深海沉积物微生物宏基因组文库中IMP环水解酶的筛选及基因克隆

为了解嘌呤合成途径的关键酶——IMP环水解酶的多样性,从深海沉积物样品中提取总DNA构建Cosmid宏基因组文库,从中筛选出一个具有IMP环水解酶活性的克隆(CAIMP1).通过基因步移的方法从CAIMP1的约35 kb的插入片段中扩增出长度为1 599 bp的完整的IMP环水解酶基因,该基因包含MGS和AICARFT_IMPCHas两个保守结构域.活性检测结果表明CAIMP1克隆的发酵液上清具有较强的IMP环水解酶活性.该酶与数据库中收录的IMP环水解酶的氨基酸序列同源性较低,系统发育分析也表明该酶与其它参照序列亲缘关系较远,表明该序列可能为一个新的IMP环水解酶基因.     

基于序列筛选发掘宏基因组文库中的新颖卤化酶基因

绝大部分微生物的不可培养性使微生物的开发利用受到了限制,而宏基因组学策略为研究土壤中的不可培养微生物提供了途径.天然卤化物具有抗菌活性和抗肿瘤活性等生物活性,卤化酶在催化化合物的卤化过程中,对化合物活性产生重要影响,而以卤化酶基因为探针,可以发现与之偶联的天然生物合成基因簇,为卤化物的发现提供基础.利用卤化酶基因序列的保守区域设计简并引物,筛选土壤宏基因组文库获得卤化酶阳性克隆,并对获得的卤化酶基因间的进化及其与天然产物合成的关系进行分析.结果显示:通过同源序列筛选获得了65个卤化酶阳性克隆,序列同源分析表明约85%的阳性克隆中的卤化酶基因序列与已知卤化酶的相似性低,所获卤化酶基因具有较好的新颖性和多样性.而对所获克隆中生物合成相关基因的分析表明其中一个克隆中同时存在聚酮合酶基因与卤化酶基因,其可能与卤代I型聚酮合成相关.本研究基于序列筛选的方法,从宏基因组文库中发现了新的卤化酶基因和聚酮合酶基因,为进一步发现新颖的天然卤化物生物合成基因簇及天然卤化物奠定了基础.     

深海沉积物宏基因组文库中产蛋白酶克隆的筛选及性质分析

提取东太平洋深海沉积物宏基因组DNA,构建了未培养微生物宏基因组文库.该文库平均插入片段30 kb以上,含有7 000个克隆,含外源DNA总长度约为210 Mb.从文库中筛选到18个产胞外蛋白酶的克隆,16S rRNA分析表明,它们分别来源于假单胞菌(Pseudomonas)、寡养单胞菌(Stenotrophomonas)和弧菌(Vibrio)3个菌属.根据活性大小及来源菌株的16S rRNA序列比较,选择10个蛋白酶进行酶学性质分析,结果表明,它们的最适作用pH值在7～10之间,最适作用温度在10～40℃之间.其中Pro20蛋白酶最适作用温度最低,为10℃;Pro1蛋白酶具有最适作用温度低(20℃)、pH耐受性好、热稳定性较好等特性,具有良好的应用开发潜力.图6参16     

西藏米拉山高寒草甸土壤微生物DNA提取及宏基因组Fosmid文库构建

青藏高原土壤中富含特殊的微生物资源,因大多数未能得到培养而无法利用.提取微生物总DNA及构建宏基因组文库的方法是研究未培养微生物的重要方法(免培养法).两藏米拉山高寒草甸土壤中腐植酸、有机质含量非常高,DNA提取非常困难,本研究表明卣接法提取该样品的DNA片段小,杂质含量高,不能满足构建大插入片段文库的要求;结合低速离心和Nycodenz密度梯度离心先分离出微生物细胞的间接法虽然DNA产率降低,但是纯度高,片段长,多样性丰富,更适合于构建大插入片段文库.在间接法提取高质量西藏高寒草甸土壤微生物DNA的基础上,成功构建了一个包含30 624个克隆、库容量超过1 Gb、稳定性好的宏基因组Fosmid文库,为从西藏高原土壤中挖掘和利用新的功能基因研究奠定了基础.图7表3参27     

