实时荧光定量PCR技术对氨氧化细菌的研究

传统的PCR技术只能实现对核酸的定性检测而无法对其进行定量研究。随着分子生物学技术的发展,在传统PCR技术的基础上发展起来的实时荧光定量PCR技术实现了对核酸的定量研究。该技术是向常规PCR反应体系中加入荧光染料或荧光探针,通过监测PCR反应过程中荧光信号的变化来实现对核酸的定量。实时荧光定量PCR技术具有应用范围广、灵敏度高、操作简单、工作量低等特点,在医学和微生物学领域已广泛地应用于疾病诊断、病毒定量检测、微生物群落结构分析及演替规律的研究。文章综述了该项技术的原理、特点及其在环境氨氧化细菌研究中的应用,同时也指出了该技术存在的问题及其发展应用前景。     

武汉东湖沉积物好氧氨氧化微生物时空分布

采用实时荧光定量PCR(qPCR)技术,测定了武汉东湖沉积物中氨氧化古菌(AOA)和氨氧化细菌(AOB)氨单加氧酶基因(amoA)的丰度,并结合沉积物水体环境中各形态氮素的含量,分析氮素含量对AOA和AOB的时空分布的影响.结果显示,AOA amoA基因丰度大于AOB amoA基因丰度,表明AOA对氨氧化过程的贡献较大...     

微囊藻毒素含量与自然水体环境影响因子的相关性

研究了太湖流域湖州段、杭州市贴沙河和某水华池塘等自然水体的微囊藻毒素水平,利用相关性分析、主成分分析、聚类分析等统计方法,探讨了自然水体中微囊藻毒素MCLR和MCRR与环境影响因子的相关性.结果表明,3处水体的微囊藻毒素MCLR水平为0.049～12.30μg/L,MCRR为0.032～7.90μg/L,底层水中微囊藻毒素的含量显著高于表层水;水体中MCLR的平均浓度与TN、NH₄⁺-N、NO₂^--N和TP呈显著正相关(p<0.01),与水温、DO和氮磷比呈显著负相关(p<0.01),MCRR的平均浓度与NO₃^--N和氮磷比呈显著正相关(p<0.01),与pH、DOC、高锰酸盐指数、光密度呈显著负相关(p<0.01);TP和NO₂^--N是影响MCLR生物合成的主导因子,NO₃^--N和氮磷比是影响MCRR生物合成的重要因子;NO₂^--N和NO₃^--N可能分别是MCLR和MCRR生物合成中利用的主要无机氮源.     

布吉河丰水期总细菌和氨氧化细菌的定性和定量研究

河流中微生物的数量和群落结构能在一定程度上反映水环境状况.氨氧化细菌驱动的硝化作用是氮素转化的主要机制,为了解氮素污染河流中氨氧化细菌的群落组成及数量,采用变性梯度凝胶电泳(denaturing gradient gel electrophoresis,DGGE)和Real-time PCR技术分析了布吉河丰水期不同断面水样中总细菌和氨氧化细菌的群落结构以及数量变化.结果表明,水样中总细菌(16S rRNA)和氨氧化细菌(16S rRNA)数量变化范围分别为4.73×1010～3.90×1011copies.L-1和5.44×106～5.96×108copies.L-1.冗余度分析表明影响微生物数量和群落结构的水环境因子不同:对于总细菌,与其数量显著相关的环境因子是硝氮(P<0.05),与其群落结构显著相关的环境因子是氮素(三氮)和金属(Mn和Zn)(P<0.05);对于氨氧化细菌(ammonia-oxidizing bacteria,AOB),与其数量显著相关的是氨氮和Zn(P<0.05),与其群落组成显著相关的是氨氮、Mn和Zn(P<0.05).测序结果表明在布吉河水样中微生物属于变形菌门(Proteobacterium)的Epsilon-Proteobacteria、Gamma-Proteobacteria、Beta-Proteobacteria和Delta-Proteobacteria这4个纲,氨氧化细菌与Nitrosomonas sp.和Nitrosospira sp.属的细菌相似度较高,且Nitrosospira sp.为优势菌属.由于污染影响,布吉河上游和下游微生物群落结构明显不同.     

