一种白腐真菌的分离、鉴定、培养及产漆酶条件

白腐真菌是一类降解木质素使木材形成白色腐朽的担子菌,往往具有高产胞外漆酶的活性.从北京农学院校园内分离到一株高温型、高产漆酶白腐真菌菌株,编号为BUA-01.结合形态学特征与ITS序列分析,确定其分类学地位;进一步研究其菌丝生长的最适碳源、氮源、碳氮比(C/N)、生长因子、最适温度和最适p H值;利用不同浓度Cu~(2+)(Cu SO4)的诱导,探讨液体发酵条件下对胞外漆酶产量的影响;通过向发酵液中加入3种偶氮染料(依文思蓝、甲基橙和铬黑T),研究菌株对染料的降解效果.结果表明,该菌株与毛栓菌(Trametes hirsuta)的同源性最高,为100%,遗传距离为0,确定BUA-01菌株为栓菌属(Trametes)真菌.菌丝体生长的最适碳源为淀粉,最适氮源为黄豆粉、酵母浸粉,最适C/N值为40/1和10/1,最适温度为37℃,最适p H为6.0-7.0,供试生长因子对菌丝生长无显著促进作用.0.25m mol/L的Cu~(2+)对胞外漆酶产量有极显著的促进作用,在96 h时,发酵液的活性达到最高,为1081.33±6.3 U/m L,是对照组的26倍.BUA-01菌株对偶氮染料降解效果显著,12 h对依文思蓝、甲基橙和铬黑T的脱色率分别为93.31%±0.16%、92.37%±0.42%和79.25%±0.64%.本研究表明菌株BUA-01在产胞外漆酶和染料降解方面具有潜在应用价值.     

耐高盐撕裂蜡孔菌P2对模拟橙黄G染料废水的脱色及废水脱色前后的毒性测试

为评价撕裂蜡孔菌P2处理橙黄G染料废水的应用潜力,采用批次实验在开敞系统中研究静置与摇动、染料初始浓度、pH、温度、盐度、碳源、氮源、金属离子等因子对该菌降解橙黄G染料废水的影响,同时利用植物萌发与微生物抑菌试验进行染料与脱色溶液的毒性测试.结果表明,与摇动培养相比,静置培养更适合于撕裂蜡孔菌的脱色,最适脱色pH与温度分别为9和25℃.盐度测试结果显示撕裂蜡孔菌能在浓度为128 g L-1的盐溶液中能进行高效脱色,可达70%以上.在上述参数体系的优化基础上,分别进行了碳源、氮源与金属离子的添加优化实验,结果显示碳源、氮源与金属离子的最适浓度分别为4 g L-1葡萄糖、0.15 g L-1硝酸铵和0.1 mmol L-1 Zn2+.菌丝吸附在整个脱色过程中作用较小,撕裂蜡孔菌对橙黄G的脱色过程以酶的降解为主,未发现该菌分泌漆酶,只分泌锰过氧化物酶与木质素过氧化物酶,其最高活性分别为230 U mL-1和158 U mL-1.植物与微生物毒性分析显示撕裂蜡孔菌脱色后的产物对植物与微生物的毒性大大降低.因此,撕裂蜡孔菌对于处理橙黄G染料废水具有良好的应用潜力.     

微酸多年卧孔菌产漆酶条件优化及其在染料脱色中的应用

微酸多年卧孔菌(Perenniporia subacida)产漆酶能力对生物漂白等研究具有重要意义.通过单因子和正交试验确定了微酸多年卧孔菌(菌株号:Dai 8224)的最适产酶条件:麦芽糖20 g/L,酵母浸粉5 g/L,pH 5.4,Cu2+2.0 mmol/L,培养温度24℃,转速160 r/min,接种量1.5%(V/V),此时酶活最高可达1.945 U/mL.单独使用微酸多年卧孔菌漆酶粗酶液对染料具有很好的脱色效果.该菌株对于50 mg/L杂环类染料中性红的脱色率可达98.3%,对偶氮染料刚果红的脱色率次之,为91.57%,对亚甲基蓝和铬天青的脱色率也都在80%以上.此外,其催化中性红脱色的最佳底物浓度为60 mg/L,脱色率达到99.42%,其中,生物降解作用占55.92%,菌体吸附作用占43.5%.结果表明该菌对多种染料脱色具有较大的应用潜力.图4表3参31     

