苋菜AmMYB2基因密码子偏好性与进化分析

为了解苋菜AmMYB2基因的密码子使用偏好性、与不同物种中调控色素相关的R2R3-MYB基因的同源关系及异源表达受体,利用Codon W与EMBOSS程序及Excel、SPSS、Origin等软件,分析苋菜与其他物种中调控色素代谢的R2R3-MYB基因的密码子使用偏好性,比较苋菜AmMYB2基因与模式生物的密码子使用频率.结果显示:苋菜AmMYB2基因中,所有密码子的GC、GC1、GC2、GC3含量均低于50%,偏好性较强的密码子有17个(RSCU 1),偏好性最强的有7个(RSCU 2),其中以A/T结尾的密码子有19个,表明苋菜AmMYB2基因的密码子偏好以A/T结尾,一些氨基酸对密码子的使用具有较强的偏好性;苋菜AmMYB2基因密码子的有效密码子数(Effective number of codons,ENC)值为49.63,苋菜AmMYB2基因的密码子在ENC绘图中的基因位点更接近期望曲线,说明在进化过程中苋菜AmMYB2基因的密码子偏好性受突变压力的影响较大;苋菜基因与甜菜色素代谢相关的R2R3-MYB基因的密码子使用偏好性参数相近,同源关系较近物种密码子使用偏好性具有相似性;从密码子使用频率上分析得出,酵母菌表达系统更适合苋菜AmMYB2基因的异源表达,模式植物拟南芥、烟草、番茄均可作为苋菜AmMYB2基因的遗传转化受体,同苋菜代谢途径相似的甜菜也可以作为苋菜AmMYB2基因的瞬时表达受体.本研究可为苋菜AmMYB2基因功能的进一步研究提供重要参考.(图5表2参31)     

3种木薯全基因组的密码子偏好性模式与变异来源比较

密码子偏好性研究有利于了解基因表达特征、探索遗传进化规律及为分子育种提供依据.综合运用Perl语言和Codon W1.4.2、SPSS23.0等软件,系统分析3种木薯基因组的编码基因序列,从而得出密码子使用特征并明确影响密码子使用的变异来源.结果显示,3种木薯基因组的密码子在使用模式上具有较高的相似性:总碱基组成在3种木薯中差异较小,都是A/T含量较高,而G/C含量较低,且均偏好使用A/T结尾;通过RSCU(同义密码子相对使用度)值比较分析发现,3种木薯有27个共同的偏好密码子,其中以A/T结尾的密码子达85%以上;RFSC(同义密码子相对使用频率)值显示出3种木薯具有14个相同的高频密码子;其基因的异源表达受体优先选择拟南芥、烟草和毛果杨;密码子偏好性主要受自然选择影响,同时也受到突变压力等其他因素的影响.本研究表明3种木薯基因组的密码子使用模式高度相似且主要受自然选择影响,结果可为将来研究木薯的进化规律和提高外源基因表达效率提供重要依据.(图5表4参40)     

橄榄查尔酮异构酶基因CHI的密码子偏好模式

黄酮类化合物是橄榄[Canarium album(Lour.)Raeusch]的重要活性成分,而查尔酮异构酶(Chalcone isomerase,CHI)是黄酮合成的关键酶类之一,了解橄榄查尔酮异构酶基因CHI的密码子偏好模式可为其功能和分子进化研究提供科学依据.采用Codon W和EMBOSS分析橄榄CHI的密码子偏好性参数,并通过有效密码子数(Effective number of codon,ENc)绘图、中性绘图和偏倚分析探讨单双子叶植物CHI密码子偏好性形成的可能因素,同时分别采用SPSS19.0和MEGA5.2基于密码子偏好性和序列相似性进行聚类分析.结果显示:橄榄CHI ENc值、G和C的含量(GC)以及密码子第3位上G和C含量(GC3s)分别为50.89、0.451和0.465,表明其密码子偏好性较弱,但倾向使用富含A和U,并以A或U结尾的密码子;单子叶植物CHI的密码子偏好性普遍高于双子叶植物,基于密码子偏好性和核酸序列相似性均能将单双子叶植物进行较准确的归类;密码子碱基成分和相关性分析发现,物种间CHI密码子偏好性受编码区长度的影响较小,而与碱基的组成密切相关;此外,橄榄CHI与模式生物拟南芥、烟草、大肠杆菌和酵母菌基因组均存在较大的密码子偏好性差异.本研究表明突变压力是单双子叶植物间CHI严格的密码子偏好规律形成的主要作用力,而橄榄CHI外源表达和遗传转化时需要根据宿主基因组偏好模式进行密码子优化和改造.     