湖泊沉积物中氨氧化微生物的amoA基因数量

采用定量PCR方法测定了4个湖泊沉积物中氨氧化微生物的amoA基因数量,并分析了其与环境因子之间的关系. 结果表明:小南湖AOA(氨氧化古菌)和AOB(氨氧化细菌)的amoA基因数量最多,分别达2.1×104和2.8×103copies/g(以干质量计,下同);梁子湖仅检测到了AOA amoA基因的存在,平均值为4.9×103copies/g. 东湖和汤逊湖的AOA amoA基因数量比较接近,约为3.0×103copies/g,然而AOB的amoA基因数量在这2个湖泊中仅分别为37和86copies/g;在这些采样点中,AOA的amoA基因数量是AOB的3~278倍. 统计分析发现,随着湖泊营养水平和间隙水中ρ(NH₄+)的上升,AOA和AOB的amoA基因数量均呈增加趋势,但ρ(NH₄+)增加对AOB的促进作用要大于AOA,导致AOA和AOB的amoA基因数量比值与间隙水中ρ(NH₄+)呈显著负相关. pH上升对2类氨氧化微生物的抑制作用则与ρ(NH₄+)增加对它们的促进作用相反. 沉积物中amoA基因数量与间隙水中ρ(NO₂-)无显著相关性,但与ρ(NO₃-)呈显著正相关. 由于ρ(NH₄+)与ρ(DO)之间呈显著负相关,因此认为ρ(DO)与氨氧化微生物amoA基因数量之间的显著负相关可能更多的是对ρ(NH₄+)与氨氧化微生物amoA基因数量之间紧密关系的一种间接反应.      

密云水库底泥和库滨区土壤中氨氧化细菌的多样性和丰度

采用分子生物学方法（T-RFLP、定量PCR）研究了密云水库底泥沉积物和库滨带土壤中氨氧化细菌（AOB）的多样性和丰度特征,并使用Canoco for Windows 4.5软件和皮尔森相关系数法,探究了环境因子对AOB群落的影响.结果表明,沉积物和库滨区土壤中AOB的多样性和数量都存在较大的差异.其中,AOB群落被聚成两大类：沉积物与土壤.沉积物样品中AOB群落结构与其它样品差异较大.沉积物中AOB的多样指数最低,而在农田土壤中AOB多样性指数最高.农田土壤中的amoA基因拷贝数最大,是底泥沉积物中的48倍.此外,RDA（Redundancy Analysis）分析表明,在沉积物和水陆交错带土壤中,AOB的优势种与NH₄⁺-N、NO₃^--N、TOC、pH成正相关关系,而在陆相土壤和农田土壤中,AOB的优势种与这些环境因子成负相关关系.其中,TOC是影响AOB的群落结构的关键理化因子.     

淡水水体底泥厌氧氨氧化菌的初步富集培养与氨氧化特性

对已通过16SrRNA基因方法检测到厌氧氨氧化菌(anammox菌)的江苏新沂河底泥样品在厌氧生物反应器中进行连续培养,研究这种新发现的anammox菌的生长特性,及其厌氧氨氧化效应.培养试验历时49d.经25d的启动期,反应器中氨氮和亚硝酸氮开始同时降低,并与厌氧氨氧化反应的化学计量关系类似.此后,反应器的氮转化量呈上升趋势(最大值接近0.17kg.m-.3d-1).底泥经培养后,anammox菌得到了富集,其数量从1%提高到5.6%,其倍增时间为12d.研究还发现反应器生物量的流失,出水中含有与anammox菌特异性基因探针杂交并正进行增殖的细菌细胞,但其生物特性有待深入研究.     

不同氮水平下间作对玉米土壤硝化势和氨氧化微生物数量的影响

利用荧光定量PCR(real-time quantitative PCR,Q-PCR)技术,结合氨氧化细菌(ammonia oxidizing bacteria,AOB)和氨氧化古菌(ammonia oxidizing archaea,AOA)丰度和土壤理化性质的测定,探索了不同氮水平下间作对玉米土壤硝化势(PNF)的影响.试验设置玉米单作和与马铃薯间作两个种植模式,4个施氮水平(不施氮N0、1/2常规施氮N1、常规施氮N2和3/2常规施氮N3)的随机区组试验.结果表明,从不施氮到常规施氮,土壤硝化势和AOA、AOB数量均随施氮量增加而逐渐增加,而高氮(N3)时与N2没有显著差异;间作对土壤硝化势、AOA与AOB数量的影响与施氮量和作物生育期有关,低氮投入(N1)间作有利于增加土壤氨氧化微生物数量和硝化作用.施肥是硝化势增加的主要驱动因子,相关性分析结果表明,土壤含水量是影响PNF的主要环境因子;PNF与土壤中AOA、AOB amoA基因丰度成显著的正相关.尽管玉米马铃薯间作降低了土壤中AOA、AOB amoA基因丰度,却使得间作土壤中AOB占据氨氧化微生物数量上的优势.以上结果表明,施氮和间作均影响了土壤硝化作用和氨氧化微生物AOA和AOB数量的变化,这些变化会影响土壤环境质量.     

