应用荧光原位杂交方法检测亚历山大藻

采用PCR方法对三株亚历山大藻核糖体DNA 大亚基部分序列和ITS区序列进行了特异性扩增和序列测定.ITS区测序及BLAST比对结果显示,三株藻类分别为塔玛亚历山大藻(Alexandrium tamarense),链状亚历山大藻(A. catenella)和微小亚历山大藻(A. minimum).在此基础上,针对中国沿海分布的有毒亚历山大藻,根据其核糖体DNA大亚基(LSU rDNA)序列信息,设计了特异性的荧光标记探针,建立了基于荧光原位杂交技术(FISH)上的有毒亚历山大藻检测方法.结果表明,探针Alexp1较理想地标记选定的目标藻--塔玛亚历山大藻(YA 藻株),经探针标记的藻细胞在荧光显微镜下可以明显区分于其他非目标藻.     

应用荧光原位杂交方法检测中国沿海塔玛/链状亚历山大藻复合种(亚洲温带基因型)

近年来,有害赤潮于中国沿海频繁发生,对沿海居民身体健康、水产养殖和自然生态形成了潜在的威胁.由于部分有毒赤潮藻在很低的密度下就有可能导致严重的危害,但传统的采样和分析方法无法对这类有毒赤潮进行有效的检测,因而急需发展准确、高效的检测新方法.根据对中国沿海分离的塔玛/链状亚历山大藻(亚洲温带基因型)核糖体大亚基DNA(LSU rDNA)序列信息的分析,设计了两条特异性的荧光标记探针,并建立了针对中国沿海塔玛/链状亚历山大藻复合种(亚洲温带基因型)的荧光原位杂交检测方法室内模拟实验显示两条探针都能够特异性地标记中国沿海塔玛/链状亚历山大藻(亚洲温带基因型),但标记效果有一定差异,探针SPEC-PROBE2标记效果远好于探针SPEC-PROBE1.经过标记的藻细胞可以通过荧光显微镜和流式细胞仪区分.中国沿海塔玛/链状亚历山大藻荧光原位杂交检测方法的建立将有助于提高海水样品中亚历山大藻监测的准确性和工作效率.     

孔石莼水溶性抽提液抑制3种海洋赤潮藻的生长

研究了孔石莼水溶性抽提液对3种赤潮藻(赤潮异弯藻、中肋骨条藻和塔玛亚历山大藻)生长的影响.在实验的前4d内,孔石莼水溶性抽提液(0 25～2 0g·L-1)对各赤潮藻种的生长皆表现出明显的抑制效应,最大抑制效应表现在接种后的第2～3d.各藻种生长受抑制的量随孔石莼水溶性抽提液浓度的增加而增加,当孔石莼水溶性抽提液的浓度达2 0g·L-1时,赤潮异弯藻和中肋骨条藻被完全致死,塔玛亚历山大藻的生长受到强烈抑制.实验后期(5d后),低浓度处理组(0 25～1 0g·L-1)的藻种加速生长,表现为促进效应.经高温处理后的孔石莼水溶性抽提液对赤潮异弯藻和中肋骨条藻的抑制效应完全消失,对塔玛亚历山大藻的抑制效应明显减弱.     

应用qPCR方法检测中国近海塔玛亚历山大藻复合种的研究

亚历山大藻属的部分藻种(Alexandrium spp.)能够产生麻痹性贝毒毒素(PST),是重要的有害藻华(HAB)原因种.由于亚历山大藻属中的有毒和无毒藻种形态相似,且海水中亚历山大藻的细胞密度通常很低,因此,高灵敏度、高特异性的分子生物学方法在亚历山大藻检测方面具有重要的应用前景.塔玛亚历山大藻和链状亚历山大藻是中国近海主要的有毒亚历山大藻藻种,大多属于塔玛亚历山大藻复合种第四类核糖体型(GroupⅣ,以往称为“亚洲温带核糖体型”).因此,本研究尝试将实时荧光定量PCR(qPCR)方法用于我国近海塔玛亚历山大藻复合种(GroupⅣ)的快速检测,并对方法的特异性和灵敏度进行了检验.研究表明,所建立的qPCR方法能够特异性地检测我国近海不同海域分离的塔玛亚历山大藻复合种(GroupⅣ),方法具有良好的线性响应关系和较高的灵敏度,最低可检出5个藻细胞,具有良好的应用前景.然而,实验也发现,自我国近海分离的塔玛亚历山大藻复合种的不同藻株之间,以及处于不同生长阶段的藻细胞之间,qPCR检测结果存在显著差异,反映了目标藻核糖体RNA基因拷贝数的差异和变化对qPCR检测结果的影响.因此,建议在将qPCR方法用于不同海域亚历山大藻样品检测时,应采用该海域分离的藻株专门构建标准工作曲线,以减小定量分析误差.     

