镉诱导华溪蟹不同组织金属硫蛋白表达及镉蓄积的研究

为了系统研究镉诱导华溪蟹不同组织(肝胰腺,腮)金属硫蛋白(MT)表达及镉蓄积状况,并探讨二者之间的关系,采用体外镉暴露法处理华溪蟹,用镉-血红蛋白饱和法和火焰原子吸收分光光度法(AAS)分别测定华溪蟹肝胰腺及腮中镉蓄积及MT表达含量.结果显示,暴露期间动物死亡率低于9.2%.体重未见显著变化.不同浓度镉暴露下.华溪蟹体内镉蓄积及金属硫蛋白表达具有明显组织差异,且呈现一定的时间-效应与剂量-效应关系.鳃中镉蓄积量高于肝胰腺且最高达到(15.41 ±3.21)μg·g-1;而肝胰腺中MT表达量高于鳃,最高达到(97.18±11.83)μg·g-1.通过鳃及肝胰腺中MT的镉结合率计算,显示肝胰腺中的镉可完全被MT结合,而鳃中镉蓄积量远远大于MT结合能力.     

镉锌在河南华溪蟹鳃中的吸收途径及亚细胞分布研究

采用火焰原子分光光度法检测了河南华溪蟹(Sinopotamon henanense)鳃中重金属镉、锌的含量,进而探讨了镉、锌两种金属在河南华溪蟹鳃组织中的吸收途径及亚细胞分布情况.实验首先运用Ca2+通道抑制剂三氯化镧(La Cl3)和巯基抑制剂N-乙烷基顺丁烯二酰亚胺(NEM)对河南华溪蟹预处理4 h,然后再用不同浓度镉(50、100、500μg·L-1)、锌(100、1000μg·L-1)分别处理7 d.实验结果显示,La Cl3仅抑制了鳃组织中镉的吸收,而NEM抑制了鳃组织中镉、锌的吸收.在亚细胞组分中,La Cl3降低了镉在细胞碎片和细胞器中的分布,NEM减少了镉在热稳定蛋白及锌在热变性蛋白部分的分布;两种抑制剂均增加了锌在金属富含颗粒部分的分布.实验结果表明,在河南华溪蟹鳃组织的不同亚细胞组分中,镉、锌两种重金属的分布具有差异,推测La Cl3和NEM均可调控镉的吸收,而NEM只调控锌的吸收.     

锌对镉在河南华溪蟹鳃组织亚细胞中富集的影响

为了研究锌对镉在河南华溪蟹(Sinopotamon henanense)鳃中富集的影响,本文选择不同浓度镉锌联合处理14 d和28 d后,采用亚细胞分离法将鳃组织分为热稳定蛋白(HSP)、富含金属颗粒(MRG)、生物活性部分(BAM)和细胞碎片部分(CD),其中,热稳定蛋白(HSP)和富含金属颗粒(MRG)组成生物解毒部分(BDM),利用火焰原子吸收分光光度法(AAS)测定各个亚细胞组分中镉的含量.结果显示,BDM是镉富集的重要场所,镉在其中所占比例达到50%.其中,BDM包括热稳定蛋白(HSP)和富含金属颗粒组分(MRG).随着镉处理浓度的增加,锌对镉在HSP和MRG中的蓄积表现为先促后抑的作用.在BAM中,加锌促进镉的蓄积,且相较于高浓度锌(1000μg·L-1),低浓度锌(100μg·L-1)的促进作用更为显著.研究表明,锌对镉在河南华溪蟹鳃中的富集及分布有一定影响.     

失去记忆性贝毒ASP酶联免疫检测方法的研究

建立了赤潮毒素失去记忆性贝毒中主要成分软骨藻酸(domoic acid,DA)的竞争酶联免疫检测方法.通过将DA偶联到蛋白载体上,免疫BALB/c小鼠,免疫数次后,得到抗DA的多克隆抗血清,以DA-OVA为包被抗原,利用抗原抗体反应,建立间接竞争酶联免疫吸附技术(Enzyme-linked immunosorbant assay,ELISA)分析检测海水样品和海洋贝类中的赤潮毒素失去记忆性贝毒DA的方法.结果表明,该方法最低检出限10μg/L,海水样品平均回收率102.%,批内变异系数12.%;贝类样品平均回收率为111.%,批内变异系数4.8%.     