巢湖完全氨氧化细菌的丰度、群落结构及其影响因素研究

完全氨氧化过程（complete ammonia oxidation, comammox）的发现使研究者们对硝化作用和氮循环都有了新的认识.本研究选取巢湖冬夏季表层（0~10 cm）沉积物样品,运用高通量测序、实时定量PCR等分子生物学技术对comammox细菌的丰度和群落结构进行研究.结果表明：基于amoA基因的comammox细菌的丰度为（5.20±0.72）×10⁶~（4.06±1.23）×10⁷ copies·g^-1;氨氧化古菌的丰度为（5.39±1.01）×10⁵~（1.60±0.18）×10⁷ copies·g^-1;氨氧化细菌的丰度为（6.16±1.57）×10⁵~（4.30±0.19）×10⁶ copies·g^-1.comammox细菌的绝对丰度显著高于氨氧化古菌和氨氧化细菌.多样性分析表明冬季巢湖表层沉积物中的comammox细菌的物种多样性大于夏季.其中Candidatus Nitrospira nitrificans、Candidatus Nitrospira nitrosa和Candidatus Nitrospira inopinata的相对丰度最高占比分别为78.72%、49.80%和6.28%,且夏季样点中Candidatus Nitrospira inopinata的相对丰度显著高于冬季样点.主坐标分析（Principle Coordinate Analysis, PcoA）结果表明,comammox细菌的群落结构具有明显的时间异质性.理化因子中,NH₄⁺和NO₃^-与comammox细菌的丰度呈负相关关系.本研究在一定程度上揭示了comammox细菌的丰度、群落组成、多样性及其与理化因子的关系.     

海洋氨氧化古菌与氨氧化细菌在N2O生成机制中贡献研究

氧化亚氮（N₂O）是一种重要的痕量温室气体,而且在光照条件下平流层的N₂O会与O₃发生光化学反应,破坏臭氧层。海洋是大气中N₂O的主要来源之一,海洋中N₂O主要通过硝化和反硝化作用产生,而氨氧化作用是硝化作用的关键（限速）步骤,氨氧化古菌可能是氨氧化过程的主要执行者。本文先概述海洋中N₂O分布以及影响氨氧化古菌（Ammonia oxidizing archaea,AOA）和氨氧化细菌（Ammonia oxidizing bacteria,AOB）的amoA（ammonia monooxygenase）丰度与活性的因素以及N₂O生成机制研究现状,进而总结AOA和AOB在海洋N₂O生成机制中起到的关键作用,最后结合全球气候变化、海洋酸化以及大洋OMZ区域扩大等前沿科学问题,对AOA、AOB以及N₂O的生成机制研究进行了展望。     

Impact of acetochlor on ammonia-oxidizing bacteria in microcosm soils

Acetochlor is an increasingly used herbicide on corn in North China. Currently, the effect of acetochlor on soil ammonia-oxidizing bacteria (AOB) communities is not well documented. Here, we studied the diversity and community composition of AOB in soil amended with three concentrations of acetochlor (50, 150, 250 mg/kg) and the control (0 mg acetochlor/kg soil) in a microcosm experiment by PCR-DGGE (polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis) and the phylogenetic analysis of excised ...     

七星河湿地氨氧化古菌多样性和丰度及其与环境因子的相关性分析

以典型东北寒温带沼泽湿地——七星河湿地中芦苇和小叶樟植被下不同深度土壤中氨氧化古菌(Ammonia-Oxidizing Archaea,AOA)为研究对象,以编码氨氧化作用关键酶——氨单加氧酶(AMO)的amo A基因为分子标记,通过构建克隆文库和生物信息学方法分析数据,考察了不同植被环境中AOA多样性和丰度的垂直分布规律,及其与环境因子的相关性.研究结果表明,小叶樟植被土壤中AOA amo A基因多样性显著高于芦苇植被土壤中amo A基因多样性,芦苇植被土壤中AOA amo A基因多样性在深度为40~60 cm土层中最高,AOA多样性与NH+4-N、NO-3-N含量呈正相关;小叶樟植被土壤中AOA amo A基因多样性在深度为20~40 cm土层中最高,AOA多样性与NH+4-N、NO-3-N含量呈正相关.芦苇植被土壤中AOA丰度最低值出现于0~20 cm土层中,到20~40 cm土层中出现最高值,随着深度增加AOA丰度下降,AOA丰度则与NO-2-N含量呈正相关.小叶樟植被土壤中AOA丰度变化趋势与芦苇不同,最高值出现于0~20 cm土层中,随着土层深度增加AOA丰度下降,到40~60 cm出现最低值,AOA丰度与NO-2-N、TOC含量呈正相关.两种植被土壤中AOA丰度均在60~90 cm处有升高趋势.芦苇植被土壤中AOA丰度约是小叶樟植被土壤中AOA丰度的1.49倍.以上结果为湿地AOA生态功能及分布模式的研究提供基础数据,对全球氮循环的研究提供补充.     