黄曲霉A5p1脱色糖蜜酒精废水机理初探

研究自行筛选的一株黄曲霉(Aspergillus flavus)A5p1(保藏号CGMCC.4292)对糖蜜酒精废水(MSW)的脱色机理.在外加蔗糖情况下菌株A5p1对MSW具有较好的脱色效果,脱色率由14%增高至58%;脱色进程与细胞生长基本同步.从培养液中检测出3种木质素过氧化物酶——漆酶(Lac)及两种胞外过氧化物酶即锰过氧化物酶(MnP)和不依赖锰的过氧化物酶(MiP)的酶活,但是水平不高,认为此3种酶不是主要的脱色机制.发现由各种代谢过程产生的总H2O2生成速率与脱色率基本同步,同时在第4天达到最大值,随后下降;还原糖总消耗也在初期阶段较快.外加蔗糖后总H2O2生成速率增加10倍,达到0.0027 mmol·min-1·mL-1.认为体系中脱色机制可能与产H2O2的酶相关.紫外可见光谱分析和凝胶色谱分析表明脱色过程中有大分子物质降解.综上所述初步认为,黄曲霉A5p1脱色糖蜜酒精废水是一个受产H2O2酶影响、复杂的生物降解过程.     

高含量漆酶食用菌菌渣的筛选及其染料脱色作用

食用菌菌渣(Spent mushroom substrate,SMS)指食用菌出菇后的培养基废弃物,富含菌体蛋白、生物酶、多糖等营养物质,是潜在的生物质资源,用于肥料、饲料、生物修复等领域.我国是全球第一大食用菌生产国,大量菌渣资源一直没有得到科学有效地利用,并造成环境污染.以工厂化、实验室和农业栽培的杏鲍菇、平菇等9种常见食用菌菌渣为材料,进行高产漆酶菌渣筛选,并进一步利用高活性菌渣,对孔雀石绿、活性艳蓝、甲基橙、活性红和活性黑5种染料进行脱色脱毒研究.结果显示,新鲜工厂化杏鲍菇菌渣漆酶活性为7.55×104 U/g.其不同高度菌渣柱对染料脱色的结果显示,15 cm高菌渣脱色效果最佳,对5种染料的脱色率分别为100%、98.60%、72.82%、61.97%和43.73%.全波长光谱扫描显示,孔雀石绿、活性艳蓝经处理后流出液的染料最大光吸收峰显著降低甚至消失.进一步利用其菌渣漆酶粗提物进行染料脱色研究,30℃孵育24 h脱色率分别为81.24%、49.43%、37.62%、26.34%和13.54%.以大肠杆菌和金黄色葡萄球菌为靶标,对酶促染料降解产物进行了毒性研究,结果显示产物毒性均低于未处理染料.本研究表明工厂化杏鲍菇菌渣具有高漆酶活性,能用于孔雀石绿、活性艳蓝等染料废水的脱色、脱毒,具有重要经济和生态价值.(图4表4参43)     

吸附菌HX5对活性艳蓝KN-R的吸附脱色作用

研究了吸附菌HX5对活性艳蓝KNR的吸附脱色作用,碳源、氮源、盐度和染料浓度对KNR吸附脱色的影响,以及HX5生长菌体对KNR的脱色机理.结果表明,菌株HX5对KNR脱色的最佳碳、氮源分别为葡萄糖和硫酸铵;碳源浓度在10g/L以上时,可使200mg/L的KNR完全脱色,碳源浓度过高,脱色效果不显著;HX5对KNR脱色的最佳氮源浓度为0.75g/L,在0～2%的浓度范围内,盐度对脱色无显著影响;染料对菌株HX5具有一定的生长抑制毒性,但对于400mg/L的KNR,脱色率仍可达95.1%;HX5生长菌体对KNR作用96h内主要为生物吸附作用,96h外则可能发生了生物降解.图5表2参9     

