分离纯化了一种新的中温酸性α-淀粉酶,并对其酶学性质进行了研究.粗酶经硫酸铵沉淀、 DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子层析、 Sephadex G-75凝胶过滤层析等步骤后获得电泳均一的α-淀粉酶,其分子量(Mr)约为56×103.该酶最适反应pH为5.0,在pH 5.0～11.0范围内稳定,具有较好的耐酸特性.该酶最适反应温度为40～50 ℃,在40～60 ℃范围内稳定.在60 ℃、 pH 4.5时,该酶能快速有效水解可溶性淀粉;在pH 5.0时该酶对多种生淀粉底物也具有良好的水解作用.因此,该酶有助于解决中温条件淀粉加工行业中,液化酶和糖化酶由于适用pH值的差异而无法联用的难题,是一种具有研究价值和应用前景的中温酸性α-淀粉酶.经LC-MASS-MASS分析得到了酶蛋白中两个肽段的氨基酸序列,通过比对发现,该酶与NCBI中已报道的α-淀粉酶序列具有一定的同源性,同时,在氨基酸水平上也存在着差异.     

一株产酸性α-淀粉酶菌株的筛选、纯化及酶学性质

从南宁酒厂附近土壤中筛选到一株产淀粉酶的野生菌株GXBA-4,经革兰氏染色、芽孢染色以及16SrDNA鉴定,初步确定为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefacien).将该菌株发酵液经过硫酸铵沉淀和凝胶过滤纯化出一种α-淀粉酶,该酶相对分子质量约为57×103;反应最适温度为40~45℃,适应温度范围广,30℃时仍具有80%以上的相对活力;最适pH为5.0,为低温酸性淀粉酶.该酶水解可溶性淀粉的产物,经HPLC检测主要是以葡萄糖,麦芽糖以及麦芽三糖为主的低聚糖,分别以α-环糊精、β-环糊精、可溶性淀粉、玉米生淀粉为底物,还原糖产物比为0:0:99:3.4,表明该酶为典型的α-淀粉酶.     

转化血型用蕃茄α－D－半乳糖苷酶的分离、纯化及理化性质

成熟蕃茄匀浆后，经硫酸铵盐析，ＤＥＡＥ－ＳｅｐｈａｄｅｘＡ－５０离子交换层析，ＳｅｐａｄｅｘＧ－１００凝胶过滤和Ｍｅｌｉｂｉｏｓｅ－Ａｇａｒｏｓｅ亲和层析，获得了α－Ｄ－半乳糖苷酶（Ｃ．Ｅ．３．２．１．１１）。酶制剂经ＰＡＧＥ检测为一条带；ＳＤＳ－Ｇ－ＰＡＧＥ测得酶Ｍｒ为３４０００；比活力５２．９Ｕ／ｍｇ·；提纯倍数为５２９０１产率为４５％．酶专－催化以α－Ｄ－半乳糖为末端ａ－（１，３）连接的糖苷键，以ＰＮＰＧ（对硝基苯－α－Ｄ－半乳糖昔）为废物，酶催化反应的Ｋｍ＝０．１１ｍｍｏｌ／Ｌ，Ｖｍａｘ为６７μｍｏｌ·ｍｇ１－·ｍｉｎ－１．ｔ稳定范是０～３５℃；ＰＨ稳定范围是４．０～７．０．最适ｐＨ为５．１．半乳糖是酶的竞争性抑制剂；Ｃｕ２＋、Ｚｎ２＋、Ｍｎ２＋、Ｆｅ３＋、Ａｇ＋和ＥＤＴＡ对酶活性无影响．纯酶制剂可作为Ｂ型血向Ｏ型血转化的工具酶液．     

猪精液酸性N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的纯化及性质水

以杜洛克猪精液为材料,采用硫酸铵分级沉淀、DEAE-32阴离子交换柱层析和Sephadex G-100分子筛柱层析纯化,获得纯化倍数为27.64、比活力为1 773.25 U mg~(-1)的酸性N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶纯酶制剂.经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定,纯酶两种亚基相对分子质量分别为129.13×10~3和62.24×10~3.对其酶学性质的研究结果表明,酶的等电点为5.10,最适pH值为5.5,最适温度为60℃.酶在pH 3.6~9.2、温度10℃～55 ℃的范围内较稳定.以对硝基苯-N-乙酰-β-D-氨罐葡萄糖苷(pNP-NAG)为底物,测得米氏常数K_m为0.455 mmol L~(-1),最大反应速度V_m为17.34μmol L~(-1)min~(-1),活化能为41.70 kJ mol~(-1).图8表1参15     