溶藻细菌BS03分离、鉴定及其对塔玛亚历山大藻生长的影响

从福建漳江口红树林区筛选出一株对产贝毒赤潮原因藻——塔玛亚历山大藻(Alexandrium tamatense)具有强溶藻能力的细菌,命名为BS03,通过生理生化及16S rDNA序列分析对该菌株进行鉴定,并探讨了菌株BS03对塔玛亚历山大藻的溶藻特性和溶藻代谢产物的初步性质.结果发现,菌株BS03属于微泡菌属(Microbulbifer sp.)相似性达99％;对塔玛亚历山大藻的杀藻效果具有一定浓度效应,在一定浓度范围内处理浓度越高,溶藻效果越好;菌株BS03对处于不同生长时期的塔玛亚历山大藻都表现出较好的杀藻效果,其中对处于延滞期的塔玛亚历山大藻表现出最佳的杀藻效果,处理96 h后,抑藻率达98.17％;不同生长期菌株对塔玛亚历山大藻溶藻作用无明显差异;菌株BS03通过间接作用方式溶藻,所分泌的胞外活性物质的分子量小于1 kDa,耐酸碱、具热稳定性,推测为非蛋白质、非核酸和非多糖类物质.     

凤眼莲根系丙酮提取物抑制赤潮藻类生长的机制研究

为了探讨凤眼莲根系丙酮提取物抑制塔玛亚历山大藻(Alexandrium tamarense)生长的机制,筛选和发现新的、高效、低毒或无毒、能迅速控制赤潮生物生长的除藻剂.对比分析了凤眼莲根系丙酮提取物中不同物质的抑藻效果,探讨了凤眼莲根系丙酮提取物抑藻的主要化学基础.通过考查主要抑藻物质对藻细胞可溶性蛋白质、丙二醛含量和超氧化物歧化酶(SOD)活力的影响,探讨其抑藻机理.结果表明,浓度高于5 mg·L-1以上的N-苯基-2-萘胺,3 d后能保持对塔玛亚历山大藻抑制率超过50%;浓度为70μL·L-1的亚油酸对塔玛亚历山大藻的抑制率约为40%;浓度为70 μL·L-1的壬酸第3天可以达到85%的抑藻率,但随后藻密度有反弹.实验浓度范围内的亚油酸甘油酯和丙酰胺对塔玛亚历山大藻的抑制作用不明显.培养液中加入一定量N-苯基-2-萘胺后,藻体中的可溶性蛋白质和丙二醛含量有应激性升高,超氧化物歧化酶活力呈下降趋势.研究结果表明,N-苯基-2-萘胺可能是凤眼莲根系丙酮提取物中的主要抑藻物质;其可能通过自由基反应破坏藻细胞的结构,从而达到抑藻效果.     

大型海藻与赤潮微藻以及赤潮微藻之间的相互作用研究

研究了2种大型海藻石莼(Ulva pertusa)和江蓠(Gracilaria lemaneiformis)对2种赤潮微藻:东海原甲藻(Prorocentrumdonghaiense)和塔玛亚历山大藻(Alexandum tamarense)生长的影响以及2种微藻之间的相互作用,结果发现:①在大藻(石莼或江蓠)-微藻(东海原甲藻或塔玛亚历山大藻)的共培养体系中,石莼和江蓠均能明显影响与其共培养的微藻的生长,石莼对微藻生长的影响强于江蓠的作用.②在东海原甲藻-塔玛亚历山大藻的双藻培养体系中,东海原甲藻的生长受到明显的抑制作用,最终被完全灭杀;体系中塔玛亚历山大藻的生长未受到明显的影响.另外,塔玛亚历山大藻的培养液滤液能明显抑制东海原甲藻的生长,但东海原甲藻滤液对塔玛亚历山大藻的生长几乎没有影响.实验室条件下模拟二者相互作用的结果显示,塔玛亚历山大藻对东海原甲藻的抑制作用是其被后者抑制作用的17倍左右.③在大藻(石莼或江蓠)-东海原甲藻-塔玛亚历山大藻的多藻培养体系中,东海原甲藻和塔玛亚历山大藻的生长变化与它们在共培养体系中的变化非常类似.半数致死时间(LT50)法的检测结果显示:多藻培养体系对东海原甲藻的联合作用是协同作用,而对塔玛亚历山大藻的作用是相加作用.     

