不同配方培养料生产双孢蘑菇过程中主要木质纤维素降解酶及物料组分的变化

为探讨双孢蘑菇生产过程木质纤维素的利用情况,以麦草秸秆、玉米秸秆和杂草秸秆为主料的3种不同配方的培养料为研究材料,分别测定各配方培养料不同时期主要胞外木质纤维素降解酶活性和木质纤维素组分(纤维素、半纤维素和木质素)的相对含量,并统计各配方产量.结果显示,麦草配方(FWS)的纤维素酶总活性和木聚糖酶活性不断升高,出菇期达到稳定;玉米秸秆配方和杂草配方堆肥期的纤维素酶总活性保持在1 U/g左右,发菌期大幅升高,出菇期先稳定后下降,木聚糖酶活性始终保持在7.97-23.85 U/g之间;3个配方的漆酶活性在堆肥期未检测到,发菌期升至最高,出菇期快速降低.3个配方堆肥期纤维素和半纤维素的相对含量明显下降,木质素相对含量则几乎不变.发菌及出菇期木质素与半纤维素的相对含量较纤维素的下降明显.3个配方双孢蘑菇的产量关系为麦草配方(30.00 kg/m~2)玉米秸秆配方(17.21 kg/m~2)杂草配方(16.67 kg/m~2).本研究表明堆肥期主要为堆肥微生物及物理化学作用降解纤维素和半纤维素,发菌期则主要是双孢蘑菇菌丝利用木质素;从播种至三潮菇清床,双孢蘑菇菌丝主要利用木质素和半纤维素;本研究中麦草配方是栽培双孢蘑菇的最佳培养料,而玉米秸秆配方和杂草配方有待进一步优化.     

高含量漆酶食用菌菌渣的筛选及其染料脱色作用

食用菌菌渣(Spent mushroom substrate,SMS)指食用菌出菇后的培养基废弃物,富含菌体蛋白、生物酶、多糖等营养物质,是潜在的生物质资源,用于肥料、饲料、生物修复等领域.我国是全球第一大食用菌生产国,大量菌渣资源一直没有得到科学有效地利用,并造成环境污染.以工厂化、实验室和农业栽培的杏鲍菇、平菇等9种常见食用菌菌渣为材料,进行高产漆酶菌渣筛选,并进一步利用高活性菌渣,对孔雀石绿、活性艳蓝、甲基橙、活性红和活性黑5种染料进行脱色脱毒研究.结果显示,新鲜工厂化杏鲍菇菌渣漆酶活性为7.55×104 U/g.其不同高度菌渣柱对染料脱色的结果显示,15 cm高菌渣脱色效果最佳,对5种染料的脱色率分别为100%、98.60%、72.82%、61.97%和43.73%.全波长光谱扫描显示,孔雀石绿、活性艳蓝经处理后流出液的染料最大光吸收峰显著降低甚至消失.进一步利用其菌渣漆酶粗提物进行染料脱色研究,30℃孵育24 h脱色率分别为81.24%、49.43%、37.62%、26.34%和13.54%.以大肠杆菌和金黄色葡萄球菌为靶标,对酶促染料降解产物进行了毒性研究,结果显示产物毒性均低于未处理染料.本研究表明工厂化杏鲍菇菌渣具有高漆酶活性,能用于孔雀石绿、活性艳蓝等染料废水的脱色、脱毒,具有重要经济和生态价值.(图4表4参43)     

农业秸秆在杏鲍菇生产中的应用

利用花生秸、玉米秸、甘薯藤配以棉籽壳、麸皮作为杏鲍菇栽培基质,以w(棉籽壳)=80%、w(麸皮)=20%作为对照配方,研究了 6种秸杆配方的培养料对杏鲍菇生长发育和产量的影响.结果表明:不同配方培养料对杏鲍菇的菌丝生长速度和生长势、生产周期、产量和生物学效率均有较大影响;玉米秸、花生秸是杏鲍菇优良的营养基质,其中,以玉米秸粉和棉籽壳为主料的培养料更适合杏鲍菇生长,其菌丝生长速度快,生长势最强,出菇较快,且产量最高,生物学效率町达60%以上.综合出菇后菌渣作为动物饲料原料的适口性来考虑,以w(棉籽壳):30%、w(玉米秸粉)=50%、w(麸皮)=20%的配方为最佳.     