稻草秆粉基质中白腐菌对三苯甲烷类染料的降解特性

研究了稻草秆粉基质中白腐菌对三苯甲烷类染料(孔雀绿、溴酚蓝和结晶紫)的降解特性.结果表明,白腐菌10 d内对三苯甲烷类染料脱色率均可达到93%以上.染料加入对木素过氧化物酶分泌有抑制作用.随着培养过程的进行,染料脱色率增加,脱色降解以漆酶为主.紫外扫描发现,染料吸收波长有偏移,标志着染料结构发生变化,其中溴酚蓝能被完全矿化.图2表2参10     

黄孢原毛平革菌对染料和印染废水的降解

白腐真菌黄孢原毛平革菌在合成木素过氧化物酶的限碳培养条件下,可以降解酶性、直接、活性、阳离子等多种类型的印染工业染料、在培养的d5木素过氧化物酶活力最高时,分别加入酸性染料卡布龙红和弱酸大红,质量浓度（ρ/mgL^-1)分别为25、50、100和12．5、25．50,48h后培养液基本脱色,较高浓度下菌膜上有残余染料吸附,5d后染料质量降解率分别是100％、88％、92％和58％、58％、65％、38％。以含有上述两种染料的印染废水置换培养液,并加入葡萄糖1g/L,黄孢原毛平革菌可以直接使废水脱色,菌丝可以重复培养脱色废水至少5批,每批废水的脱色率均大于90％,5批废水总的染料质量降解率约为80％,在重复培养脱色废水的过程中,测不到木素过氧化物酶的活力,说明废水中的染料分子是在细胞表面或进入胞内被降解的,若加入的葡萄糖浓度降低一半以上,菌丝脱色废水的效果将有所下降,图5表5参11     

嗜热复合菌群对偶氮染料的脱色特性及其脱毒

偶氮染料所造成的环境污染问题已成为近年来亟待解决的问题.以前期构建的嗜热偶氮染料降解复合菌群为研究对象,探究其在不同初始p H、培养温度、染料浓度及不同结构偶氮染料的脱色特性,并对不同浓度下染料的降解进行动力学分析;通过紫外-可见光扫描、红外光谱扫描及酶活性变化等分析偶氮染料的生物降解情况.此外,还将通过植物毒理性实验来验证偶氮染料降解后的脱毒情况.研究发现,该复合菌群在初始p H为8、温度为55℃的条件下脱色效果最佳,在含400 mg/L直接黑G的脱色培养基中静置培养48 h后,脱色率高达100%;且对直接黑G具有较高的耐受能力,在3 000 mg/L的条件下脱色率仍高达70%;对不同结构的偶氮染料均表现出较好的脱色性能;动力学分析发现其最佳脱色速率与浓度分别为40.597 3 mg g~(-1) h~(-1)、484.337 6 mg/L.通过紫外-可见光扫描及红外光谱扫描分析发现偶氮染料直接黑G在降解前后化学键及表面官能团发生了明显的变化;酶活性分析发现偶氮染料降解酶在降解后显著提高.此外,植物毒理性实验证明经复合菌群降解后的染料代谢产物对植物的毒性大幅度降低,可能被降解为其他低毒性物质.本研究结果表明该复合菌群具有较好的染料脱色降解性能,这将为偶氮染料的无污染化处理奠定理论基础.(图6表4参43)     

稻草秆粉基质中白腐茵对三苯甲烷类染料的降解特性

研究了稻草秆粉基质中自腐菌对三苯甲烷类染料（孔雀绿、溴酚蓝和结晶紫）的降解特性．结果表明，白腐菌10d内对三苯甲烷类染料脱色率均可达到93％以上．染料加入对木素过氧化物酶分泌有抑制作用．随着培养过程的进行，染料脱色率增加，脱色降解以漆酶为主．紫外扫描发现，染料吸收波长有偏移，标志着染料结构发生变化，其中溴酚蓝能被完全矿化．图2表2参10     