蒙古裸腹溞对有毒赤潮生物塔玛亚历山大藻的摄食研究

在实验室条件下研究了枝角类蒙古裸腹溞(Moina mongolica)对有毒赤潮生物塔玛亚历山大藻的摄食。结果表明,单一饵料试验中,蒙古裸腹溞摄食率在一定范围内随塔玛亚历山大藻细胞数的增加而增大,在塔玛亚历山大藻和亚心形扁藻组成的混合饵料试验中,当前者细胞数为低值时,摄食率不随后者细胞数的变化而变化,而当前者的细胞数高于1920/mL时,摄食率随亚心形扁藻细胞数的增大而升高。     

光照强度和盐度对塔玛亚历山大藻生长的影响

采用一次性培养方法,在3个光照强度(3 000 lx、6 000 lx、12 000 lx)和7个盐度(10、15、20、25、30、35、40)下,研究了光照强度和盐度对塔玛亚历山大藻生长的影响。结果表明:光照强度对塔玛亚历山大藻的生长有显著性影响(p 0.05),盐度对塔玛亚历山大藻的生长有极显著性影响(p 0.01),光照强度和盐度的交互作用无显著影响(p 0.05)。无论在哪一种盐度条件下,在3 000 lx、6 000 lx和12 000 lx 3种光照强度中,均以 6 000 lx时塔玛亚历山大藻的藻细胞密度值最大,生长情况最好。而无论在哪种光照条件下,7个盐度梯度中,均以盐度为30时藻细胞的密度值最大,生长状况最佳。即最适宜塔玛亚历山大藻生长的光照强度为6 000 lx,盐度为30,此条件下藻细胞达到最大密度值为 65.93104 /mL,最大生长速率为0.3679,平均生长速率为 0.1553 。     

卤虫对塔玛亚历山大藻生长及产毒的影响

为了了解卤虫(Artemia salina)对产麻痹性贝类毒素的塔玛亚历山大藻(Alexandrium tamarense)生长与产毒的影响,本文采用卤虫与有毒藻共培养的方法,研究卤虫对不同起始数量的亚历山大藻生长和产毒的影响。结果表明,当培养液中存在卤虫时,塔玛亚历山大藻的生长受到抑制,对数期缩短,最大藻细胞数量降低且与卤虫数量呈线性负相关,衰亡期细胞数量快速减少。在对数生长初期、中期,卤虫的存在对该藻单位细胞毒素含量影响不明显,但对数末期,可显著增加藻细胞毒素含量。     

CO_2加富对塔玛亚历山大藻和小新月菱形藻种群竞争的影响

通过共培养的方法,研究了塔玛亚历山大藻(Alexandrium tamarense)和小新月菱形藻(Nitzschia closteriumEhr)种群竞争关系对CO2加富的响应变化。培养体系中CO2的浓度分别保持在360μL/L(未加富)和5 000μL/L(CO2加富)。结果表明:(1)不同的初始接种密度对2种藻种群竞争有明显的影响。当塔玛亚历山大藻(A)和小新月菱形藻(N)的初始接种密度比为A∶N=1∶4时,小新月菱形藻在竞争中占有极为明显的优势;当接种比例为A∶N=1∶1,小新月菱形藻占有一定的竞争优势;当接种比例为A∶N=4∶1时,塔玛亚历山大藻在竞争中占有明显优势。(2)CO2加富可改变2种藻种群竞争的关系,使塔玛亚历山大藻竞争能力大大提高,小新月菱形藻种群竞争能力降低,从而导致接种比例A:N=1:4时,塔玛亚历山大藻的竞争劣势不再明显;而接种比例为A:N=1:1和4:1时,塔玛亚历山大藻成为竞争中的优势种。     

富营养化对两种海洋微藻吸收铜和镉的影响

采用室内模拟实验的方法,研究了不同氮、磷浓度下中肋骨条藻(Skeletonema costatum)和塔玛亚历山大藻(Alexandrium tamarense)吸收重金属Cu和Cd的变化情况。结果表明,10 h的吸收实验中,两种藻对Cu和Cd的吸收量随培养时间呈增长趋势。塔玛亚历山大藻和中肋骨条藻对Cd的吸收速率都与藻生长速率表现出很好的相关性。N浓度的增加显著促进了两种藻对Cu和Cd的吸收。P浓度的增加促进了中肋骨条藻对Cu的吸收,中肋骨条藻对Cd的吸收受P影响不大。P对塔玛亚历山大藻吸收Cu和Cd的影响也不显著。此外,本研究还表明,当外界Cu浓度100 g/L,Cd浓度20 g/L时,两种藻对Cu和Cd的吸收量随介质中Cu和Cd浓度的升高呈直线增加趋势,说明本实验设置的低、高浓度重金属处理中,藻类的生理状态并未发生明显改变,实验结果准确可靠。     

