表达Xa21基因匠转基因水稻研究

对Xa21在转基因水稻新汕B后代R1、R2群体的的遗传方式及稳定性进行初步分析,特异PCR分析从分子水平表明Xa21基因已稳定遗传至R1代,自交R1代的抗感带型分离比为3：1,揭示出Xa21基因在转基因水稻中按孟德尔方式遗传,Hyg培养基发芽和田间接菌鉴定显示,Xa21转基因水稻对Hyg和白叶枯病的抗性多数在后代中出现3：1的分离,对白叶枯病的的抗病性呈连续分布,能传递到较高世代,并且能在R2代获得纯合株系。图3表3参12     

用基因枪介导法将水稻几丁质酶基因导入小麦

利用PDS1000／氦气基因枪将水稻几丁质酶基因导入小麦幼胚盾片愈伤组织．基因枪轰击后在含有50mg／L硫酸卡那霉素的培养基上经过多步骤筛选和分化，从5个小麦品种共800多个幼胚中获得了6株绿苗，对此6株绿苗进行了PCR和Southern杂交分析．结果表明，其中4株绿苗为转基因植株，转化率最高可达1．2％．图3表2参17     

农杆菌介导将高赖氨酸蛋白基因导入谷秆两用水稻

采用农杆菌介导法将高赖氨酸蛋白基因导入到谷秆两用水稻中，GUS组织化学染色、PCR扩增、Southem blot分析表明，该基因已经整合到水稻基因组中，测定9株转基因水稻叶片赖氨酸含量，大部分植株有明显的提高，最高幅度达到了22．71％，图6参15     

水稻抗虫转基因光温敏核不育系植株的获得

以质粒pCUBAC-HPT作抗虫基因供体，优良光温敏核不育系612S为受体，采用基因枪转化法，获得了转抗虫基因sck和sbk的植株．分子证据表明，外源基因己整合到受体基因组中．蛋白活性测定和Western blotting结果显示，转基因在受体植株中得到表达．田间抗虫性测定表明，外源基因的转入提高了受体的抗虫性．本文还讨论了转基因技术在水稻育种中的作用．图5表2参12     

水稻高效转化系统的建立

利用基因枪轰击和农杆菌介导两条途径转化水稻成熟胚、幼胚、幼穗诱导来源的愈伤组织．实验发现，外植体来源影响愈伤组织的诱导和转化．对于同一水稻品种，幼胚、幼穗在NB2培养基上比成熟胚易于诱导出胚性愈伤组织；转化中，无论是经农杆菌介导还是基因枪轰击，幼胚和幼穗来源的愈伤组织能以较高的转化频率获得转化体并再生成苗．同时，愈伤组织的诱导和转化效果也受基因型的影响．另外，转化途径对转化效率的影响较大，基因枪轰击比农杆菌介导转化频率高、再生频率强．并且，在轰击前6h至轰击后18h，将愈伤组织保持在附加20g／L甘露醇的培养基中，有利于转化率的提高．图2表3参17     

水稻OsGPCR基因的克隆及遗传转化分析

G蛋白偶联受体(G protein-coupled receptors,GPCR)基因家族是目前已知最大的膜受体超家族,参与生物的生长发育调控和激素应答.通过RT-PCR分离了水稻中一个具有7次跨膜(Seven transmembrane,7TM)结构域的OsGPCR候选基因;分析该基因启动子序列,发现它含有赤霉素GA应答相关元件.为分析其功能,分别构建OsGPCR过表达和RNA干涉载体,并通过农杆菌介导法转化获得转基因水稻植株.实验结果表明,较之野生型,过表达转基因植株对赤霉素反应更敏感,RNA干涉植株则反之.     