冰川环境耐冷菌的冷适蛋白酶分离纯化及酶学性质

采用离交和凝胶层析对“中国冰川1号”耐冷菌BacilluscereusSYPA23所产的蛋白酶进行分离纯化,并进行酶学性质研究.与中温酶相比,该蛋白酶具有较高的低温催化活力,其最适催化温度为42℃,适宜pH为7.0～8.5,SDSPAGE测定的分子量(Mr)为34.2×103.金属离子Mn2 、Ca2 对该酶有激活作用,Cu2 、Hg2 、Pb2 、Co2 对其活性有一定抑制作用.该酶属金属蛋白酶,其活性受EDTA强烈抑制,不受PMSF抑制.该蛋白酶具有低温酶典型的热不稳定性,0℃下半衰期24h,但Ca2 和一些低分子醇类物质能提高其稳定性.动力学数据分析表明,该蛋白酶在低温下对底物亲和能力高,在较宽温度范围内(25～45℃)均保持着较高的催化效能.图7表3参17     

大杯伞凝集素的分离纯化及其性质

大杯伞子实体经生理盐水抽提、硫酸铵分步沉淀、DEAE -Sepharose和SephadexG - 10 0柱层析纯化得到大杯伞凝集素 (Clitocybemaximalectin ,CML) .CML经PAGE显示单一条带 ,SDS -PAGE测得其亚基相对分子质量为4 9× 10 3 ,SephadexG - 10 0凝胶过滤测得相对分子质量为 4 9× 10 3 ,CML不含糖 ,等电点为 4 .82 .该凝集素对小鼠脾脏淋巴细胞、小鼠S180 肉瘤细胞和人的A、B、O和AB型血细胞具有凝集作用 ,对兔红细胞的凝集作用可被半乳糖 (galac tose)所抑制 .氨基酸组成分析表明 ,CML含有 16种氨基酸 ,其中天冬氨酸 (asparticacid)、谷氨酸 (glutamicacid)和亮氨酸 (leucine)含量较高 .CML对热、酸碱具有一定的稳定性 ,经 6 0℃处理 10min ,仍有较高的活性 ,在pH 5～ 8范围内较稳定 ,其凝血活性受Mg2 、Ca2 、Zn2 和Mn2 二价阳离子的影响 .CML对小鼠腹腔注射的半致死量为 2 5 .70mg/kg.图 4表 7参 14     

日本沼虾(Macrobrachium nipponense)N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶初步纯化及部分性质

以日本沼虾内脏为材料,通过硫酸铵沉淀分级分离、DEAE-32离子交换柱层析和SephadexG-100分子筛柱层析纯化,获得比活力为3000Umg-1、纯化倍数为8.88倍的N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶制剂(NAGase).以对-硝基苯-N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖为底物,研究酶催化底物水解的反应动力学,结果表明,酶的最适pH为6.0,最适温度为53℃.该酶在pH4.5~9.3区域较稳定,当pH>9.3很快失活;在50℃以下处理30min,酶活力保持稳定,高于50℃,酶稳定性较差,75℃酶完全失活.酶促反应动力学符合米氏双曲线方程,测得米氏常数Km为0.165mmolL-1,最大反应速度Vm为6.55μmolL-1min-1.酶催化pNP-β-D-GlcNAc反应的活化能为63.55kJmol-1.图5表1参16     

大肠杆菌植酸酶的原核表达及酶学性质

将大肠杆菌植酸酶appA摹因重组于表达载体pET32a中,导人大肠杆菌Origami(DE3)构建工程菌Origami(DE3)-pET32aappA.对表达的appA重组植酸酶经Ni柱亲和纯化、SDS-PAGE分析表明,纯化后条带单一,酶的纯度较高.对其酶学性质的研究表明,该酶反应的比活力为3.36×106 U/mg;最适pH为4.5;最适温度为60℃ ;在80℃和85℃的耐干热能力超过耐湿热能力;在37℃下,Mg2+、Ca2+、Mn2+对酶活性有促进作用,CO2+、Cu2+、K+对酶活性有不同程度的抑制作用,而Fe3+和Zn2+对酶活性有强烈的抑制作用;此外,该酶还具有非常好的抗胃蛋白酶水解的能力和部分抗胰蛋白酶水解的能力.图8表1参21     