川芎咖啡酸-O-甲基转移酶基因密码子偏好性与进化分析

咖啡酸-O-甲基转移酶(COMT)是苯丙烷类代谢途径中的一个关键酶,研究其密码子偏好性对开展该基因的异源表达与分子调控研究有重要指导意义.利用Codon W、EMBOSS、SPSS与Origin等在线服务器及软件,首先分析川芎等不同植物来源COMT基因的密码子偏好性,随后以川芎COMT为重点,比较其与大肠杆菌、酵母、拟南芥与烟草等模式生物的密码子使用频率.结果表明,单子叶植物COMT基因的密码子偏好性较强,而低等植物与双子叶植物COMT基因的密码子偏好性较弱.分析COMT基因密码子偏好性与核酸序列,发现亲缘关系较近的物种不仅具有较高的核酸序列相似度,并且具有相似的密码子偏好性,推测这种现象是由于密码子偏好性的形成主要受到自然选择的影响. COMT作为一个起源古老的基因,分析其密码子偏好性对了解植物进化关系有一定作用.川芎COMT体现出与其他双子叶植物相近的密码子偏好性,其GC含量与GC3s均小于50%,偏好以A/T编码,偏好性极强(RSCU 2)的密码子有7个,ENc为51.38,整体密码子偏好性较弱.与大肠杆菌相比较,酵母可能是其更好的外源表达系统.较之拟南芥,烟草更合适作为川芎COMT的遗传转化受体.本研究表明拟南芥、烟草都可作为Lc COMT遗传转化受体系统的候选;并且烟草COMT与Lc COMT在进化树上显示出较近的亲源关系,所以烟草可能是LCCOMT相对更好的遗传转化受体;结果可为COMT基因的遗传进化研究、川芎COMT的功能验证及转基因植物培育等奠定理论基础.(图4表2参33)     

籽粒苋苹果酸酶(NAD-ME)基因密码子偏好性分析

遗传密码子是生命信息的基本遗传单位,每种氨基酸对应1～6个同义密码子.特定物种在长期进化中形成了适应自身基因组环境的密码子使用偏性.运用CHIPS、CUSP和CodonW程序分析自主克隆的籽粒苋NAD-ME基因的密码子偏好性,并与马铃薯等7种植物的ME基因密码子偏好性进行比较,以期为该基因在作物遗传改良中选择合适的受体植物提供依据.结果表明,籽粒苋NAD-ME基因偏好于以A或T结尾的密码子,其它几种被比较作物的ME基因也有同样的趋势,但双子叶植物的偏好性更强.基于NAD-ME基因的密码子使用偏性的系统聚类分析表明,籽粒苋与马铃薯、拟南芥、葡萄、蓖麻、毛果杨等双子叶植物聚为1类,玉米和高粱这2个单子叶植物聚为1类,预示籽粒苋NAD-ME基因更适合导入马铃薯等双子叶植物.对籽粒苋NAD-ME基因的密码子偏好性与大肠杆菌和酵母的基因组密码子偏好性进行比较,发现均存在差异,与大肠杆菌的差异高于酵母,表明酵母表达系统要优于大肠杆菌表达系统.若要进一步提高籽粒苋NAD-ME基因在大肠杆菌或酵母中的表达水平,尚需对其密码子进行优化.     