常见离子对漆酶降解活性艳蓝的调控作用

漆酶具有很高的工业价值,但水体中离子的存在为其推广使用带来了巨大挑战.探讨水体中常见的7种阳离子和8种阴离子调控自由漆酶和漆酶–介体系统对水中活性艳蓝降解速率的差异.结果显示:Mn~(2+)、Cu~(2+)、Zn~(2+)、HPO_4~(2-)和NO_2~-在0-10 mmol/L范围内可促进漆酶对活性艳蓝的降解,降解速率由高到低依次为NO_2~-、Mn~(2+)、Cu~(2+)、Zn~(2+)、HPO_4~(2-);SO_3~(2-)、Cl~-、Fe~(2+)和Fe~(3+)对活性艳蓝的降解有抑制作用,其中Fe~(2+)和SO_3~(2-)的最低抑制浓度分别为5和0.5 mmol/L;其他离子对漆酶降解活性艳蓝没有显著性影响.在5种介体的协同作用中,紫脲酸(VA)的效果最佳,导致漆酶对活性艳蓝的降解速率提升10%左右,其余介体的促进效率明显低于VA.在同等离子的调控下,漆酶–介体系统中的降解速率优于自由漆酶.本研究初步揭示了漆酶对活性艳蓝的降解机理,同时可以通过控制水体中离子的种类和数量来更好地实现漆酶对活性艳蓝的降解,结果可为漆酶在实际染料废水处理中的应用提供理论依据.(图4表4参40)     

基于木质素生物降解的堆肥化接种剂开发

选取由农林废物堆肥中筛选出的木质素降解优势土著微生物枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、铜绿假单孢菌(Pseudomonas aeruginosa)、黑曲霉(Aspergillus niger)、简青霉(Penicillium simplicissim)、栗褐链霉菌(Streptomyces badius),依据PLFA-PLS定量分析所得堆肥化2次发酵期有效的木质素降解微生物群落组成比例混合接种至稻草基质发酵瓶中,做1组L9(34)正交试验以优化混合比例,期望开发1种基于木质素降解的高效堆肥化接种剂.试验结果表明:混合菌剂具有较强的木质素降解能力,其对木质素的降解是木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶、漆酶、纤维素酶和半纤维素酶共同作用的结果;当按照个数比细菌∶放线菌∶真菌为85∶5∶ 10,枯草芽孢杆菌∶铜绿假单孢菌为55∶25,黑曲霉∶简青霉为2∶1配比时,木质素、纤维素、半纤维素降解率最高,分别达到22.13%,48.97%和55.93%;在不灭菌前提下,按此配比接入菌剂,其木质素、纤维素、半纤维素降解率分别比不接菌剂发酵稻草提高19.16,38.25和46.30百分点.     