钙信号对镉诱导河南华溪蟹细胞凋亡的调控

以河南华溪蟹(Sinopptamon henanense)为研究材料,采用生理生化和酶学组织化学等方法,通过不同时间(12、24、48、72和96 h)不同镉浓度(0、14.5、29、58 mg·L-1)处理,首先研究了镉对肝胰腺细胞内钙调素(CaM)含量、钙ATP酶(Ca2+-ATPase)活性和细胞凋亡的影响;然后用Ca2+抑制剂EGTA和LaCl3预处理河南华溪蟹后再进行镉处理,以分析Ca2+信号对镉诱导肝胰腺细胞凋亡的影响.结果显示,镉处理引起肝胰腺细胞CaM含量和Ca2+-ATPase活性显著升高,并且Caspase-3和Caspase-9被激活.用Ca2+抑制剂EGTA和LaCl3预处理华溪蟹4 h后,再用镉处理48 h,镉诱导的肝胰腺细胞Caspase-3和Caspase-9活性上升都被阻断.结果表明:镉处理引起河南华溪蟹肝胰腺细胞Ca2+浓度发生变化,并通过CaM等信号分子调控Caspase-3/9活性,进而引发细胞凋亡.     

抗萘单克隆抗体杂交瘤细胞株的构建

为了构建针对石油运输泄露导致的海洋环境中萘等多环芳烃污染的免疫学快速检测方法,需获得高效稳定的分泌抗萘单克隆抗体的杂交瘤细胞株。本文以2-萘丁酸-KLH为免疫抗原免疫BALb/c小鼠,间接竞争ELISA测定小鼠血清效价,用细胞融合筛选技术筛选抗萘单克隆抗体杂交瘤细胞株,捕获ELISA测定小鼠免疫球蛋白亚型。结果显示,实验小鼠免疫血清效价最高能达到1:80000,经过HAT筛选、复检和亚克隆后得到5个能分泌抗萘单克隆抗体的细胞株,细胞株上清液效价最高能达到1:15625,抗萘单克隆抗体免疫球蛋白亚型均为IgG1,Kappa轻链。本方法成功构建的杂交瘤细胞株能稳定高效分泌抗萘单克隆抗体,抗体亚型符合免疫学检测的特性,为萘的ELISA检测方法建立及胶体金免疫层析（GICA）试纸条的研制提供了稳定高效的单克隆抗体源。     

2,4-D完全抗原的合成及其免疫性能评价

以2,4-D为半抗原,BSA为载体蛋白,通过EDC的偶联反应条件优化试验,合成了多种结合比的完全抗原,制备了小分子环境污染物的多克隆抗体.结果表明,偶联反应优化步骤是2,4-D、BSA和EDC同时反应,4°C条件下反应18h.偶联反应可以在2,4-D的浓度为10.0～12.0 mg/mL的0.05mol/L的磷酸盐缓冲溶液中进行,反应缓冲体系pH控制在5.4～6.1之间.EDC的加入量低于12 mg时,采用2,4-D和多聚赖氨酸的偶联物为包被抗原.通过balb/c小鼠免疫试验评价结合比分别为6、12、18和25的完全抗原的免疫性能,结果表明结合比为12和18的完全抗原具有很好的免疫原性.其中以结合比为18的完全抗原免疫小鼠获得的抗血清对包被抗原载体的非特异性吸附低于阴性血清,2,4-D特异性血清含量高,适于作为完全抗原免疫小鼠进一步制备单克隆抗体.     

人金属硫蛋白基因(MT1E)在毕赤酵母中的表达及其铬抗性

金属硫蛋白(Metallothionein,MT)是一类富含半胱氨酸的蛋白质,巯基含量丰富,其半胱氨酸上的巯基对重金属离子有极强的结合力,能够结合重金属形成无毒或低毒的络合物,具有重金属解毒的功能.本文根据已公布的人金属硫蛋白基因MT1E序列,用Vector NTI 7.0软件设计合成12条寡聚核苷酸片段,并拼接得到MT1E完整基因.将测序正确的MT1E基因克隆至酵母表达载体pPIC9K,酶切验证后的阳性克隆命名为pPIC9K-MT1E,含有该重组基因的毕赤酵母工程菌命名为GS115/pPIC9K-MT1E.通过酶联免疫(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay,ELISA)方法检测到GS115/pPIC9K-MT1E工程菌发酵液有金属硫蛋白酶活性,表明人金属硫蛋白MT1E基因能在毕赤酵母GS115菌株中正确分泌表达.铜(Cu)、锌(Zn)、锰(Mn)、铬(Cr)、钴(Co)重金属抗性分析表明,工程菌GS115/pPIC9K-MT1E对Cr(Ⅵ)的抗性较强,有解毒重金属Cr(Ⅵ)的能力.     

