棉铃虫核多角体病毒基因组限制酶酶切分析及其多角体基因的定位

应用１１种限制性内酶ＢａｍＨⅠ、ＢｓｔＥⅡ、ＥｃｏＲⅠ、ＥｃｏＲⅤ、ＨｉｎｄⅢ、ＫｐｎⅠ、ＰｓｔⅠ、ＳａｌⅠ、ＳｓｔⅠ、ＸｂａⅠａⅠ和ＸⅠⅠ和ＸｈｏⅠ分别将中国棉铃虫核多角体病毒（单粒包埋ＨａＳＮＰＶ）湖北株基因组Ｄ组ＤＮＡ酶切为１０、１２、２２、２１、１３、６、６、４０、６、２１、６个片段，并求得基因组大小平均为１什什Ｍｒ≈７９．１×１０６．以家委核多角体病毒ＢｍＮＰＶ多角体基因为探针，利用Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交技术将病毒多角体基因定位在ＳａｌⅠ４．２×１０３ｂ左右的片段上．与棉铃虫核多角体病毒其它株系酶切图谱比较结果表明，本株病毒与上海等株系及美洲棉铃虫核多角体病毒ＨａＳＮＰＶＥｌｋａｒ株系酶切图谱相似，它们之间的条带数和大小差异较小，而与已发现的所有多粒包埋型病毒ＨａＳＮＰＶ酶切图主谱差异较大．据此认为ＨａＳＮＰＶ和ＨａＭＮＰＶ属于基因型不同的两类病毒，而ＨａＳＮＰＶ不同分离株的同源性很高     

粘虫颗粒体病毒及其增效因子对粘虫核型多角体病毒的增效作用

生物测定的结果表明,粘虫颗粒体病毒ＰｕＧＶ－Ｐｓ及其增效因子对粘虫核型多角体病毒ＰｓＮＰＶ均有明显的增效作用．粘虫颗粒体病毒不仅能提高粘虫感染ＰｓＮＰＶ的死亡率,而且ＮＰＶ、ＧＶ两种病毒混合感染使粘虫幼虫代谢发育受到抑制,表现为生长缓慢、体重减少等．增效因子的增效作用表现在能显著提高粘虫幼虫的死亡率,降低核型多角体病毒的半致死浓度ＬＣ５０,并缩短半致死时间ＬＴ５０．     

马尾松毛虫质型多角体病毒结构蛋白的抗体制备及免疫性

质型多角体病毒的病毒粒子结构蛋白是由衣壳蛋白VP1(Capsid protein,CP)、塔状蛋白VP3(Turret protein,TP)和大突起蛋白VP5(Large protrusion protein,LPP)组成,这3个蛋白分别由病毒基因组片段S1、S4和S7编码.为了解质型多角体病毒结构蛋白的免疫定位情况,本研究从马尾松毛虫质型多角体病毒湖南株中提取病毒核酸,回收、纯化S1、S4和S7片段,经RT-PCR扩增得到对应片段的ORF全长或抗原区的片段,克隆于原核表达载体上,在大肠杆菌BL21菌株中进行了表达,免疫家兔制备了多克隆抗体.Western blot结果显示DpCPV基因组的S1、S4和S7片段分别编码其结构蛋白VP1、VP3和VP5,与推测的结果一致.免疫胶体金的方法也证明S1、S4和S7编码的蛋白定位于病毒粒子衣壳的外表面.本研究首次通过免疫学方法确定了质型多角体病毒结构蛋白在病毒粒子上的定位,为质型多角体病毒的结构蛋白功能和侵染机制研究提供了免疫学方面的基础,对质型多角体病毒的研究有较重要的意义.     