转化血型用蕃茄α—D—半乳糖苷酶的分离,纯化及理化性质

成熟蕃茄匀浆后，经硫酸铵盐析，ＤＥＡＥ－ＳｅｐｈａｄｅｘＡ－５０离子交换层析，ＳｅｐａｄｅｘＧ－１００凝胶过滤和Ｍｅｌｉｂｉｏｓｅ－Ａｇａｒｏｓｅ亲和层析，获得了α－Ｄ－半乳糖苷酶（Ｃ．Ｅ．３．２．１．１１）。酶制剂经ＰＡＧＥ检测为一条带；ＳＤＳ－Ｇ－ＰＡＧＥ测得酶Ｍ，为３４０００；比活力５２．９Ｕ／ｍｇ．；提纯倍数为５２９０；产率为４５％。酶专一催化以α－Ｄ－半乳糖为末端ａ－（１，３）连接的糖苷     

灵芝TR6号漆酶的分离纯化及性质研究

采用硫酸铵盐析、DEAE Sepharose Fast Flow柱层析和Sephadex G100凝胶柱层析对灵芝TR6号漆酶发酵液进行分离纯化,得到电泳纯漆酶.SDS-PAGE电泳结果显示,该漆酶表观分子量为62×103.Native-PAGE鉴定该漆酶由一种同工酶组成,为单体酶.试验结果表明,该漆酶的最适反应温度为60℃,与ABTS的最适反应pH为4.5,Km为0.188 mmol/L,在pH 6.0～8.0之间较稳定.Fe2 、SDS和Tris对该漆酶活性具有抑制作用,EDTA和Tween80则对该漆酶活性具有促进作用.图8表2参10     

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)过氧化氢酶的分离纯化及性质

对产自枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis WSHDZ-01的过氧化氢酶,通过乙醇沉淀、DEAE阴离子交换层析、疏水层析3步纯化,最终获得电泳纯的目标酶(纯化6.8倍).该过氧化氢酶的亚基相对分子质量(M1)为63×103,在405 nm处显示特征吸收峰,推测含有血红素.计算获得酶的表观米氏常数为26.87 mmol L-1.该过氧化氢酶不受低亚硫酸钠的还原作用影响,但被氰化物、叠氮化物和3-氨基-1,2,4-三唑(单功能过氧化氢酶的专一抑制剂)强烈抑制.以邻苯二胺作为电子供体测定酶活时,该酶不显示过氧化物酶活性,因此本文将纯化的过氧化氢酶定性为单功能过氧化氢酶.此外,该酶具有热敏感的特点,且酶活在pH 5～10范围内不受pH影响,此后,活性随着pH的升高而升高,并在pH 11～12处有明显的酶活高峰,在pH 11、25℃放置60 min酶活基本不变,表明该酶在高碱条件下具有很高的活力和一定的稳定性.     

生孢噬纤维菌荚膜多糖的分离纯化及其性质

生孢噬纤维菌(Sporocytophaga)是能降解纤维素的滑动细菌,它可将滤纸和棉花纤维素完全降解.本文对生孢噬纤维菌产生的荚膜多糖的分离纯化以及性质进行了研究.以滤纸平板法培养生孢噬纤维菌,加入1%苯酚后,荚膜多糖溶解在水相中,再经氯化十六烷基吡啶(CPC)沉淀,分离出荚膜多糖提取物.利用Sephadex G-75柱层析法、胰蛋白酶和Sevag法对荚膜多糖提取物进行纯化;并利用比旋光度检查、红外光谱、液相色谱以及气相色谱等分析手段对精制后的荚膜多糖进行分析.结果表明,分离纯化得到了纯度较高的生孢噬纤维菌荚膜多糖.Sephadex G-75柱层析分析表明,荚膜多糖提取物中含有结合蛋白,除去结合蛋白后,多糖分子量约为6.5×103;气相色谱分析表明,该荚膜多糖主要由Gal、Glc、GlcA以及Man等单糖组成,其比值约为3.513.33.61;同时该荚膜多糖的红外光谱显示,该多糖所含的甲基、亚甲基等基团的量比正常多糖多;红外光谱图中881cm-1处的峰位显示,该多糖含有不典型β糖苷键特征吸收峰.图5参8