猴金属硫蛋白α域(MT-α cDNA)突变体的构建、表达及工程菌对重金属的吸附

采用PCR技术和同尾酶手段,构建了猴金属硫蛋白(mMT)α域的串连体,并构建了表达MT α串连体的工程菌,获得了表达二聚串连体(MTα2)、三聚串连体(MTα3)、五聚串连体(MTα5)的工程菌.结果表明,工程菌在0.1 mmol·L-1IPTG诱导3h后表达量最高.Cd2 浓度为0.5mmol·L-1时,对照菌pGEX-2T/BL21生长受到严重胁迫,工程菌表现出较强的抗性,MTαn/BL21(n=2、3、5)生长几乎不受到胁迫;Cd2 浓度为1.0 mmol·L-1时,MTα5/BL21表现出较强的耐受能力.Cd2 浓度为0.5 mmol·L-1时,工程菌对镉的富集能力明显高于对照,其中富集能力最强的是MTα3/BL21(76%).与对照pGEX-2T/BL21相比,MT/BL21对锌吸附能力显著提高.而转化有MTα串连体基因的工程菌对锌的吸附能力没有提高,说明工程菌对Cd2 的吸附特异性增强.结构预测显示,MTα、MTα2、MTα,的二级结构中α螺旋依次增加,推测突变蛋白的疏水性增强,三维结构稳定.MTα4、MTα5二级结构中,α螺旋数目减少,尤其是MTa5,其a螺旋几乎完全遭到破坏,疏水性大为降低.对基因工程菌吸附镉的实验表明,MTα3/BL21对镉具有较高的特异性和富集容量.     

镉对长江华溪蟹金属硫蛋白mRNA表达的诱导及低分子量壳聚糖的联合作用

采用实时荧光定量PCR法,研究了不同浓度镉（Cd2＋）对长江华溪蟹（Sinopotamon yangtsekiense）金属硫蛋白（metallothionein,简称MT）在肝胰腺、鳃、肌肉和心脏中mRNA表达的诱导作用及低分子量壳聚糖（lowmolecular weight chitosan,简称LMWC）的联合作...     

急性与亚慢性镉胁迫对河南华溪蟹消化系统亚细胞结构的影响

本实验运用透射电镜技术,观察了河南华溪蟹(Sinopotamon henanense)分别在镉29.0 mg·L-1急性染毒4 d和2.90 mg·L-1亚慢性染毒21 d后消化系统4种器官(食道、中肠、后肠和肝胰腺)亚显微结构的变化和损伤情况.结果显示:急性和亚慢性染毒均可导致各组织中细胞核变形、染色质浓缩边集、核固缩、核碎裂,线粒体空泡化、嵴缩短、融解甚至消失,但前者对各组织亚细胞的损伤更为严重;肝胰腺和中肠组织的病理变化较食道和后肠组织中的明显,镉胁迫后均可观察到上皮细胞内粗面内质网扩张变形、核糖体脱落,高尔基体形态结构异常,微绒毛排列紊乱、部分融解、断裂,出现大量的自噬溶酶体;食道和后肠的肌纤维水肿、肌原纤维排列疏松.急性与亚慢性镉处理均会对河南华溪蟹的消化系统产生毒害,造成各组织器官中细胞结构的严重损伤,且急性高浓度的镉暴露对机体造成的毒性影响较为严重.这些损伤会影响消化酶的合成和分泌等生理功能,导致机体失去正常的消化能力.     

急性镉染毒对河南华溪蟹精子质量的影响

采用急性毒性实验方法,研究了镉(Cd2+)对河南华溪蟹(Sinopatamon henanense)精子质量的影响.实验设置了5个Cd2+浓度组(7.25、14.5、29、58和116 mg·L-1)和1个空白对照组,在2个染毒时间(5d和7d)采用特异性的荧光染料和流式细胞术(FCM)对精子成活率、膜完整性、顶体完整性及染色质结构进行了测定.结果显示,随着Cd2+浓度的增加和染毒时间的延长,精子的成活率下降,质膜和顶体缺失率上升,异染色质所占比率上升.在Cd2+浓度为58、116 mg·L-1条件下暴露5d后,精子成活率显著降低(p ＜0.05);Cd2+浓度为116 mg·L-1时,精子质膜完整性和染色质结构均有明显的损伤;而顶体状态在Cd2+浓度为29 mg·L-1时就呈现显著的损伤(p＜0.01).在Cd2+浓度为29、58、116mg·L-1条件下染毒7d后,精子成活率、质膜完整性和顶体完整性降低;在所有的染毒组,DNA结构受到了显著的破坏.结果表明,Cd2+暴露对华溪蟹精子质量有明显的影响.     