利用杂草培养料栽培双孢蘑菇的可行性

充分利用当地杂草资源生产双孢蘑菇对于降低生产成本和环境保护具有重要意义.在密云库区杂草多样性调查和配方工艺调整的基础上,对3个批次库区杂草的双孢蘑菇(Agaricus bisporus)生产进行全程监测,包括堆肥期和出菇期的培养料理化性质、物质变化、相关降解酶活性和培养料发酵过程中细菌菌群变化,统计产量等.结果显示,库区杂草种类繁多,株高茎粗,茎杆坚硬紧实,打捆后的杂草饱和吸水量为76.78%.堆肥期培养料的含水量、含碳量和碳氮比逐渐下降,出菇期变化不大;培养料的含氮量在培养料一次发酵结束(PI)均有下降的现象,二次发酵结束(PII)含氮量升高.培养料二次发酵过程中纤维素和半纤维素的利用率均介于40%-60%之间;木质素利用率介于20%-30%.在双孢蘑菇菌丝生长和出菇过程中木质素的利用率为16%-21%.培养料纤维素和半纤维素的含量变化与相关降解酶变化情况相一致.堆肥期样品Illumina测序得到432 595条有效序列,序列平均长度为441 bp;分类分析表明,堆肥时期优势菌群为拟杆菌门(Bacteroidetes)的普氏菌属(Prevotella),厚壁菌门(Firmicutes)的芽孢杆菌属(Bacillus),栖热菌门(Deinococcus-Thermus)的Thermus属、Truepera属、Caldicoprobacter属(一种木聚糖降解菌),放线菌门(Actinobacteria)的热多孢菌属(Thermopolyspora),变形菌门(Proteobacteria)的假黄单胞菌属(Pseudoxanthomonas). 3个批次产量在17.1-19.7 kg/m2范围.本研究表明库区杂草取代麦草进行双孢蘑菇工厂化生产是可行的,结果可为其合理利用和工艺改进提供理论依据.     

不同配方双孢蘑菇培养料的细菌群落结构和理化性状

为充分利用蘑菇产地的农业废弃物资源,在工厂化生产模式下探索以稻草、玉米秸、杏鲍菇菇渣代替部分麦草的双孢蘑菇(Agaricus bisporus)培养料配方的可行性.以麦草配方为对照设计配方,分别在堆料期和出菇期取培养料样品,提取总DNA,采用PCR-DGGE技术分析细菌群落结构,同时测定理化性状和产量,利用SPASS软件进行结果分析.结果显示:堆料期回收优势条带59条(KR089383-KR089441),分为5个门22个属;出菇期回收37条(KR089346-KR089382),分为5个门13个属;变形菌门(Proteobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)和放线菌门(Actinobacteria)的多个种属为各配方共有的优势菌;与传统麦草配方相比,添加玉米秸秆的配方在堆肥初期细菌多样性较高,但以后持续下降;各配方堆肥期和出菇期细菌群落明显不同.不同配方堆肥期和出菇期培养料含氮量、灰分、电导率(EC)均呈上升趋势,含碳量、碳氮比、含水量以及p H均呈下降趋势,一潮菇后添加菇渣和玉米秸秆的配方含水量急剧下降.添加稻草、菇渣配方的产量稍低于对照纯麦草,添加玉米秸秆的配方产量最低.因此,双孢蘑菇培养料细菌群落和理化特性因原料配方不同表现出一定的差异;综合分析,用稻草和菇渣代替部分麦草的配方是可行的,而添加玉米秸时还需要进一步改进配方或工艺.     