两栖动物线粒体基因组tRNA基因重复、丢失及其影响

在脊椎动物线粒体基因组中,偶有tRNA基因重复或丢失事件发生,这些事件因与相应氨基酸转运密切关联而凸显重要.两栖类中,这些重复或丢失相对多样,可为相关研究提供良好素材.为了解这些事件对氨基酸对应的密码子使用偏好是否产生影响,本文引入统计方法,检测10种两栖类mtDNA蛋白编码基因相对的同义密码子使用度(RSCU),并特别设计将发生tRNA基因重复或丢失物种与其近缘群进行对比分析.结果显示,tRNA基因的重复对密码子使用偏好没有显著的影响,推测可能与突变积累的时限和mtDNA紧凑性有关.另外,tRNA基因丢失也未使相应氨基酸密码子使用偏好产生明显的改变.推测在两栖类中,"tRNA转入"和"tRNA反密码子摆动位点的超级摆动"可能是tRNA基因丢失的补偿方式.     

外来入侵物种的基因签名及其遗传多样性聚类分析

密码子的使用频率分布能够反映一定的生物特性,因而可作为一种基因签名。本文使用CGR方法来研究外来入侵物种不同组织序列的基因签名及遗传多样性聚类分析,首先得出了刺花莲子草(Alternanthera pungens),紫茎泽兰(Ageratina adenophora),水葫芦(Eichhornia crassipes),微甘菊(Mikania micrantha),土荆芥(Chenopodium ambrosioides),一枝黄花(Solidago canadensis)等6种外来入侵植物的31条序列核苷酸字串长k=1到k=6的情况,并选取k=3,即基因序列的密码子,作为生物特性的一个重要表达。并且构造序列间的CGR欧式距离,进而对外来入侵植物序列遗传多样性进行了聚类分析。通过对所获得的6种外来入侵植物的31条序列的基因签名,得出如下结果：CGR是一种简便且计算量小的方法,且基于CGR方法的基因签名,具有典型的生物特性;入侵植物的基因序列在密码子的使用上是非均衡的,且物种亲缘关系近的,则基因签名相似越高;而且基因签名也揭示出了密码子的第三位碱基偏好使用碱基T的现象,与一般物种密码子第三位碱基偏好G/C情况有强烈反差。此外,从获得的6个物种的31条序列聚类谱系图可以直观看出,入侵植物间存在着一定的亲缘关系,遗传多样性较丰富。由于我们所建立的基于CGR方法的基因签名,不仅能够反映植物特性和进化关系,而且能揭示序列中密码子和碱基的偏好使用情况,因而该方法有利于对外来入侵物种的遗传多样性分析、风险评估及预防控制等提供科学依据。     

短花针茅StbCRY1和StbCRY2基因克隆与表达差异分析

短花针茅（Stipa breviflora）是荒漠草原的优势物种,兼具优秀的饲用价值和稳固水土的重要作用,其生殖生长受外界环境的影响较大。探究野外短花针茅生长发育过程中的CRY1、CRY2蛋白对不同环境条件的响应关系,可以为进一步研究蓝光受体隐花色素在不利环境条件下短花针茅生长发育中的调控机制提供有用的信息。以短花针茅转录组数据为基础,利用RACE技术得到生物钟相关基因StbCRY1和StbCRY2 ORF,其编码区分别为2 695 bp和2 176 bp。二者编码酸性蛋白质,皆是亲水蛋白质。Stb CRY1蛋白具有Phr B结构域和Cry-C结构域,Stb CRY2蛋白具有PhrB结构域。进化树分析表明短花针茅CRY1蛋白与野生二粒小麦（Triticum dicoccoides）和普通小麦（Triticum aestivum）CRY1进化关系较为相近,短花针茅CRY2蛋白与大麦（Hordeum innermongolicum）CRY2蛋白亲缘关系相近。利用生物信息学工具预测蛋白质二级结构,两种蛋白质出现α螺旋、无规线团概率为40%左右,出现β转角、延伸链的概率较小。共聚焦定位分析表明...     