镉对河南华溪蟹肝胰腺线粒体的影响

运用透射电镜技术、电镜细胞化学技术、酶组织化学技术和JC-1荧光染色,观察不同浓度镉对河南华溪蟹(Sinopotamon henanense)肝胰腺线粒体的损伤.实验设对照组和5个染毒组:3.56、7 12、14.25、28.49和56.98 mg·L-1,处理时间为72 h.透射电镜观察显示,在低浓度组,线粒体轻度肿胀,部分线粒体外膜破裂,随染毒浓度的增加,线粒体水肿增加,嵴缩短甚至消失,直至线粒体破裂.酶组织化学检测显示,琥珀酸脱氢酶(succinic dehydrogenase,SDH)主要在细胞浆中表达,呈蓝紫色颗粒.SDH活性在3.56、7.12和14.25 mg·L-1浓度组中比对照组显著增加(p＜0.05),而在28.49和56.98 mg·L-1浓度组中没有明显变化.SDH的亚细胞定位结果与酶组织化学检测的结果一致.JC-1荧光强度在3.56、7.12和14.25 mg·L-1浓度组比对照组显著增加(p＜0.05).线粒体膜电位与SDH的活性有正相关性(r=0.736,p＜0.05).结果显示,镉引起线粒体结构损伤、功能障碍,并与镉浓度具有剂量-效应关系.线粒体是镉细胞毒性的重要靶位.     

铅对河南华溪蟹卵巢抗氧化酶活力和脂质过氧化水平的影响

采用亚急性毒性实验方法,研究了铅(Pb2+)对河南华溪蟹(Sinopotamon henanense)卵巢组织抗氧化酶活性与脂质过氧化产物的影响.实验设置了5个Pb2+浓度组(3.675、7.35、14.70、29.40和58.80mg·L-1)和1个空白对照组,在3个染毒时间(5、10和15d)下对超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)活力和丙二醛(MDA)含量进行了测定.结果显示,在不同浓度和不同暴露时间下,铅对河南华溪蟹卵巢SOD、CAT、GPx活力及MDA含量均有明显的影响.SOD、CAT活力表现为低浓度诱导激活,高浓度抑制,即先升后降的变化规律,GPx活力在5d和10d时表现出先升后降的趋势,在15d时活力不断下降,且SOD在10d、14.70mg·L-1Pb2+浓度组,CAT在5d、7.35mg·L-1Pb2+浓度组,GPx在10d、3.675mg·L-1Pb2+浓度组分别升至峰值,而卵巢MDA含量随染毒时间的延长和染毒浓度的升高逐渐增多,且在15d、58.80mg·L-1Pb2+浓度组中较对照组差异极显著。结果表明,Pb2+暴露对河南华溪蟹卵巢产生了明显的氧化胁迫作用,且抗氧化酶和脂质过氧化物水平可以作为重金属对水生生物毒理学研究的生物标志物.     

丛枝菌根对翅荚木生长及吸收累积重金属的影响

针对湖南某铅锌矿区土壤重金属污染严重问题,采用温室盆栽的方法,以该矿区污染土壤为基质,先锋植物翅荚木(Zenia insignis Chun)为宿主植物,研究摩西球囊霉(Glomus mosseae,Gm)和根内球囊霉(G.intraradices,Gi)两种丛枝菌根(Arbuscular Mycorrhizal,AM)真菌对翅荚木生长和吸收累积重金属的影响.结果表明,重金属污染条件下,两种AM真菌均能与翅荚木形成良好的共生关系,且AM真菌能够显著促进植物吸收磷,增加植物生物量,同时改变植物重金属吸收及分配.总体来说,AM降低了翅荚木体内Fe、Cu、Zn和Pd浓度,同时增加了Fe、Cu、Zn和Pd累积量.而两种AM真菌对植物体内重金属分配影响并不相同,而且受重金属种类影响,接种Gi降低了植物Fe、Zn和Pb的TF值,而接种Gm对植物Zn和Pb的TF值无影响,两种AM真菌对植物Cu的TF值均无影响,表明Gi具有能够强化翅荚木根系固持Fe、Zn和Pb的能力.本研究表明,AM真菌在翅荚木适应重金属污染中起着重要的积极作用,因而在重金属污染土壤的植物修复中具有极高的潜在应用价值,但在具体应用中需考虑菌种和植物组合及重金属类型等因素.     