活性污泥宏基因组芯片DNA的制备方法

宏基因组芯片的探针是通过构建环境DNA的宏基因组文库而获得的,为了获得理想的活性污泥宏基因组文库和宏基因组芯片探针,必须获得高质量的活性污泥DNA.本文作者采用8种不同的DNA提取方法提取活性污泥的总DNA,并通过比较DNA总量、纯度、完整性、是否含有PCR酶抑制剂、能否进行限制性内切酶酶切等指标来评价不同提取方法对活性污泥总DNA提取效果的影响.结果表明,溶菌酶-SDS-蛋白酶K-酚氯仿抽提处理活性污泥所提取的总DNA效果最好,提取的DNA总量多、纯度高,DNA片段大于23 kb,无需进一步纯化就可直接进行PCR扩增反应或SauA Ⅰ限制性内切酶酶切,但DNA如果需要EcoRⅠ、HindⅢ等限制性内切酶酶切,则需采用Roche公司琼脂糖凝胶回收试剂盒将DNA进一步回收纯化.图7表3参14     

蔗糖富集环境土壤微生物宏基因组分析及蔗糖水解相关酶基因克隆

蔗糖水解酶是蔗糖转化生成生物质能源的关键酶,且还具有重要的转糖苷功能.针对蔗糖富集的土壤环境,利用未培养的宏基因组技术对蔗糖水解相关的酶基因进行克隆.首先使用微生态分子技术对蔗糖富集的土壤样品进行分析,在可信区间为95%的情况下,样品覆盖率为20%(C指数为0.2),Species richness指数为235.0,Shannon index为5.2889,说明这个蔗糖富集样品中的微生物来源具有广泛性.然后使用宏基因组技术构建这个土壤样品中微生物的DNA文库,成功构建一个包含约100000个克隆的大片段DNA Fosmid文库.对文库中的Fosmid质粒进行随机测序,发现质粒的外源DNA与已报道的DNA都没有同源性,文库所克隆的DNA都来源于仍没有被研究的微生物.使用蔗糖作为唯一碳源对文库进行筛选,获得了能水解蔗糖的克隆.在蔗糖水解能力最强的两个克隆中所包含的蔗糖水解酶与GenBank数据库中已知蔗糖酶的相似性分别为38%和68%.     

宏基因组技术及其在环境保护和污染修复中的应用

宏基因组学是分子生物学技术应用于微生物生态学研究而形成的一个新概念,以环境中末培养微生物为研究对象,通过直接从环境样品中提取全部微生物的DNA,构建宏基因组文库,利用基因组学策略研究环境样品所包含的全部微生物的遗传组成及其群落功能.从1998年提出至今,该项技术已经广泛应用于工业、农业、医学等研究领域.文章在对宏基因组学的概念、研究方法、存在问题的综述基础上提出了相应的解决方法,并指出该技术在环境保护和污染修复中存在潜在的应用价值.利用该技术可以深入了解特定环境中微生物空间分布和动态变化,为环境监测、预警和评价提供理论依据.     

基于宏基因组技术获得的对厌氧氨氧化菌代谢的新理解

厌氧氨氧化菌(Anaerobic ammonium oxidation bacteria,AAOB)是化能自养菌,由于其生理代谢的奇异性、细胞结构的特殊性以及对氮素循环的重要性,已成为环境工程、微生物以及海洋生物学等领域的研究热点.然而,AAOB未能实现纯培养的现状已成为AAOB代谢途径研究的巨大障碍.近年来兴起的宏基因组技术(Metagenomics)为AAOB代谢途径的研究提供了新手段.采用宏基因组技术,可直接研究微生物群体中某特定微生物基因组的结构与功能,摆脱了传统微生物学研究对纯培养的依赖,使未培养微生物的认识和开发成为可能.本文首先简述获取AAOB宏基因组信息的过程,然后通过比较由传统代谢研究方法和宏基因组技术获得的AAOB代谢途径的研究成果,论述基于宏基因组技术获得的对AAOB代谢的新理解,得出以下结果和结论:1)AAOB的碳素固定途径为乙酰辅酶A途径,碳素固定的还原力来自NADH或者QH2;2)AAOB氮素转化的重要中间产物是NO,而非NH2OH,并提出了以NO为核心的AAOB代谢的改进模型;3)AAOB的ATP合成途径为氧化磷酸化,推测的电子传递途径为N2H4—QH2—细胞色素bc1复合体;细胞色素bc1复合体再将电子用于NO2-还原和N2H4合成.AAOB的宏基因组技术使AAOB代谢途径的研究更具方向性.随着分子生物学理论和技术的不断发展,宏基因组学的升级技术(如宏转录组学、宏蛋白质组学)将为AAOB代谢途径的研究提供新的方法与平台.图3表1参51     