蚁巢伞对木质纤维素的降解作用

白蚁-细菌-真菌共生系统对自然界生物质降解具有重要作用,研究蚁巢伞(Termitomyces)对木质纤维素的降解能力有助于揭示其共生关系,为蚁巢伞应用于生物质能源开发提供理论依据.利用黑翅土白蚁(Odontotermes formosanus)菌圃(OFC)及其固体培养蚁巢伞(TA)、液体培养蚁巢伞(TL)分别对未经预处理和经密褐褶孔菌(Gloeophyllum trabeum)预处理材料进行降解试验,探究蚁巢伞的木质纤维素降解能力.结果显示,未经预处理时,处理90 d后,OFC对纤维素、半纤维素和木质素的降解率分别为15.22%、29.34%和6.01%;处理120 d后,TA对纤维素、半纤维素和木质素的降解率分别为20.98%、31.89%和11.68%,TL对纤维素、半纤维素和木质素的降解率分别为14.39%、24.62%和5.05%.经过预处理时,处理120d后,OFC对纤维素、半纤维素和木质素的降解率分别为37.09%、42.20%和24.95%,TA对纤维素、半纤维素和木质素的降解率分别为34.77%、38.29%和29.74%,TL对纤维素、半纤维素和木质素的降解率分别为30.57%、30.47%和24.36%. 3种状态蚁巢伞对经预处理材料木质纤维素降解率均高于未经预处理材料.本研究表明,蚁巢伞对木质纤维素具有一定的降解能力,尤其是蚁巢伞对木质素的降解说明其可以打破木质素屏障,证实了利用蚁巢伞的木质纤维素降解能力来实现生物质能源化的潜力,结果可为蚁巢伞的人工栽培提供数据和参考.(图4表2参39)     

基于木质素生物降解的堆肥化接种剂开发

选取由农林废物堆肥中筛选出的木质素降解优势土著微生物枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、铜绿假单孢菌(Pseudomonas aeruginosa)、黑曲霉(Aspergillus niger)、简青霉(Penicillium simplicissim)、栗褐链霉菌(Streptomyces badius),依据PLFA-PLS定量分析所得堆肥化2次发酵期有效的木质素降解微生物群落组成比例混合接种至稻草基质发酵瓶中,做1组L9(34)正交试验以优化混合比例,期望开发1种基于木质素降解的高效堆肥化接种剂.试验结果表明:混合菌剂具有较强的木质素降解能力,其对木质素的降解是木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶、漆酶、纤维素酶和半纤维素酶共同作用的结果;当按照个数比细菌∶放线菌∶真菌为85∶5∶ 10,枯草芽孢杆菌∶铜绿假单孢菌为55∶25,黑曲霉∶简青霉为2∶1配比时,木质素、纤维素、半纤维素降解率最高,分别达到22.13%,48.97%和55.93%;在不灭菌前提下,按此配比接入菌剂,其木质素、纤维素、半纤维素降解率分别比不接菌剂发酵稻草提高19.16,38.25和46.30百分点.     

不同碳源条件下草菇内切型纤维素酶基因（eg1）转录表达的分析

利用Northernblot方法分析了不同碳源条件下草菇切型纤维素酶基因(eg1)的表达.结果发现,在含有纤维素的液体培养基中生长10d,eg1在草菇菌丝中有高效表达;纤维二糖、α-乳糖、β-乳糖,也能诱导eg1的表达,但和纤维素相比,eg1的表达量相对较低,并且它们的诱导效应在加入这类糖12h后迅速减弱;槐糖和龙胆二糖的诱导作用非常弱.在天然稻草为基质的固体栽培料生长时,草菇eg1的表达和草菇菌丝生长与出菇相对应,在菌丝生长期(d8)可见eg1的表达,d12时菌丝已长满,表达减弱,在出菇及菇体的分化及增大期,eg1的表达量逐渐增强,在成熟期达到最高水平;表明在草菇菇体发育中需要更多碳源及能源的补充,eg1在这方面起着非常重要的作用.图4参14     

不同碳源条件下草菇内切型纤维素酶基因(egl)转录表达的分析

利用Northern blot方法分析了不同碳源条件下草菇內切型纤维素酶基因(eg1)的表达.结果发现,在含有纤维素的液体培养基中生长10 d,eg1在草菇菌丝中有高效表达;纤维二糖、α-乳糖、β-乳糖,也能诱导eg1的表达,但和纤维素相比,eg1的表达量相对较低,并且它们的诱导效应在加入这类糖12 h后迅速减弱;槐糖和龙胆二糖的诱导作用非常弱.在天然稻草为基质的固体栽培料生长时,草菇eg1的表达和草菇菌丝生长与出菇相对应,在菌丝生长期(d 8)可见eg1的表达,d 12时菌丝已长满,表达减弱,在出菇及菇体的分化及增大期,eg1的表达量逐渐增强,在成熟期达到最高水平;表明在草菇菇体发育中需要更多碳源及能源的补充,eg1在这方面起着非常重要的作用. 图4 参14     