一株聚乙烯降解菌的筛选及其降解特性研究

为解决聚乙烯塑料在自然环境中难降解的问题,从土壤中分离出一株降解菌用于聚乙烯塑料生物降解研究。经筛选纯化,对该菌进行生理生化实验、16Sr DNA序列分析和系统发育进化树构建;将菌株接种于以不同相对分子质量聚乙烯粉末(相对分子质量分别为2000、5000、100 000)和膜片(相对分子质量400 000)为唯一碳源的基础液体培养基中,于30℃、180 rpm下培养;采用分光光度法每隔24 h测定菌体生长浓度、总蛋白含量、还原糖含量以及p H值;培养14 d,采用ABTS法和愈创木酚法测定漆酶和锰过氧化物酶酶活力;培养60 d,称量聚乙烯残留物质量,于扫描电子显微镜下观察膜片表观,对膜片力学性能变化进行测定。鉴定结果表明,该菌为放线菌属的东方拟无枝酸菌(Amycolatopsis orientalis);菌生长浓度随聚乙烯相对分子质量的增大而减小;胞外蛋白质量浓度为(27.625±0.400)~(0.958±0.180)μg·m L~(-1);还原糖质量浓度为(15.664±1.764)~(2.660±0.000)μg·m L~(-1);p H值显著下降;漆酶和锰过氧化物酶酶活力酶活力分别为3 500~3 000 U·L~(-1)和2 600~2 000 U·L~(-1);聚乙烯失重率为(35.81%±0.39%)~(5.57%±0.22%);电镜观察发现膜片表面出现大量降解孔洞和大面积菌体附着;膜片力学性能显著下降;亲水性增大,表面能增大。证明东方拟无枝酸菌能够直接作用于普通聚乙烯塑料表面,是一株高效的降解菌株。推测该菌通过分泌胞外酶氧化聚乙烯长烃链,降低聚乙烯表面能,且在降解过程中产生酸性物质,长烃链最终转化成小分子物质;在菌株降解聚乙烯中起直接作用的酶为漆酶和锰过氧化物酶。     

重组大肠杆菌产CotA漆酶的发酵条件优化

CotA漆酶在环境保护、食品工业和纸浆漂白等工业中具有重要的应用价值.将重组表达载体pET-22b/CotA转入大肠杆菌BL21(DE3),得到工程菌株,采用单因素实验和正交实验相结合的方法,研究诱导表达条件和发酵培养基对重组大肠杆菌产CotA漆酶量的影响.结果表明,初始pH 7.5的培养基中,添加0.6 mmol L-1 Cu2+,1 g L-1葡萄糖作碳源、15 g L-1蛋白胨和2 g L-1硫酸铵作氮源,以10%的接种量,37℃、200 r/min,直到菌液的D600 nm值为1.0,加入终浓度为1.0 mmol L-1的IPTG,25℃诱导12 h,漆酶的产量最高.优化前发酵液的粗提液的漆酶活性仅为1 190 U mL-1,优化后达到3 526 U mL-1,正交实验优化后漆酶活性提高了2.96倍.纯化的CotA漆酶最适反应温度为45℃,最适pH值为7.2.CotA漆酶对RBBR的脱色率在90%以上,此CotA漆酶在短时间内对染料能够有效地脱色,能够成为有潜力的工业用酶.图6表3参17     

二年残孔菌的培养条件优化及其液体发酵产物的抗氧化及漆酶活性

二年残孔菌(Abortiporus biennis)是一种具有抗氧化、抗肿瘤功效的药用白腐真菌,可降解木质素、造成木材白色腐朽.以分离自江苏无锡的二年残孔菌WX-02菌株为材料,开展菌丝最适培养条件、液体发酵产物抗氧化活性及Cu2+诱导产漆酶活性研究.基于单因子试验的最适生长条件结果表明,葡萄糖是WX-02菌株菌丝体生长的最适碳源,牛肉膏和黄豆粉为最适氮源,C/N比为40/1时长势最佳,玉米粉和VC为最适生长因子,而菌丝生长最适pH和温度分别为7.0和32℃10%(V/V)接种量、28℃、150 r/min培养72 h条件下,PD培养基发酵液的总抗氧化活性为2.76±0.31mmol/L(FeSO4)和0.40±0.01 mmol/L(Trolox),DPPH自由基清除率为100.00%±0.00%,总SOD活力为15.75±0.25 U/mL;最适培养条件液体培养基发酵液的总抗氧化活性为0.20±0.03mmol/L(FeSO4)和0.16±0.01 mmol/L(Trolox),DPPH自由基清除率为59.06%±0.61%,总SOD活力为15.65±0.62 U/mL. 0.25 mmol/L Cu2+对胞外漆酶诱导效果最佳,PD培养基、0.25 mmol/L Cu2+、28℃、150 r/min培养96 h,胞外漆酶活性最高,为(1.82±0.02)×105 U/mL,是对照组的1.72倍.本研究表明WX-02菌株具有良好的抗氧化和产漆酶活性,具有药用和环境治理开发应用潜能.(图4表4参34)     