MeJA对苋菜悬浮细胞类黄酮和类胡萝卜素累积及其代谢相关基因表达的影响

茉莉酸甲酯(MeJA)对植物生长及次生代谢产物的合成具有重要的调控作用.为了解MeJA对苋菜细胞中类黄酮和类胡萝卜素合成的影响,以苋菜悬浮细胞为材料,检测不同浓度MeJA和添加时间处理对类黄酮和类胡萝卜素累积的影响,结合实时荧光定量PCR技术,分析类黄酮和类胡萝卜素合成相关基因表达与其累积的关系.结果显示,200μmol/L MeJA处理下,苋菜悬浮细胞干重、类黄酮和类胡萝卜素产量均达到最大,在悬浮细胞培养的第4天添加200μmol/L时类黄酮和类胡萝卜素的含量和产量达到最大;与对照(MeJA 0μmol/L)相比,不同浓度MeJA处理下,PAL、F3H、CHI、CHS基因表达量均极显著上调,与类黄酮含量具有正相关性,PDS、PSY和ZDS基因也极显著上调表达,与类胡萝卜素含量具有正相关性;随着MeJA添加时间的延迟,PAL、F3H、CHS和CHI基因的表达模式与类黄酮含量无明显相关性,PDS和PSY表达模式基本一致,且与类胡萝卜素含量的变化趋势保持一致,ZDS基因则出现下调表达.本研究表明MeJA浓度和添加时间对苋菜悬浮细胞中类黄酮和类胡萝卜合成起着重要调控作用,可为进一步探讨MeJA诱导苋菜悬浮细胞类黄酮和类胡萝卜素合成机制奠定基础.(图8表1参28)     

麦芽寡糖基海藻糖水解酶基因在巴斯德酵母中的表达及遗传稳定性

海藻糖是一种具有很多功能的非还原性二糖,在生物制品和食品等行业中具有较广泛的用途.对来自芝田硫化叶菌(Sulfolobus shibatae)B12海藻糖酶转化过程中的关键酶基因--麦芽寡糖基海藻糖水解酶(MTHase)基因进行了遗传密码子的人工改造,合成酵母偏爱密码子和修改基因遗传密码子中的A/T含量,然后将完整的MTHase基因克隆到酵母表达载体pPICZαA,筛选出重组载体并将其导入巴斯德酵母(Pichia pastoris)细胞进行重组表达以用于海藻糖的酶转化.最后获得了一株高效稳定表达MTHase的酵母菌株,分泌到表达培养基上清中的MTHase的酶活大于800U/mg(蛋白质),该重组菌株遗传稳定率达84%以上,为工业化酶法生产海藻糖奠定了一定基础.     

高赖氨酸蛋白基因在转基因生菜中的表达和遗传转化

以生菜(LactucasativaL.)为受体材料,将含有高赖氨酸蛋白基因的植物表达载体pLBI用农杆菌介导法进行遗传转化,获得47株转基因生菜植株.PCR和Southern-blotting检测证实目的片段在T0代的整合,RT-PCR检测表明目的基因的转录.T0代植株赖氨酸(Lys)含量的测定分析表明,赖氨酸有不同程度的提高,比对照提高最高的可达9.46%.T1代植株PCR检测证明,目的基因能够遗传.图5表1参25     

荧光假单胞菌高效广谱载体的构建及分析

为促进高GC含量基因在荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)中表达效果更加理想、操作更加简便,本研究首先采用不依赖基因序列和连接反应的克隆(Sequence and ligation independent cloning,SLIC)方法将载体pCIBhis上与复制相关的序列和标记基因片段构建成克隆载体pCIBS1.然后优化荧光假单胞菌转化方法,用电转化法将pCIBS1导入荧光假单胞菌BL915中,随后又将T7和tac基因启动子分别插入pCIBS1中,成功构建了表达载体pCIBS3和pCIBS2.研究发现载体pCIBS1在大肠杆菌和荧光假单胞菌中均较为稳定,并且将绿色荧光蛋白基因插入表达载体中,在大肠杆菌BL21(DE3)中获得表达,验证了表达载体功能.本研究构建的表达载体和建立的荧光假单胞菌BL915电转化方法,为高GC含量基因在荧光假单胞菌中的表达奠定了基础.     