HaNPV多角体蛋白在宿主不同组织中的时相性表达

应用亲和凝胶过滤层析对多角体蛋白多克隆抗血清进行纯化,辣根过氧化物酶进行标记,用于ＥＬＩＳＡ法检测中肠、血淋巴、脂肪体中的多角体蛋白的含量变化．结果：中肠在感染２４ｈ含量最高,４８ｈ最低,７２ｈ较４８ｈ略有升高,９６ｈ和１２０ｈ与７２ｈ基本保持一致;血淋巴在感染４８ｈ含量最高,然后下降至９６ｈ,１２０ｈ又稍有升高;脂肪体在感染７２ｈ开始增加,直至１２０ｈ．三种组织中多角体蛋白含量变化并不同步．从表达的时相性看,与ＮＰＶ的感染过程基本一致,即从中肠至血腔再到脂肪体．免疫电镜观察表明,感染７２ｈ的中肠,在胞浆中合成的多角体蛋白此时已转运到细胞核中     

杆状病毒包涵体蛋白的共同抗原性

在比对已公布的37种杆状病毒包涵体蛋白氨基酸序列的基础上,选定棉铃虫核型多角体病毒(HaNPV)多角体蛋白的两个高度保守多肽(54-113aa和206-245aa)制备多克隆抗体,用Western blot法检测这两个高度保守多肽与多种杆状病毒包涵体蛋白之间的血清学关系.结果表明,HaNPV多角体蛋白的两个多肽的抗体与14种核型多角体病毒的多角体蛋白和5种颗粒体病毒的颗粒体蛋白均有明显的杂交信号,表明杆状病毒的包涵体蛋白之间具有共同的抗原决定簇.根据杆状病毒包涵体蛋白之间的这种血清学关系,进一步讨论了利用免疫金试纸技术检测病毒杀虫剂中包涵体含量的可行性.     

荧光增白剂对重组苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒的增效作用

以β-半乳糖苷酶基因为标志基因的重组苜蓿银纹夜蛾核型多角体(AcMNPV-hsp70／lacz)研究光增白剂对该病毒的增效作用及其作用方式．通过病毒毒力的生物测定表明：光增白剂FB-28能提高甜菜夜蛾幼虫的死亡率，降低半致死浓度，缩短半致死时间；光增白剂的增效作用与感染虫龄有关．此外，应用组织切片技术对中肠组织病理以及血淋巴细胞感染观察表明：在幼虫的病毒接种物中添加合适浓度的荧光增白剂不会改变病毒在幼虫中肠组织中的感染部位，却可以提高幼虫对病毒的敏感性，产生更多的病灶．图版1图4表3参19     

油桐尺蠖病毒杀虫剂的药效分析

油桐尺蠖核型多角体病毒（BsSNPV）是一种高致病力的病毒株,生物测定nPIB（LC50）=1．657×104mL．经过全国7个省20多个单位联合试验,生物统计结果表明：BsSNPV防治第1代油桐尺蠖虫口下降率为97．2％;防治第2代油桐尺蠖虫口下降宰为93．97％;F测验其t值为0．184,小于理论t0．05（29）＝2．045．优于敌百虫、DDVP、辛硫磷和BT等农药是一种杀虫效果稳定、使用安全、经济有效的生物杀虫剂．     