玉米叶对我国几种典型赤潮藻生长的影响研究

研究了玉米叶对塔玛亚历山大藻(Alexandrium tamarense)、海洋卡盾藻(Chattonella marina)、赤潮异弯藻(Heterosigma akashiwo)、东海原甲藻(Prorocentrum donghaiense Lu)和球形棕囊藻(Phaeocystis globosa)生长的影响,以期为筛选新的、无污染的、廉价高效的除藻剂提供思路,为不同的有害赤潮的治理提供参考.结果表明,玉米叶对塔玛亚历山大藻、海洋卡盾藻、赤潮异弯藻、东海原甲藻和球形棕囊藻生长的影响明显不同.玉米叶可显著抑制塔玛亚历山大藻、海洋卡盾藻和赤潮异弯藻的生长,但对东海原甲藻生长的影响不大,对球形棕囊藻的生长则有显著的促进作用.这些结果表明,玉米叶对赤潮藻生长的抑制作用存在一定的选择性,这种选择性与藻的种属与细胞结构并无明显的相关性.     

基于产毒基因sxtA的qPCR方法在长江口邻近海域有毒藻类检测中的应用初探

麻痹性贝毒(paralytic shellfish toxins)包括石房蛤毒素(saxitoxin)及其同系物,是一类具有神经毒性的生物毒素,主要由甲藻和蓝藻产生。近年来,在蓝藻和甲藻中相继发现了一些与石房蛤毒素合成密切相关的基因,并建立了基于特定产毒基因的有毒藻类检测方法。长江口邻近海域是我国近海有害藻华的高发区,本研究尝试应用基于麻痹性贝毒产毒基因sxtA的qPCR检测方法,与有毒塔玛亚历山大藻复合种(I型和IV型)的qPCR检测方法和麻痹性贝毒的高效液相色谱方法相结合,对2013年春季长江口邻近海域两条断面上有毒藻和藻毒素的分布及变动情况进行了分析。结果表明,基于sxtA的qPCR检测结果与IV型塔玛亚历山大藻复合种的数量存在较好的相关性(r2=0.52,P0.05),说明IV型塔玛亚历山大藻复合种是采样期间长江口邻近海域麻痹性贝毒的主要来源;而样品中藻毒素含量与两种qPCR方法得到的有毒藻数量之间并没有明显相关性。可见,基于产毒基因的检测方法在长江口邻近海域有毒藻类检测中具有一定优势,但不足以准确反映该海域藻毒素的水平。     

塔玛亚历山大藻对文蛤呼吸和排泄的影响

水温20℃下,设置(0、0.1、0.5、1.0、2.0、4.0) ×103/mL六个藻类浓度组,以静水方法研究了塔玛亚历山大藻对文蛤呼吸和排泄的影响.结果表明:当塔玛亚历山大藻浓度为1.0 ×103/mL时,文蛤的耗氧率和排磷率最大,其最大值分别为2.76 ×10-3 /h和0.339 μmol/(g·h);其排氨率在藻浓度为0.5 ×103 /mL时达到最大值5.71 μmol/(g·h).耗氧率与排氨率的比值(O/N)显示在较低塔玛亚历山大藻浓度(≤0.5 ×103 /mL)时,文蛤由蛋白质和脂肪提供机体能量,较高藻浓度(≥1.0 ×103 /mL)时则由脂肪和碳水化合物提供机体代谢所需能量.     

塔玛亚历山大藻对栉孔扇贝胚胎和早期幼虫的影响

塔玛亚历山大藻Alexandrium tamarense(藻株ATHK）能抑制栉孔扇贝Chlamys farreri受精卵的孵化和早期D型幼虫的存活。实验发现，暴露于密度为100和500cells/mL的塔玛亚历山大藻中，36h后，扇贝受精卵的孵化率分别为对照组的30%和5%，在实验范围内，三角褐指藻和赤潮异弯藻对受精卵孵化无影响，而另一塔玛亚历山大藻灌株ATCI02对受精卵孵 化有显著影响，指数生长前期时的藻对受精卵的毒性最大，原肠期之前各阶段的胚胎对塔玛亚历山大藻毒性最敏感，在密度为3000cells/mL以上的塔玛亚历山大藻中，早期D型幼虫存活和活力开始显著下降，在密度为5000cells/mL藻中暴露20d或10000cells/mL藻中暴露14d后，D型连续剧虫的存活率为0。塔玛亚历山大藻产生的毒性物质为非PSP毒素的一类未知毒素。     