AOB与AnAOB在不同生物填料上挂膜效果的研究

针对厌氧氨氧化工艺运行过程中污泥流失严重与启动时间长等问题,本研究通过对多种市售生物填料的挂膜实验,筛选适合好氧氨氧化菌与厌氧氨氧化菌挂膜的生物填料.结果表明,当活性污泥中的好氧氨氧化菌菌属为Nitrosomonas时,AQ1聚氨酯立方体填料最适合其挂膜,挂膜成熟时好氧氨氧化速率可以达到（0.81±0.08）mg N/（L·h）,挂膜生物量为（0.87±0.14）mg VSS.而更适合厌氧氨氧化菌（Candidatus Kuenenia）挂膜的生物填料为K3环形填料,材质为聚乙烯或者聚丙烯.当厌氧氨氧化菌挂膜成熟时,其厌氧氨氧化速率可以达到（3.27±0.10）mg N/（L·h）,挂膜生物量为（2.74±0.40）mg VSS.厌氧氨氧化菌在K3型填料上的挂膜要优于好氧氨氧化菌,其原因是厌氧氨氧化菌分泌的胞外聚合物含量要高于好氧氨氧化菌,而胞外聚合物是形成生物膜的重要因素.     

Community analysis of ammonia-oxidizing bacteria in activated sludge of eight wastewater treatment systems

We investigated the communities of ammonia-oxidizing bacteria(AOB) in activated sludge collected from eight wastewater treatment systems using polymerase chain reaction(PCR) followed by terminal restriction fragment length polymorphism(T-RFLP),cloning,and sequencing of the α-subunit of the ammonia monooxygenase gene(amoA).The T-RFLP fingerprint analyses showed that different wastewater treatment systems harbored distinct AOB communities.However,there was no remarkable difference among the AOB TRFLP profiles from different parts of the same system.The T-RFLP fingerprints showed that a full-scale wastewater treatment plant(WWTP) contained a larger number of dominant AOB species than a pilot-scale reactor.The source of influent affected the AOB community,and the WWTPs treating domestic wastewater contained a higher AOB diversity than those receiving mixed domestic and industrial wastewater.However,the AOB community structure was little affected by the treatment process in this study.Phylogenetic analysis of the cloned amoA genes clearly indicated that all the dominant AOB in the systems was closely related to Nitrosomonas spp.not to Nitrosospira spp.Members of the Nitrosomonas oligotropha and Nitrosomonas communis clusters were found in all samples,while members of Nitrosomonas europaea cluster occurred in some systems.     

Isolation and characterization of facultative mixotrophic ammonia-oxidizing bacteria from constructed wetlands

Autotrophic ammonia-oxidizing bacteria (AOB) have been widely studied in constructed wetlands systems, while mixotrophic AOB have been less thoroughly examined. Heterotrophic bacteria were isolated from wastewater and rhizospheres of macrophytes of constructed wetlands, and then cultivated in a mixotrophic medium containing ammonium and acetic acid. A molecular characterization was accomplished using ITS-PCR amplification, and phylogenetic analysis based on 16S rRNA gene sequences. Results showed the presence of 35 bacteria, among 400 initially heterotrophic isolates, that were able to remove ammonia. These 35 isolates were classified into 10 genetically different groups based on ITS pattern. Then, a collection of 10 isolates were selected because of their relatively high ammonia removal efficiencies (ARE ≥ 80%) and their phylogenetic diversity. In conditions of mixotrophy, these strains were shown to be able to grow (increase of optical density OD₆₆₀ during incubation with assimilation of nitrogen into cellular biomass) and to oxidize ammonia (important ammonia oxidation efficiencies, AOE between 79% and 87%). Among these facultative mixotrophic AOB, four isolates were genetically related to Firmicutes (Bacillus and Exiguobacterium), three isolates were affiliated to Actinobacteria (Arthrobacter) and three other isolates were associated with Proteobacteria (Pseudomonas, Ochrobactrum and Bordetella).     