纤维素酶产生菌HS-F9的筛选鉴定和产酶条件优化

为了选育高产纤维素酶菌株,通过刚果红鉴别培养基以及滤纸条崩解实验测定,从牛粪堆肥中筛选到一株产纤维素酶的真菌HS-F9,根据菌株形态特性和18SrRNA基因序列分析,初步鉴定该菌为绿色木霉(Trichoderma viride).利用液体发酵培养产生纤维素酶,研究了碳源、氮源、培养时间、培养温度、培养基起始pH、接种量对菌株HS-F9产酶的影响.结果表明:产EG、CBH和FPA的最适碳源均为CMC-Na;EG和CBH在以蛋白胨为唯一氮源时酶活最高,FPase则在以黄豆粉为唯一氮源时酶活最高;产生EG、CBH和FPA的最适温度分别为30℃、30℃、33℃;最适起始pH为3.0、3.0和4.0;EG和FPase的最适接种量为2%,CBH最适接种量达到了8%;培养时间均以5～6d为宜.在最适条件下培养,该菌株EG、CBH和FPase的酶活分别达到了5275.3U/mL、8502.1U/mL和3619.1U/mL,是未优化前的1.42、1.35和1.32倍.图6表2参23     

重金属复合污染土壤中耐铅镉微生物的筛选及鉴定

为获得复合重金属高耐性微生物资源菌株,采集广西桂西北尾矿区重金属污染的土壤样品,采用改良的马丁氏培养基分离和筛选既耐铅又耐镉的高耐性微生物.结果获得了一株耐铅浓度为1 200 mg/L、镉浓度为120 mg/L的铅镉复合耐性真菌——菌株K-3.该菌株(K-3)最适生长环境为温度30℃、p H值7.0、盐浓度3%.通过形态结合分子生物学鉴定得知,K-3菌株与已知分类地位的标准菌株Uncultured Westerdykella的18S rDNA序列一致性为99%.本研究获得的铅镉复合耐性真菌——菌株K-3是重金属铅和镉的最强双耐真菌之一,可为微生物或微生物联合植物修复重金属污染土壤提供重要的微生物种质资源.(图8表3参39)     

基于宏基因组(metabarcoding)技术的橡胶种植对林下节肢动物多样性的影响

地处热带边缘的西双版纳地区近几十年来土地利用方式发生巨变,热带森林逐渐被单一种植橡胶林所替代.探讨森林-橡胶林镶嵌格局对节肢动物群落组成和多样性的影响,分析节肢动物群落分布格局的驱动因素,以期为残存森林的保护提供相关科学数据.以西双版纳纳板河流域不同景观梯度下的片段森林和橡胶林为研究样地,采用马氏网诱集法,结合宏基因组...     

航天器AIT厂房环境中嗜极微生物的筛选与鉴定

航天器组装、集成与测试厂房(AIT厂房)是航天器携带微生物的重要环境来源之一.在深空探测过程中,来自航天器AIT厂房环境中的嗜极微生物可能会对地外星球环境造成正向污染.通过低温(4℃)、一定强度的紫外辐射(Ultraviolet,UVC波段)等筛选条件,应用细菌16S rRNA序列分析,对我国某AIT厂房环境中的耐冷微生物和耐辐射微生物进行筛选与分离鉴定.从AIT厂房环境中共筛选出16株嗜极微生物,包括9株耐辐射微生物和7株耐冷微生物.耐辐射微生物分别属于7个属,其中芽孢杆菌属(Bacillus)和微球菌属(Micrococcus)各2株,土地芽孢杆菌属(Terribacillus)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、考克氏菌属(Kocuria)、奇球菌属(Deinococcus)和甲基杆菌属(Methylobacterium)各1株.耐冷微生物分别属于6个属,其中马赛菌属(Massilia)2株,芽孢杆菌属(Bacillus)、节杆菌属(Arthrobacter)、不动杆菌属(Acinetobacter)、假单胞菌属(Pseudomonas)和嗜冷杆菌属(Psychrobacter)各1株.本研究表明AIT厂房内存在一定数量的耐冷和耐辐射微生物,其发现对于我国深空探测任务中继续开展行星保护重点微生物的识别,并针对性地开发空间微生物防控技术和制定操作规范均具有重要意义.(图4表5参31)     