利用DGGE-菌落原位杂交法分离土壤中精喹禾灵降解菌

从自然环境中分离到的可降解农药的土著微生物,因其对环境的友好性及原位修复的可行性,受到了高度关注.为从土壤中筛选精喹禾灵降解菌株,首先利用PCR-DGGE技术分析了除草剂精喹禾灵胁迫下土壤细菌群落结构及多样性的变化.结果表明,添加精喹禾灵后,土壤细菌群落结构发生了明显的改变.精喹禾灵使细菌多样性呈现出增加-减少-增加的变化趋势,其中第9 d变化最大,后期趋于稳定.根据DGGE图谱条带的测序结果推断,Pseudomonas、Massilia、Burkholderia等属中的细菌对精喹禾灵具有耐受性或降解潜力,这些微生物类群可作为减少农药残留的土著微生物资源进行分离筛选.根据条带的测序结果,合成了地高辛(Digoxigenin)标记的探针,并进行了菌落原位杂交,筛选到了3株具有降解潜力的菌株,其中L1可以利用精喹禾灵作为唯一碳源生长,经16S rRNA基因鉴定该菌株属于假单胞菌属(Pseudomonas sp.).利用高效液相色谱法测定了菌株L1在无机盐培养基中降解精喹禾灵的效果.结果表明,培养7 d后,精喹禾灵的含量减少了近50%,且随着精喹禾灵含量的降低,L1菌体数量增加,证实了菌株L1具有降解精喹禾灵的能力.这一结果为今后研究菌株L1降解精喹禾灵的机制、功能基因等奠定了基础.     

海洋细菌Marinobacter adhaerens HY-3分离鉴定及对中肋骨条藻的化感作用

菌藻化感作用是一种极其复杂的生理、生态学现象.从虾蟹混养池分离得到1株海洋细菌,经16S rRNA序列比对确定为Marinobacter adhaerens HY-3,选择我国常见赤潮优势种中肋骨条藻(Skeletonema costatum)作为对象,研究海洋细菌与其种间化感效应,利用共培养和添加细菌胞外代谢物,以S.costatum生长量及叶绿素a含量为参数,研究细菌对S.costatum生长及光合作用的影响.结果表明,菌液浓度104以上对S.costatum生长产生抑制,培养至第10 d,104、106、108组藻生长量分别是对照组的70%、23%、22%;叶绿素合成量是对照组88%、62%、60%;抑制效应随菌浓度的增加有逐渐增加的趋势.添加细菌胞外代谢物,对S.costatum生长无影响;因此,M.adhaerens HY-3对S.costatum存在一定的化感作用,对其生长及光合作用均产生较大的影响;S.costatum与M.adhaerens HY-3的种间相互作用,是由菌藻细胞的直接接触进行,代谢物不存在化感作用因子.     

铅锌矿区蜈蚣草内生放线菌的多样性及群落结构

为了认识重金属累积对植物内生菌的影响,采用变性梯度凝胶电泳(denaturing gradient gel electrophoresis,DGGE)技术及序列分析对四川汉源铅锌矿区蜈蚣草内生放线菌的多样性进行了研究,并分析了内生放线菌多样性与Pb、Zn、Cu和Cd等主要重金属之间的相互关系.结果表明,蜈蚣草不同部分内生放线菌的群落结构和多样性存在一定的差异,多样性指数在2.79~3.29之间,与其他非重金属污染环境植物内生放线菌的多样性指数相似,说明在重金属污染地区仍然存在较为多样的内生放线菌类群.相关分析表明,蜈蚣草内生放线菌多样性指数与Cu、Cd和Pb的含量之间存在显著负相关.DGGE条带序列系统发育显示,链霉菌(Streptomyces)、假诺卡氏菌(Pseudonocardia)、小单孢菌(Micromonospora)、Xianggella为蜈蚣草内生放线菌优势类群,拟诺卡氏菌(Nocardiopsis)、小双孢菌(Microbispora)、马杜拉放线菌(Actinomadura)、弗兰克氏菌(Frankia)以及一些未培养放线菌也在蜈蚣草中存在.研究表明铅锌矿区蜈蚣草内生放线菌存在丰富的多样性,重金属的累积影响了内生放线菌的分布.