镜泊湖浮游藻类组成及其与环境因子的相关分析

2013年5月、9月及10月在镜泊湖26个采样位点共采集到浮游藻类8门74属140种.其中绿藻门最多,共58种,占41.5%.浮游藻类组成以绿藻和硅藻占优,并且藻类群落结构存在明显的时空差异,各调查位点藻的种类范围在3~35种,密度范围在0.5×104~230.8×104个/L.调查期间,浮游藻类的Margalef指数、Shanoon-Wienner指数以及Pieloud指数范围分别为0.48~2.31,1.27~3.97,0.45~0.94,水体综合营养状态指数值TLI在40~60之间,总的来看,镜泊湖水体属于中营养-轻度富营养状态.Pearson相关分析结果显示,镜泊湖藻类群落分布受水环境因子影响明显.整体上,水温、DO、SD、CODMn及NH3-N是影响镜泊湖藻类种群分布格局的主要因素.     

北运河闸坝区水体氨氧化微生物及硝化活性特征研究

采用分子荧光定量PCR对北运河闸坝区(上游沙河闸和下游杨洼闸)水体中氨氧化细菌(AOB)的amoA基因拷贝数进行定量测定,并研究了闸坝设置和排污口污水排放对AOB的amoA基因拷贝数,硝化活性(NA)和氮素转化的影响.结果表明,1在沙河闸段,AOB的amoA基因拷贝数呈现先上升后下降,排污口处又显著上升的空间变化特征,其变化范围为(1.84±0.09)×10~8~(7.12±0.36)×10~8copies·L~(-1),排污口处最高;在杨洼闸段,amoA基因拷贝数呈现先上升后下降最后趋于平稳的空间变化特征,其变化范围为(3.05±0.15)×10~8~(6.83±0.34)×10~8copies·L~(-1),下游100 m处最高.闸坝的设置和排污口污水的排放对AOB的amoA基因拷贝数和空间分布具有显著影响.2硝化活性(NA)的空间变化特征与AOB的变化特征相同.闸坝的设置和污水排放能促进水体的硝化过程,加快污染物质的降解.3沙河闸排污口处排放的NH_4~+-N可以作为AOB生长的氮源,提高硝化活性,加快NH_4~+-N全向NO_3~--N的转化,促进硝化过程的完全进行;杨洼闸段闸门的开启导致溶解氧的升高和内源NO_3~--N的释放,为AOB的生长提供氮源,提高硝化活性,但造成了NO_2~--N的积累.     

辽河口芦苇湿地土壤氨氧化菌的时空变化

采用传统的最大或然数法(MPN)和不依赖于培养的变性梯度凝胶电泳技术(DGGE),对辽河口芦苇湿地土壤中AOB的丰度、多样性进行了解析,并试图探究AOB同土壤可溶性盐分等环境因素之间的关系.结果表明:芦苇湿地土壤中AOB多样性指数时空分布存在较大差异,同一月份中不同站点之间群落结构相似性较大,AOB细菌数量与土壤可溶性盐分之间存在显著负相关关系(P<0.05),与土壤总氮和有机质含量之间存在极显著性正相关关系(P<0.01),表明盐分、总氮和有机质含量是辽河口湿地AOB数量时空分布的重要影响因素.     

河岸过滤中氨氮的削减及其浓度对细菌与氨氧化微生物的影响

通过小试滤柱模拟河岸过滤,结合荧光定量PCR和高通量测序等手段研究了河岸过滤对氨氮的削减效能和进水氨氮浓度对细菌与氨氧化微生物的影响.结果表明,低浓度(0.2 mg·L^-1)氨氮未被削减,较高浓度(1.0 mg·L^-1和2.0 mg·L^-1)氨氮的削减率可达70%.进水处细菌丰度随氨氮浓度升高而增加,细菌群落组成随氨氮浓度升高发生规律性变化.出水处氨氧化古菌(Ammonia oxidizing archaea,AOA)丰度与氨氮浓度呈负相关,氨氧化细菌(Ammonia oxidizing bacteria,AOB)丰度与氨氮浓度无显著相关关系;进水处AOA-α多样性与氨氮浓度呈正相关,但AOB-α多样性与氨氮浓度呈负相关;进水处AOA群落组成受氨氮浓度影响,而进、出水处AOB群落组成均受氨氮浓度影响.可见,进水氨氮浓度会影响河岸过滤对氨氮的削减效能,还会影响细菌、氨氧化微生物的丰度及群落结构,AOB对氨氮浓度的变化比AOA更敏感.