草鱼肠道纤维素酶产生菌主要种类的分离与鉴定

从我国特有的草鱼肠道内分离到纤维素酶产生菌,其中4株具有较高的纤维素分解能力,测量了其羧甲基纤维素酶(CMCase)、棉花酶和滤纸酶(FPase)活性,并进行了种类鉴定.结果表明,草鱼肠道具有一定的纤维素分解能力,可能来自于肠道细菌所产生的外源性纤维素酶的协同作用;草鱼肠道内纤维素分解菌具有较高酶活性;不同菌株所产生的相同纤维素酶的活性存在差异;其中,X7的CMCase活性最高,达0.83 U/mL,X5的棉花酶活性最高,达0.87U/mL,X8的FPase活性最高,达0.54 U/mL.4种菌株的菌落形态有差异,经16S rRNA基因鉴定,X5、X6、X7为枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis),X8为阿氏肠杆菌(Enterobacter asburiae).图6表3参19     

油田土壤中脱除有机硫菌株的分离与鉴定

从中原油田采集的土壤样品中分离得到有脱除有机硫(二苯并噻吩)能力的菌株ZYX。该菌株为革兰氏染色阳性,无运动性,专性需氧,固体培养基上菌落为浅黄色、圆形、湿润、有光泽、边缘整齐,培养2d后平均直径为1.5mm,在液体培养基中有明显的杆-球状生长周期。对该菌株的16SrDNA的全序列测序,并进行DNA同源性分析,发现它与与Arthrobactersp.P2的同源性为99.53%,其主要形态及生理生化特征也与Arthrobacter属相符。实验表明,最佳生长所需的DBT浓度是0.01g·L-1,最适pH值为7.0,最佳碳源和氮源分别为甘油和谷氨酰氨。     

铜陵新桥矿区土壤中耐Cu微生物的筛选研究

选择安徽铜陵新桥矿区富Cu的污染土壤,充分利用微生物受自然环境重金属胁迫而产生耐性这一特点,进行土壤中耐Cu微生物的筛选研究。实验过程中分别配制三种不同的培养基,细菌、真菌和放线菌培养基。在水浴恒温振荡器中对土壤中耐受重金属的微生物进行驯化,将得到的对Cu2+耐受性最高的液体培养基作为菌源,在琼脂平板培养基上进行划线分离,并将得到的纯菌株在光学显微镜下进行形态观察,菌种经试管斜面富集培养后保存在4℃冰箱中以便后续使用。研究发现,土样中细菌和真菌对Cu的耐受性低,最高耐受质量浓度分别只达到500mg·L-1和1100mg·L-1。而放线菌表现出Cu高耐受性,分离得到的放线菌耐受Cu的质量浓度最高达到10000mg·L-1,初步鉴定该放线菌株为链霉菌属。该放线菌菌种可能同时对Cu有吸附降解特性,具有成为污染土壤生物治理的高效耐受吸附菌种的潜力巨大。     

铜陵新桥矿区土壤中耐Cu微生物的筛选研究

选择安徽铜陵新桥矿区富Cu的污染土壤,充分利用微生物受自然环境重金属胁迫而产生耐性这一特点,进行土壤中耐Cu微生物的筛选研究。实验过程中分别配制三种不同的培养基,细菌、真菌和放线菌培养基。在水浴恒温振荡器中对土壤中耐受重金属的微生物进行驯化,将得到的对cu2＋耐受性最高的液体培养基作为菌源,在琼脂平板培养基上进行划线分离,并将得到的纯菌株在光学显微镜下进行形态观察,菌种经试管斜面富集培养后保存在4℃冰箱中以便后续使用。研究发现,土样中细菌和真菌对cu的耐受性低,最高耐受质量浓度分别只达到500mg·L-1和1100mg·L-1。而放线菌表现出cu高耐受性,分离得到的放线菌耐受Cu的质量浓度最高达到10000mg·L-1,初步鉴定该放线菌株为链霉菌属。该放线菌菌种可能同时对Cu有吸附降解特性,具有成为污染土壤生物治理的高效耐受吸附菌种的潜力巨大。     