转修饰豇豆胰蛋白酶抑制剂基因(sck)抗虫甜椒植株的获得

以12－14d苗龄的甜椒带柄子叶为外植体，经根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）介导，将修饰的豇豆胰蛋白酶抑制剂基因（sck）导入甜椒杂交种“中椒5号”和常规种“茄门”中，在对甜椒转化系统和芽丛诱导茎伸长的条件进行优化研究后，获得了卡那霉素抗性植株，最高转化率为16．7％，卡那霉素抗性筛选、PCR检测和Southern blot杂交均证实，nptⅡ基因和sck基因整合进甜椒基因组中，室内离体叶片饲虫和田间自然抗虫性鉴定进一步证明，转基因植株对铃虫（Heliothis armigera Hubner）具有一定抗性。     

水稻锌指蛋白基因OsWIP6的克隆、表达及RNAi载体转化

为了解水稻C2H2型锌指蛋白转录因子基因的表达调控机理及生物学功能,克隆了水稻的一个C2H2型锌指蛋白转录因子基因(OsWIP6),并构建其RNA干涉植物表达载体,通过农杆菌介导转化获得转基因植株.生物信息学分析显示,OsWIP6氨基酸序列与拟南芥两个WIP家族转录因子高度同源.组织差异性表达分析表明,该基因在水稻花发育上具有表达偏向性.与野生型相比,转基因水稻表现为抽穗延迟,结实率及千粒重降低,半定量分析显示转基因植株OsWIP6表达量明显下降.因此,推断OsWIP6基因与水稻育性密切相关.     

双农杆菌共转化获得无标记转pepc基因的水稻植株

利用双农杆菌/双质粒的共转化系统获得了无选择标记转pepc基因的水稻植株.采用两个农杆菌EHA105转化粳稻品种台粳9号幼胚诱导的胚性愈伤组织,其中一个农杆菌内的质粒表达载体的T-DNA区仅含有目的基因pepc,另一个的T-DNA区含有选择标记基因hpt和GUS报告基因.获得抗性愈伤的转化率为9.2%.85.3%的抗性愈伤分化成T0代株系,其中78.8%的T0代植株为GUS阳性转基因植株.PCR分析表明,在78个T0代GUS阳性植株(来源于23个抗性愈伤组织)中共有35个植株(来源于7个抗性愈伤组织)含有pepc基因,即在23个GUS阳性株系中发生共转化株系的频率为30.4%.7个共转化的株系中有5个株系自交产生后代植株中含有无标记转pepc基因植株,其比例为71.4%.无标记的转pepc基因水稻植株中PEPC活性平均比对照提高8.8倍;与非转基因对照植株相比,转pepc基因水稻植株表现出更强的光合能力.图5表3参26     

水稻DDB1基因的表达特性及功能分析

利用RNA干涉技术构建水稻DDB1(Damaged DNA binding protein 1)基因不同启动子驱动植物表达载体,DDB1-RNAi和DDB1-glu-RNAi.通过根癌农杆菌介导转入水稻愈伤,经组织培养成功获得转基因植株.半定量RT-PCR分析显示,与野生型植株相比,两组转基因植株幼叶内DDB1的表达量...     

细胞分裂素基因（T－cyt）在转基因烟草中的表达及其对生长发育的影响

将编码细胞分裂素合成关键酶──异戊烯基转移酶的Ｔ－ｃｙｔ基因分别置于ＣａＭＶ３５Ｓ启动子，ｒｂｃＳ启动子和Ｔ－ｃｙｔ基因自身启动子的调控下，构建成不同的嵌合质粒用于转化烟草，通过ＰＣＲ检测，Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交和ＮＰＴⅡ的酶活检测对获得的转基因烟草进行了鉴定．Ｎｏｒｔｈｅｒｎ分析表明：ＣａＭＶ３５Ｓ启动子驱动下的Ｔ－ｃｙｔ基因在转基因烟草的根、茎、叶中均有ｍＲＮＡ的积累；ｒｂｃＳ启动子指导下Ｔ－ｃｙｔ基因在叶中转录较强，茎中次之，在根中几乎未表达．以根据抗原决定簇进行人工合成的复合抗原免疫家兔得到异戊烯基转移酶抗体，ＥＬＩＳＡ结果表明转基因烟草根中异戊烯基转移酶含量较高．Ｔ－ｃｙｔ基因的表达对转基因烟草的生长发育有明显影响：其叶绿素ａ、ｂ含量明显增加，叶衰老迟缓；顶端优势受到抑制，侧芽生长旺盛；与对照相比，其根系不发达．     