EoNPV的限制性酶切图谱及polyhedrin基因和egt基因的定位

用８种限制性内切酶酶解茶尺蠖Ｅｃｔｒｏｐｉｓｏｂｌｉｑｕａ核型多角体病毒（ＥｏＮＰＶ）基因组ＤＮＡ,获得大于０．８８ｋｂ的片段数分别为７、３８、１９、１７、１６、９、３２和１４．由此统计,基因组平均大小大于１１８．５ｋｂ,即Ｍｒ约大于７８．６×１０６．用ＢｍＮＰＶ的多角体蛋白（ｐｈ）基因和ＡｃＭＮＰＶ的ｅｇｔ基因为探针,应用Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交方法,将ＥｏＮＰＶ的ｐｈ基因定位于ＢａｍＨＩＡ、ＣｌａＩＤ、ＥｃｏＲＩＭ、ＥｃｏＲＶＬ、ＨｉｎｄⅢＦ、ＰｓｔＩＡ、ＳａｌＩＨ和ＸｈｏＩＢ片段上,将ｅｇｔ基因定位于ＢａｍＨＩＡ、ＣｌａＩｌ、ＥｃｏＲＩＫ、ＥｃｏＲＶＡ、ＨｉｎｄⅢＨ、ＰｓｔＩＡ、ＳａｌＩＢ、ＸｈｏＩＩ片段上．通过克隆和酶切鉴定ＥｃｏＲＩＭ和ＥｃｏＲＶＬ片段,测定ｐｈ基因部分序列,并以ＥｃｏＲＩＭ为探针对基因组酶切印迹进行杂交,制作了ＥｏＮＰＶｐｈ基因和ｅｇｔ基因区的酶切图谱,推定ｅｇｔ基因保守区位于ｐｈ基因上游约４．５５ｋｂ处．     

铈对马尾松离体胚DNA、RNA及蛋白质合成的影响

用含30mgL^-1CeCl3的培养瘁培养马尾松离体胚，采用^3H-T、^3H-U和^3H-Leu标记技术测定：结果表明，CeCl3明显提高马尾松离体胚在培养过程中对DNA、RNA和蛋白质前体的吸收，以及合成这些生物大分子的能力。CeCl3处理在15h开始迅速吸收DNA前体和合成DNA，比CK提前5h。CeCl3处理在10h开始迅速吸收RNA前体和合成RNA，比CK提前5h，CeCl3处理5h,蛋白质合成前体的吸收量和蛋白质合成量明显高于CK。图6参19     

黄地老虎NPV增效作用的研究

对黄地老虎核型多角体病毒（ＡｓＮＰＶ）的多角体蛋白和病毒粒子组分进行分离纯化,分别与棉铃虫核型多角体病毒（ＨａＮＰＶ）混合感染三龄棉铃虫幼虫,发现此二种组分均能够提高棉铃虫幼虫的死亡率,缩短半致死时间,降低半致死浓度。使用酶联免疫吸附测定（ＥＬＩＳＡ）技术检验ＡｓＮＰＶ多角体蛋白和病毒粒子与粘虫颗粒体病毒增效因子（ＰｓＧＶ－ＳＦ）和ＨａＮＰＶ多角体蛋白的同源性,发现ＡｓＮＰＶ多角体蛋白和病毒粒子与     

植物根瘤内痕量Frankia DNA的提取及鉴定

建立了一种简捷、快速植物根瘤内痕量Frankia DNA的提取方法,即采集自然态下根瘤,剥离瘤瓣,取瘤瓣尖经液氮研主民粉末,以20g/L CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）消化胞壁,然后以d=5-10μm的石英粉吸附DNA,再以无菌去离子蒸馏水释放DNA,所获DNA产率及纯度较酚／氯仿法好。经对辽宁沙棘、色赤杨根瘤的瘤内痕量Frankia DNA及体外培养的9种Frankia菌株DNA分纯,并用于酶切及PCR,获满意结果。图3参12     

萘降解质粒pND6的分离和鉴定

从工业废水中分离的假单胞菌 (Pseudomonassp .)ND6菌株 ,能以萘为唯一碳源生长 ,使无机盐培养基(MM)中 2g/L的萘在 48h内降解 98% .该菌株含有一个 115kb的大质粒pND6 .DNA杂交实验表明 ,pND6质粒含有与恶臭假单胞菌 (P .putida)G7菌株的NAH7质粒同源的萘降解基因 .图 3表 1参 14     