一种田头菇属真菌新记录种的生物学与产酶特性

田头菇是重要的经济食用菌类型,目前我国报道种仅有10个.为驯化栽培和开发利用新的田头菇属食用菌种质资源,以采集自北京延庆的我国新记录种菌核田头菇(Agrocybe tuberosa)GSM-12菌株为材料,研究了菌丝生长的最适碳源、氮源、C/N比、最适温度、最适pH值等生物学特性,以及菌丝体液体发酵产漆酶、蛋白酶、植酸酶和核糖核酸酶的特性.结果显示,菌丝生长的最适碳源为蔗糖,最适氮源为黄豆粉,最适C/N比为20/1-30/1,最适温度为24℃,最适pH为7.0.产酶特性研究显示,GSM-12菌株具有漆酶、植酸酶和核糖核酸酶活性,菌丝体中酶活较高,分别为(77.28±10.44)U/mg、(61.01±2.71)U/mg和(21.13±0.60)U/mg.本研究表明菌株GSM-12可以利用常规营养元素实现营养生长,同时菌丝体液体发酵具有良好的产酶特性.     

木质纤维素生产燃料乙醇的关键技术研究现状

木质纤维素是自然界广泛存在且廉价的可再生资源.其主要成分纤维索、半纤维素是潜在的燃料乙醇生产原料.虽然由木质纤维素生产燃料乙醇的技术路线已具可行性,但存在着具体工艺环节复杂、生产能耗高等局限,严重阻碍了其规模化生产.目前纤维素燃料乙醇生产主要围绕预处理、酶解、发酵三大关键步骤进行技术攻关,其中预处理的能耗和效率、发酵过程的五碳糖利用等问题成为该工艺的重要制约因素.本文在综述国内外纤维素乙醇生产关键步骤的基础上,着重分析了各种物理、化学和生物预处理的优缺点以及新兴的预处理思路,归纳了各类纤维素乙醇生产菌的特点,包括耐高温和五碳糖的利用,并介绍了当前主要的发酵方式和优化措施,以期为木质纤维素生产乙醇提供新的研究思路.表5参86     

细胞表面展示木聚糖酶对纤维素酶水解底物的协同促进作用

为了解木质纤维素水解过程中木聚糖酶作为辅助酶对纤维素酶的协同促进作用,采用实验室保存的单展示3种纤维素酶(内切葡聚糖酶EGII、外切葡聚糖酶CBHII和β-葡糖苷酶BGLI)和2种木聚糖酶(β-D-1,4内切木聚糖酶Xyn II和β-D-1,4外切木聚糖酶Xyl A)的酿酒酵母功能菌群,以蒸汽爆破玉米秸秆为底物进行乙醇发酵实验(SSF).结果显示,以蒸汽爆破玉米秸秆为底物时,加入纤维素酶和木聚糖酶共发酵96 h的最高乙醇浓度达到0.695 g/L,乙醇产率为0.254 g/g,相当于理论值的49.8%,纤维素酶与木聚糖酶之间的协同因子(DS)最高达到1.16(始终大于1).本研究表明在细胞表面展示体系中适量添加木聚糖酶对纤维素酶水解底物具有较明显的促进作用,为直接以木质纤维素为原料制取纤维素乙醇提供了一定的可行性依据,可通过调节单展示酵母细胞在菌群间的动态比例实现对酶协同作用的优化调控.     

一株产耐热纤维素酶菌株的筛选及酶学性质

采用纤维素刚果红平板法从大田蘑菇种植场建堆的稻草样中分离得到了1株能产具有较好温度耐受性和pH稳定性的纤维素酶的放线菌DY3.综合形态、生理生化特征以及16S rDNA序列分析,将其初步鉴定为嗜热裂孢菌(Thermobifida fusca).对该菌所产纤维素酶的性质研究表明:最适催化温度为65℃,在70℃保温60 min后仍有75%以上的活力;最适催化pH为7.5,在pH 5.5～10.0之间该酶的稳定性较好,pH 10.0的条件下仍有80%的活力;最适作用底物是羧甲基纤维素钠.研究可为木质纤维素的生物预处理提供一定参考价值.     