盐藻烯醇酶基因表达载体的构建及其转基因烟草的鉴定

以载体pCAMBIA2301为骨架引入pBI121中的GUS基因，构建了简便、实用的中间载体pCAMBIA2301G．将其中一个GUS基因用目的片段盐藻烯醇酶基因替换，构建了可以在植物中高效表达的载体pCAMBIA2301G—enolase，并将其转入根癌农杆菌EHA105中，采用叶盘转化法将盐藻烯醇酶基因转入模式植物烟草中．Southern杂交结果显示，盐藻烯醇酶基因已整合到植物基因组中，在转基因烟草中的拷贝数为2～4个．图6参10     

同源四倍体与二倍体水稻Wx基因位点的遗传差异

测定了中国科学院成都生物所培育出的14种同源四倍体水稻及8种大面积推广的二倍体水稻的直链淀粉含量，并利用微卫星标记484／485，Wxup2／485及PCR—AceⅠ分子标记对同源四倍体及二倍体水稻进行扩增．发现直链淀粉含量发生变化的部分同源四倍体水稻队基因位点发生变异，表明微卫星标记与同源四倍体水稻直链淀粉含量之间存在相关性，并初步探讨了同源四倍体水稻Wx基因位点遗传变异的原因．图2表1参13     

拟南芥SHI基因在烟草中的表达和矮化、延迟开花的烟草植株的获得

利用聚合酶链式反应(PCR)从拟南芥基因组DNA中克隆了拟南芥SHOTINTERNODS(SHI)基因,并进行了序列测定.以载体pBI121为基本骨架构建了SHI的植物表达载体,并导入根癌农杆菌EHA105.通过农杆菌介导的叶盘法将拟南芥SHI基因转入烟草.PCR和RT-PCR检测证明,拟南芥SHI基因已整合到烟草基因组中并得以表达,获得了矮化、延迟开花的烟草植株.图5参12     

农杆菌介导的抗除草剂基因转入两系杂交稻恢复系的研究

利用农杆菌水稻高效转化系统,成功地将外源ＢＡＲ基因转入实用性两系要交稻恢复系Ｒ１８７和秀水０４,经过除草剂Ｂａｓｔａ田间涂布试验,其阳性率达到９０％以上。对转基因植株同步进行的ＰＣＲ特异扩增和总ＤＮＡ Ｓｏｕｔｈｅｒｎ检测结果也证实抗Ｂａｓｔａ的植株中含有ＢＡＲ基因。讨论了应用转ＢＡＲ基因的方法提高两系杂交水稻制种纯度的条件。图２表１参３     

优良籼型恢复系转基因植株的获得及其遗传稳定性

报道了用基因枪转化法将雪花莲凝集素基因(gna)转移到优良籼型杂交稻恢复系蜀恢527中．PCR、PCR Southern blotting和Southern blotting等分子检测证明，外源基因以多拷贝单位点方式整合到受体基因组中并稳定遗传到转基因第三代(T2)．转基因第一代植株(TO)在株高和结实率上与相应的组培、种子实生苗植株相比，发生明显的不可遗传的变异，随着繁殖代数的增加，转基因植株恢复到与对照植株一致．Western blotting表明，目的基因在转基因植株中正确表达．蛋白活性分析显示，外源基因在转基因植株中合成的蛋白具有凝血生物活性，含量占可溶性总蛋白的0．1％左右．本文还对转基因技术在杂交稻育种中的应用进行了讨沦．图4表2参18