Dietzia菌随机插入突变体文库的构建及功能基因筛选

Dietzia属菌具有很好的烃类降解和良好的高盐、高碱耐受能力.为研究Dietzia属降解烷烃和耐受盐碱的分子机制,以Dietzia sp. DQ12-45-1b为研究菌株,利用双质粒系统p Tip-istAB-sacB和pRTSK-sacB,成功构建库容为30 720的随机突变体文库.随机挑选的突变克隆及突变克隆传代20次后的Southern blot结果表明:转座序列插入的随机性较好,均为单插入突变,并且具有较好的遗传稳定性,可用于长期筛选功能基因.在此基础上,分别以高盐培养和正十六烷为单一碳源培养,利用高通量基因筛选,成功获得了一个耐盐突变体M9G和5个降解利用正十六烷相关突变株M6A、M6B、M7A、M9A、M81C.与野生型相比,5个降解利用正十六烷相关突变株的降解率下降范围为16.67%-84.35%.插入位点分析结果显示,M9G、M6A、M6B、M7A、M9A和M81C的插入基因分别预测为丝氨酸蛋白酶、铁氧化还原蛋白、假定蛋白、铁氧化还原蛋白还原酶、ABC转运蛋白和细胞色素P450类CYP153烷烃羟化酶.其中除了预测假定蛋白外,有些基因与传统上确定的功能存在差异,暗示着其可能具有新的功能.Dietzia菌随机插入突变体文库的构建及筛选可为研究Dietzia菌的抗逆和烷烃降解机制奠定基础.(图6表3参28)     

不同国家土壤生态筛选值比较与启示

土壤污染生态风险防控是我国土壤环境保护和管理的重要目标.与国外发达国家相比,我国尚未建立基于生态风险的土壤筛选值(土壤生态筛选值),当前有关土壤生态筛选值的综述相对较少.本文系统梳理了美国环境保护局(EPA)、英国环境署(EA)、荷兰住房、空间规划和环境部(VROM)和加拿大环境部长理事会(CCME)制定的土壤生态筛选值,从标准定位、关键受体、暴露途径、推导方法和生物有效性等方面进行对比分析.结果表明,不同国家土壤生态筛选值均考虑了土壤直接接触毒性和经生物富集和生物放大的二次毒性,推导方法普遍采用生态风险评估方法,并充分考虑污染物的生物有效性.然而,当前我国土壤风险管控标准中仅GB 15618—2018农用地标准的部分考虑了污染物对农作物生长和土壤生态的影响,且试验和推导方法与国外筛选值存在较大差异.因此,“十四五”期间建议初步构建我国土壤生态风险评估框架,明确土壤生态筛选值的定位、作用和使用形式,加强代表性物种和典型土壤的陆生生态毒理学等基础研究,建立科学、规范的土壤生态筛选值制定方法和配套指南,尝试建立适合我国土壤区域特征的土壤污染归一方程和淋洗/老化因子,为我国土壤生态筛选值的制...     

一株产耐热纤维素酶菌株的筛选及酶学性质

采用纤维素刚果红平板法从大田蘑菇种植场建堆的稻草样中分离得到了1株能产具有较好温度耐受性和pH稳定性的纤维素酶的放线菌DY3.综合形态、生理生化特征以及16S rDNA序列分析,将其初步鉴定为嗜热裂孢菌(Thermobifida fusca).对该菌所产纤维素酶的性质研究表明:最适催化温度为65℃,在70℃保温60 min后仍有75%以上的活力;最适催化pH为7.5,在pH 5.5～10.0之间该酶的稳定性较好,pH 10.0的条件下仍有80%的活力;最适作用底物是羧甲基纤维素钠.研究可为木质纤维素的生物预处理提供一定参考价值.     

北京市大气飘尘和土壤样品中邻苯二甲酸酯的分离鉴定

大气飘尘和土壤样品用苯-甲醇混合溶剂萃取,硅胶柱层析进行预分离,收集含有邻苯二甲酸酯类的组分,用GC和GC/MS分离鉴定,确证北京市大气飘尘中含有邻苯二甲酸酯的二正丁酯,二异丁酯和二异辛酯,土壤样品中含有二正丁酯和二异辛酯,给出不同样品的定量结果并结合文献进行了讨论。