嗜碱细菌降解木质素的复合碳源共代谢研究Ⅱ—营养条件调控机制的研究

文章研究了在蔗糖（第一碳源）＋麦草木质素（第二碳源）的复合碳源组合方式培养条件下,嗜碱木质素降解菌降解木质素的降解率及营养条件调控机制对其的影响。结果表明,蔗糖初始浓度为1g/L,添加0．3％的T－80和0.5mmol/L的ABTS并静置培养对菌株的产酶及降解能力有较大的促进作用。     

一株染料脱色酵母菌的鉴定及脱色特性

从土壤中分离到一株活性艳红K-2BP脱色酵母菌株Y-63,根据其生理生化特征和26S rRNA基因序列相似性分析,鉴定为Pseudozyma rugulosa.该菌在16 h内对100 mg/L的活性艳红K-2BP脱色率为94%,其机理属于降解脱色.该染料脱色的最佳接种量(φ)应不低于5%,最适pH在4～9之间,(NH4)2SO4浓度(w)不低于0.1%,葡萄糖浓度(w)不低于0.2%.此外,该菌株对其它9种50 mg/L的染料(活性艳蓝X-BR、媒介漂蓝B、活性翠蓝KN-G、酸性媒介黄GG、媒介红S-80、依加仑蓝FBL 200%、弱酸艳红B、活性黑KN-B和活性红M-3BE)的脱色率在10%～96%之间.该研究表明酵母Y-63在染料废水的处理上具有较好的应用潜能.     

一组高效木质素降解复合菌的筛选

木质素的有效降解是秸秆等农业废物减量化及资源化利用的难点.采用连续驯化培养的方法,从农业废物堆肥过程升温、降温和腐熟3个阶段的微生物菌群中分别筛选驯化出3组具有木质素降解能力的复合菌MC1、MC2和MC3.通过初筛和复筛实验,筛选出一组性能稳定并具有高效木质素降解能力的复合菌,并对其继代培养的稳定性进行了验证.结果表明,从堆肥升温阶段筛选出的复合菌MC1的木质素降解能力最强.在37℃静置条件下液态发酵培养14d,d6时复合菌MC1各酶活值均达到最大,其中木质素过氧化物酶酶活为258.37UL-1,锰过氧化物酶酶活486.39UL-1,漆酶酶活为49.25UL-1;d14时木质素降解率达到36.25%.继代培养实验结果表明复合菌MC1具有较好的稳定性.图2表1参19     

木质素降解真菌的筛选及产酶特性

通过定性、定量系列实验从土壤中筛选到5株有木质素降解能力的低等真菌，经鉴定属于青霉属、镰刀霉属、曲霉属和木霉属，其中青霉属和镰刀霉属是土壤中木质素转化的主要作用者．降解能力最强的简青霉Penicillium simflitcissimum H5培养13d可降解Kraft木质素40．26％，产酶研究发现，该菌分泌胞外木质素过氧化物酶和漆酶，其中前者主要在培养前期产生，后者在整个培养过程中均有较好的活性．图4表1参14.     

一株白腐菌产生的漆酶对RB亮蓝的脱色作用

W 1是一株能在液体条件下产漆酶的白腐菌 ,纯化的漆酶对RB亮蓝有很好的脱色作用 .漆酶的最适脱色温度为 4 5℃ ,最适脱色pH值为 6 .0 ,脱色pH范围在 4～ 7之间 .当溶液中漆酶活力为 2 .0× 10 3 U/L时 ,在最适脱色条件下、16h内 ,RB亮蓝 (30 0mg/L)的脱色率可以达到 90 % .经酶作用后 ,RB亮蓝在 4 30～ 70 0nm范围内的特征颜色吸收峰基本消失 .实验证明 ,在相同的条件下 ,漆酶粗酶对RB亮蓝有更好的脱色效果 .图 7表 1参 6