十字花科蔬菜BcMF13同源基因的克隆及进化分析

在十字花科芸薹属的8个物种中扩增到与十字花科蔬菜花粉发育相关的一个重要基因BcMF13(GenBank登陆号:EF158459)的同源序列,获得8个同源序列的DNA序列全长602～607 bp,均含有一个内含子区,编码73个氨基酸,在内含子区内存在1个插入/缺失、5处颠换、4处转换.对8个同源基因的氨基酸比对发现该基因在十字花科物种内有很强的保守性.基于Kimura双参数距离,构建了BcMF13同源基因在十字花科中进化的NJ系统树,反映出南方大白菜与北方大白菜存在不同的演化过程.     

福州宦溪野生蕉CBF7的cDNA与启动子克隆及在不同温度下的表达特性

CBF(CRT/DRE-binding factor)在植物低温响应及抗寒性的形成中起着重要的作用.香蕉基因组中只包含有1个CBF7基因,以香蕉基因组序列为参考,采用同源克隆的方法,从福建宦溪野生蕉(Musa itinerans)叶片中克隆CBF7-1基因的c DNA全长序列及其启动子序列.生物信息学分析显示宦溪野生蕉的CBF7-1具有植物CBF家族的典型AP2结构域,物种间序列特异性强;启动子富含多种类型的顺式作用元件,并且具有Cp G岛.q PCR分析表明CBF7-1在28℃时表达量最高,随着温度降低表达量逐渐下降,但在0℃时反而又升高.这表明宦溪野生蕉的CBF7-1可能与低温胁迫、耐热性均相关.     

使用安捷伦7000A三重串联四极杆GC/MS/MS系统测定大气颗粒物中的硝基多环芳烃

采用毛细管GC结合安捷伦7000A三重串联四极杆GC/MS(G7010AA)系统的多反应监测(MRM)模式分析了大气颗粒物中的硝基多环芳烃(nitro-PAHs).传统硝基多环芳烃的分析方法是在样品前处理之后,使用单四极杆GC/MS的选择离子监测SIM模式或者多维GC/MS,但基于MS/MS检测模式超强的选择性,可直接分析大气颗粒物的粗提物.实际样品中的硝基多环芳烃可以检测到pg·μL-1的级别,相对应于大气样品中pg·m-3级的含量.     

茶树CSD1基因及其启动子克隆与低温胁迫下的表达

低温寒害严重影响茶树的生长发育状况及成品茶品质,Copper/zinc-superoxide dismutase(CSD)基因在植物抗胁迫响应中起着关键作用.为了解茶树CSD基因(CsCSD)响应低温胁迫的作用机制,以铁观音茶树叶片为供试材料,采用同源克隆结合RACE方法及染色体步移法,获得茶树CSD1基因的cDNA序列(GenBank登录号:KR078346)、gDNA序列及其启动子序列,并对其进行生物信息学分析,同时对低温胁迫处理下CsCSD1基因的表达模式也进行分析.结果显示,茶树CsCSD1基因cDNA全长860 bp,完整的开放阅读框(ORF)长度为459 bp,共编码152个氨基酸;gDNA基因结构分析发现CsCSD1基因由6个外显子和5个内含子构成;CpG岛预测发现启动子区域内存在1个CpG岛,CpG长度为219bp,GC含量为50.3%;CsCSD1启动子上还存在大量的顺式作用元件,包括光响应元件、激素响应元件、胁迫响应元件和其他响应元件;在低温胁迫下CsCSD1基因的表达模式显示,在低温胁迫前期,CsCSD1基因表达上调;随后CsCSD1基因的表达量不断下降.本研究表明,CsCSD1基因能够响应低温胁迫并在胁迫的不同时期发挥不同的作用,推测与低温胁迫密切相关.     