酚酸类化感物质对塔玛亚历山大藻生长的影响

探讨了不同浓度酚酸类化感物质香草醛、没食子酸和(+)-儿茶素对赤潮藻-塔玛亚历山大藻(Alexandriumtamarense)生长的影响.结果表明,没食子酸和(+)-儿茶素的浓度为4,20,40mg/L时均能有效抑制塔玛亚历山大藻的生长,且具有明显的剂量依赖关系,浓度为40mg/L时,藻的生长被完全抑制.香草醛的浓度为40mg/L时对塔玛亚历山大藻的生长有明显的抑制作用.没食子酸和(+)-儿茶素对塔玛亚历山大藻生长的抑制作用比香草醛明显,提示香草醛、没食子酸和(+)-儿茶素抑制赤潮生物生长的机制可能与自氧化有关.     

3种赤潮微藻生长过程中pH的变化及其耐受力研究

在实验生态条件下,采用一次性培养法对3种赤潮微藻:赤潮异弯藻(Heterosigma akashiwo)、塔玛亚历山大藻(Alexandrium tamarense)和中肋骨条藻(Skeletonema costatum)生长过程中pH的变化以及对pH的耐受力进行了研究。结果表明:(1)塔玛亚历山大藻对pH具有极高的耐受力,在pH值昼夜变化为9.0～10.3时,仍能进行指数生长,其培养液的最高pH值为10.4;(2)中肋骨条藻在pH值8.9～9.6时仍能进行指数生长,其培养液达到的最高pH值为9.7;(3)赤潮异弯藻在pH8.7～9.4可进行指数生长,其培养液达到的最高pH值为9.5。在培养过程中3种赤潮微藻培养液的pH值都有较大的变化范围;3种赤潮微藻,尤其是塔玛亚历山大藻对pH具有极高的耐受力,这可能是它们容易形成赤潮的原因之一。     

玉米秸秆对塔玛亚历山大藻生长的影响及化学基础研

以塔玛亚历山大藻(Alexandrium tamarense)为材料,观察了玉米茎秆和玉米叶对塔玛亚历山大藻生长的影响,比较了灭菌、未灭菌玉米叶的抑藻活性,并对玉米叶抑制藻类生长的化学基础进行了分析,以期为筛选和发现新的高效除藻剂提供思路.结果表明,玉米秸秆能显著抑制塔玛亚历山大藻的生长,玉米叶的抑藻作用强于玉米茎秆.0.5 g/Ｌ的玉米叶对密度为1.69×１０６ 个/L的塔玛亚历山大藻的生长有明显的抑制作用.灭菌、未灭菌玉米叶对塔玛亚历山大藻生长的抑制作用无明显差别,表明微生物不是玉米秸秆发挥抑藻作用的主要原因.玉米叶不同溶剂粗提物对塔玛亚历山大藻生长的抑制作用不同,石油醚、二氯甲烷粗提物的抑藻活性明显强于乙酸乙酯和正丁醇粗提物.GC-MS分析结果显示,石油醚、二氯甲烷粗提物中主要含十八碳二烯酸、十八碳三烯酸、棕榈酸等脂肪酸类物质,提示长链脂肪酸可能是玉米秸秆抑藻的主要化学成分.     

塔玛亚历山大藻对鲈鱼幼鱼毒性效应研究

塔玛亚历山大藻（Alexandrium tamarense)(ATHK)藻液能对鲈鱼（Lateolabrax japonicus)幼鱼（2．5cm）的存活有明显的影响，96h的半致死浓度为4000cells/mL。根据该藻PSP产毒量37．48fmol/cell（毒性为11pg(STX eq)/cell）计算，鲈鱼幼鱼的96h半致死藻毒素浓度相当于149．92fmol/L（毒性为44pg（STX eq)/L）。通过对塔玛亚历山大藻藻液各组分（都相当于8000cells/mL）：藻细胞悬浮液、去藻过滤液、细胞内容物以及细胞碎片的毒性大小比较研究，发现藻细胞的毒性作用很强，与藻液相近，细胞内容物也有显著影响，其他组分无显著的毒性作用，结果表明幼鱼摄入PS旨幼鱼致死的原因。较大的幼鱼（12cm）对有毒藻不敏感，暴露在1000cells/mL 10d后，存活率为100％。探讨了塔玛亚历山大藻的致毒机制和途径。