经DNA改组的植酸酶纯化和酶学性质

经DNA改组的重组植酸酶通过有机膜超滤、DEAE -SepharoseF .F离子交换层析两步纯化 ,其纯度可达90 %左右 .SDS -PAGE分析表明 ,重组植酸酶的分子量Mr 约为 85 0 0 0 .酶学实验结果表明 :该酶反应最适pH为 4 .5 ,最适温度为 4 0℃ ,Km为 0 .11mmolL-1,Vmax为 96 4mmolL-1min-1,植酸酶活性不依赖任何金属离子的存在 .向酶液中分别添加MgSO4、阿拉伯糖、果糖、半乳糖、乳糖、海藻糖、蔗糖及葡萄糖 (10 0 g/L)后 ,植酸酶在 90℃处理 10min的活性比对照增加了 1～ 3倍 ,说明这些物质为酶保护剂 ;在 37℃下以植酸钠为底物的SDS对酶活性具有强烈的抑制作用 ;金属离子如Cu2 ,Zn2 ,K 以及EDTA对酶活性具有较弱抑制作用 ;金属离子如Mn2 ,Mg2 、Fe2 、Ba2 、Ca2 、Co2 低浓度时对酶活性有促进作用 ,当Mg2 浓度增加到 10mmolL-1时 ,则对酶活性起抑制效应 .图 4表 4参 19     

湖流域土壤微生物基因组总DNA分离纯化及其质粒文库的初步构建

采用研磨／冻融和SDV蛋白酶K热处理以及CTAB处理等理化方法，直接从太湖流域土壤样品中抽提得到微生物总基因组DNA，所得粗DNA用透析袋法以及Nucleaotrap suspension DNA纯化试剂盒进行了纯化，纯化过的DNA能够满是常用限制性内切酶酶切、细菌16S rDNA通用引物和随机引物进行PCR扩增的要求，将所得纯品DNA经过EcoRI部分酶切之后与酶切并脱磷酸的pSK^ 空载体连接，再以大肠杆菌JM109为宿主细胞初步构建了土壤微生物基因组文库，图6参7     

丁布的分离、纯化和结构鉴定及其对麦长管蚜

从玉米苗中分离、纯化得到丁布，利用纸层析，紫外分光光度扫描和核磁共振^1H NMR等技术对其作结构鉴定。结果与文献报道基本一致，且纯度在96.7%以上，以纯化的丁布为标样，用HPLC方法分析了不同抗性级别的小麦品种中丁布的含量。结果表明：品种之间丁布的含量差异显著，丁布的浓度与小麦的抗蚜级别呈显著负相关，与麦长管蚜的内禀增长率rm亦呈显著负相关，借助麦长管蚜全纯人工饲料研究表明，丁布对麦长管蚜有明显的拒食性作用。图3表2参13。     

玉米种子的DNA指纹计算机化鉴定

对１２个优良玉米自效系的ＤＮＡ进行了ＲＡＰＤ分析,共筛选了２５０个Ｏｐｅｒｏｎ引物,其中１２个引物共扩增出５９个多态性产物,根据这５９个多态性ＲＡＰＤ产物,对１２个自交系进行了聚类分析,把它们分为３个群,结果与根据系谱法的聚类结果一致。经过优选,用ＯＰＮ－１１扩增出的１１种ＤＮＡ带,建立了这１２个自交系的ＲＡＰＤ－ＤＮＡ指纹图谱。在该图谱呼弱个自交系都具有特异的ＤＮＡ指纹,可以与其它自效纱相区别。     

一些硝化细菌的分离与鉴定

采用硝化细菌选择培养基从土壤、污水中筛选获得了 10株细菌 (X0 1～X10 ) ,经革兰氏染色及生理生化鉴定均为革兰氏阴性菌 ,呈杆状或球状 ,均能够利用亚硝酸盐 .电镜观察发现 ,这 10株细菌均具有比较复杂的细胞膜结构 ,与报道的硝化细菌所特有的膜结构相同 .对硝化细菌的特征性基因norB进行检测结果表明 ,所有菌株均可扩增出该基因 .初步判断所筛选的细菌为硝化细菌 ,依据《伯杰细菌鉴定手册》进行分类 ,主要为硝化杆菌、硝化球菌和硝化刺菌属等 .图 3表 4参 15