无指盘臭蛙皮肤抗菌肽Odorgrin A真核表达载体的构建与转化

根据无指盘臭蛙(Odorrana grahami)皮肤抗菌肽Odorgrin A的氨基酸序列,合成了以酵母偏爱密码子编码的Odorgrin A基因片段.目的片段从合成质粒上用XhoΙ和EcoRΙ双酶切下后,与经同样限制酶酶切的pPIC9K载体连接而成表达载体pPIC9K-Odo A.PCR扩增、酶切及测序检测的结果表明表达载体构建成功.线性化的pPIC9K-OdoA经电击法转化毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115宿主菌,营养缺陷型筛选、遗传霉素抗性筛选、PCR扩增和测序检测的结果表明,表达载体pPIC9K-Odo A成功地转化并整合入酵母基因组.用甲醇对具遗传霉素G418高抗性的Odorgrin A重组酵母菌进行诱导表达,取酵母发酵液上清经SDS-PAGE电泳检测,结果初步表明,整合进酵母基因组的抗菌肽Odorgrin A基因已获得分泌表达,表达产物相对分子质量为3×103～4×103,与理论值相近.图10参17     

纳米二氧化钛暴露人胚肺细胞差异表达基因分析

为探讨纳米二氧化钛(Nano-TiO2)颗粒对人胚肺(HPF)细胞基因表达和基因功能的影响,使用粒径10nmTiO2暴露体外培养的人胚肺细胞24h,提取RNA,应用基因芯片方法,寻找差异表达基因,并对差异基因进行基因本体(GeneOntology,GO)分类.结果表明,纳米TiO2暴露人胚肺细胞,导致514条肺中表达的基因发生差异表达,基因分类显示400条基因涉及生物学过程;415条基因涉及分子学功能;391条基因涉及细胞构成.纳米TiO2作为外界刺激物质,与细胞膜上的受体结合,影响钙、钾离子通道,上调细胞免疫和炎症反应相关的细胞因子TNF、IL1B、IL1A等基因表达.     

过量表达水稻OsP5CS1和OsP5CS2基因提高烟草脯氨酸的生物合成及其非生物胁迫抗性(英文)

为了解水稻OsP5CS基因在非生物胁迫中的生物学功能及其生理生化作用,将P5CS基因的两个水稻同源基因OsP5CS1和OsP5CS2同时构建到植物表达载体pHB上,并通过农杆菌介导的遗传转化法转入烟草,经过鉴定转基因植株,成功获得9个独立的转基因阳性植株.选取野生型和其中的3个转基因植株后代,分别测定它们在不同的胁迫条件下幼苗的根长、鲜重以及脯氨酸、过氧化氢和丙二醛的含量.结果显示:在200 mmol/L NaCl、300 mmol/L甘露醇(Mannitol)、300μmol/L CuSO4胁迫条件下转基因植株的平均根长、平均鲜重、平均脯氨酸、平均过氧化氢含量和平均丙二醛的含量分别为野生型的1.3-2.3、1.9-3.9、1.8-3.2、51%-61%和62%-76%.因此在烟草中过表达OsP5CS基因,可以显著增加脯氨酸含量,降低烟草在非生物胁迫条件下的氧化损伤.图6参31     

重组钝顶节旋藻藻蓝蛋白基因在聚球藻中的表达

藻蓝蛋白(Phycocyanin)具有抗氧化、消炎、抗癌、增强免疫等生理活性和荧光特性.本研究从钝顶节旋藻(Arthrospira platensis)中克隆藻蓝蛋白基因,构建重组藻蓝蛋白并在聚球藻7942(Synechococcus sp.PCC 7942)中表达.利用PCR技术克隆钝顶节旋藻藻蓝蛋白α亚基(cpc A)与β亚基(cpc B)基因,在cpc A的5’端及3’端加入编码6×His标签基因,克隆Hiscpc A基因,并构建同源重组表达载体p U BCA3D-1.通过自然转化法将p UBCA3D-1转入聚球藻中,经筛选鉴定获得了转基因藻株.PCR验证结果表明,目的基因整合到聚球藻基因组中的概率为86.6%.转基因聚球藻在无抗生素筛选条件下连续培养2个月,仍能稳定表达重组Cpc A.以上结果表明,重组钝顶节旋藻藻蓝蛋白在聚球藻中稳定表达;研究结果为节旋藻cpc A基因改造、重组Cpc A进一步分离纯化以及重组藻蓝蛋白的生产奠定了基础.