微生物菌剂堆肥中草药渣中试研究北大核心CSCD

木质纤维素降解是中草药渣堆肥的主要难点.在前期小试的基础上,接种纤维素降解菌剂,将1 t新鲜药渣直接进行好氧堆肥.腐熟度指标T值和种子发芽指数(GI)显示,堆肥19 d左右就已经腐熟.堆肥过程中接种组(JZ)和对照组(CK)的纤维素平均降解速率分别为0.73 kg/d和0.64 kg/d,JZ比CK纤维素降解总量提高了13.39%,木质素降解量提高118.18%.第30天时,堆肥的含水率、p H、总养分、重金属等指标都达到有机肥料标准(NY 525-2012).接种菌剂提高了堆肥温度,加速了水分散失,促进了纤维素和木质的转化,有利于堆肥腐熟和提高肥料品质.因此,在中试规模上堆肥中草药渣生产有机肥是可行的.     

三江平原小叶章湿地土壤酶活性的季节动态

选取三江平原小叶章（Calamagrostis angustifolia）沼泽湿地为研究对象,于5—9月采集0～20cm土壤样品,分析了小叶章湿地土壤酶活性的季节动态变化,并探讨了其与土壤有机碳和全氮含量的关系。结果表明：小叶章湿地土壤脲酶、蔗糖酶、淀粉酶、纤维素酶、酸性磷酸酶、过氧化氢酶活性具有明显的季节变化特点,变异系数分别为13.1%、7.9%、13.6%、9.8%、5.0%、27.0%。土壤脲酶、蔗糖酶、酸性磷酸酶、过氧化氢酶、纤维素酶活性具有相似的动态规律,均在6月份出现一个波峰值,但最大值出现的月份不同,脲酶、蔗糖酶、纤维素酶在9月份时的酶活性最高,而酸性磷酸酶和过氧化氢酶在6月份时酶活性最高。淀粉酶活性动态规律表现为5—7月酶活性降低,而后酶活性升高,9月份酶活性最高,此时淀粉酶的水解能力最大。并且,随着季节变化,小叶章湿地土壤脲酶、蔗糖酶、纤维素酶活性与有机碳含量显著正相关（p〈0.05）,淀粉酶、酸性磷酸酶活性与土壤全氮含量显著正相关（p〈0.05）。     

秸秆污泥堆肥产纤维素酶细菌的筛选及产酶条件优化

从添加秸秆进行堆肥处理的污泥中采集样品,通过富集培养和刚果红平板染色法筛选分离出具有纤维素降解能力的细菌,再通过酶活力测定从中分离筛选出1株相对高活性的产纤维素酶细菌CI;通过基于16S rRNA基因序列的系统发育分析,初步确定该菌株为Devosia sp..利用单因素试验对目的菌株C1进行产纤维素酶发酵条件优化,结果表明菌株C1产纤维素酶的最佳发酵时间、培养温度、摇床转速以及最适初始pH值分别为60 h、30℃、130 r·min^-1和7.2～7.5,且在该条件下其滤纸酶（FPase）和羧甲基纤维素酶（CMCase）活力分别达23.10和54.97 U·mL^-1.     

发酵木糖产乙醇酵母菌的选育及其发酵特性

为了提高木质纤维素水解产物中戊糖的利用率,采用划线分离法、TTC(2,3,5-氯代三苯基四氮唑)法从多年生乔木下方土壤及林中朽木中筛选出4株能利用木糖产乙醇的酵母菌。其中1株产乙醇能力较佳,其发酵条件为150 r/m in、30℃、接种量12%、初始pH值6.0时,乙醇产量达4.88g/L,木糖转化率达理论值的24.3%。经初步鉴定,该菌为假单丝酵母属(Cand ida)。研究还表明,该菌株在pH 6.5,温度40℃仍能很好地发酵木糖产乙醇。     

光质对刺芹侧耳原基发生期分化及生理效应的影响

为探索光质对刺芹侧耳原基发生的影响,将长满菌丝体的菌包进行不同光质(红光、黄光、绿光、蓝光、白光、黑暗)处理,观察记录原基分化及子实体生长状况,并测定原基分化过程中的胞外酶活性和海藻糖含量.结果显示:不同光质条件下原基发生时间略有差异,菇蕾分化差异明显;与工厂化生产常用的白光照射条件相比,绿光处理组中子实体的农艺性状更优,菌柄直径和长度均加长,菌盖直径相应变大,但生物学效率差异不显著;不同光质处理对羧甲基纤维素酶、半纤维素酶活性的影响不够显著,对淀粉酶的影响较大.原基分化期红光、绿光、白光、黑暗4个处理组中的海藻糖含量均呈现下降趋势;黄光与蓝光处理组中该指标的变化相似,在原基形成时出现一个极大值,具体缘由有待进一步探究.本研究表明绿光可以作为刺芹侧耳工厂化生产的首选光质.(图6表3参20)     

纤维素酶对干玉米秸秆/白菜废弃物混贮品质的影响及细菌群落解析

为实现干秸秆的跨季节保质贮存,并改善其湿法贮存品质,研究纤维素酶添加量对干玉米秸秆(DMS)与白菜废弃物(CW)混贮发酵品质的影响,解析贮存过程中细菌菌群的动态演替规律.设置对照组(ME,无酶添加)、低剂量组(CA,添加量0.1%)和高剂量组(CB,添加量0.3%),18±1℃恒温密闭贮存170 d,间隔一定时间分析有机组分含量和发酵品质,并利用Miseq高通量测序技术研究细菌多样性的动态变化.结果表明,与ME组相比,CA组和CB组在贮存170 d期间的可溶性碳水化合物含量显著升高,酸性洗涤纤维、中性洗涤纤维、纤维素、综纤维素含量及p H值均显著下降;30-60 d期间CA组和CB组的氨氮/总氮值显著下降,90 d后有升高趋势.贮存170 d期间CA组和CB组中乳酸含量显著增加,乳酸/乙酸比值和乳酸/总有机酸比值得到优化,提高了乳酸发酵程度,改善了发酵品质.细菌群落分析显示,DMS与CW两种废弃物原料有乳酸菌互补性,有利于混贮发酵反应快速启动;加入纤维素酶后的CA组和CB组中门水平优势菌Firmicutes和Proteobacteria及属水平优势菌Paralactobacillus和Lactobacillus相对丰度提高,Enterobacter等腐败细菌于130 d时消失,有益乳酸菌的总丰度始终保持50%以上(除90d的CA组).总之,干玉米秸秆和白菜废弃物密闭混贮能确保干秸秆贮存近半年不变质,添加纤维素酶效果更佳,结合酶成本等因素,生产实践中推荐添加量为0.1%(原料鲜重的0.1%).     

二年残孔菌的培养条件优化及其液体发酵产物的抗氧化及漆酶活性

二年残孔菌(Abortiporus biennis)是一种具有抗氧化、抗肿瘤功效的药用白腐真菌,可降解木质素、造成木材白色腐朽.以分离自江苏无锡的二年残孔菌WX-02菌株为材料,开展菌丝最适培养条件、液体发酵产物抗氧化活性及Cu2+诱导产漆酶活性研究.基于单因子试验的最适生长条件结果表明,葡萄糖是WX-02菌株菌丝体生长的最适碳源,牛肉膏和黄豆粉为最适氮源,C/N比为40/1时长势最佳,玉米粉和VC为最适生长因子,而菌丝生长最适pH和温度分别为7.0和32℃10%(V/V)接种量、28℃、150 r/min培养72 h条件下,PD培养基发酵液的总抗氧化活性为2.76±0.31mmol/L(FeSO4)和0.40±0.01 mmol/L(Trolox),DPPH自由基清除率为100.00%±0.00%,总SOD活力为15.75±0.25 U/mL;最适培养条件液体培养基发酵液的总抗氧化活性为0.20±0.03mmol/L(FeSO4)和0.16±0.01 mmol/L(Trolox),DPPH自由基清除率为59.06%±0.61%,总SOD活力为15.65±0.62 U/mL. 0.25 mmol/L Cu2+对胞外漆酶诱导效果最佳,PD培养基、0.25 mmol/L Cu2+、28℃、150 r/min培养96 h,胞外漆酶活性最高,为(1.82±0.02)×105 U/mL,是对照组的1.72倍.本研究表明WX-02菌株具有良好的抗氧化和产漆酶活性,具有药用和环境治理开发应用潜能.(图4表4参34)