氮源对枯草芽孢杆菌WSHDZ-01合成过氧化氢酶的影响

为提高枯草芽孢杆菌WSHDZ-01合成过氧化氢酶的水平,尝试了不同种类氮源的添加.结果表明,硝酸钠(NaNO3)为适宜氮源,虽然生物量仅1.25 g/L,但过氧化氢酶活力最高可达3 200 U/mL.在添加NaNO,的基础上,研究了添加其它氮源麦芽汁、酵母膏、玉米浆对提高wsHDz.0l生物量的影响,发现适宜浓度的麦芽汁不仅可以提高生物量,并且能够缩短发酵周期.经进一步优化,在3 L发酵罐中,WSHDZ-01生物量提高到6 g/L,过氧化氢酶活力达到11 000 U/mL,与优化前相比,发酵周期缩短了近60%,生产强度提高了3倍.     

产二羰基醛酮还原酶的1株嗜麦芽寡养单胞菌研究

用含甲基乙二醛的LB培养基平板筛选到1株能代谢甲基乙二醛的细菌,通过对克隆到的16S rDNA基因序列比对及生理生化实验,将其鉴定为嗜麦芽寡养单胞菌,命名为Stenotrophomonas maltophilia YL.破碎该菌细胞后提取粗酶,以甲基乙二醛作反应底物,在还原性辅酶Ⅰ存在条件下,紫外光谱和HPLC的分析表明,该菌能代谢甲基乙二醛;并对其产酶条件进行了研究.紫外分光光度法测得酶活力表明,该菌有较强的醛酮还原酶活力;并对温度和pH值对酶活力的影响作了分析.图5表1参17     

一株产酸性α-淀粉酶菌株的筛选、纯化及酶学性质

从南宁酒厂附近土壤中筛选到一株产淀粉酶的野生菌株GXBA-4,经革兰氏染色、芽孢染色以及16SrDNA鉴定,初步确定为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefacien).将该菌株发酵液经过硫酸铵沉淀和凝胶过滤纯化出一种α-淀粉酶,该酶相对分子质量约为57×103;反应最适温度为40~45℃,适应温度范围广,30℃时仍具有80%以上的相对活力;最适pH为5.0,为低温酸性淀粉酶.该酶水解可溶性淀粉的产物,经HPLC检测主要是以葡萄糖,麦芽糖以及麦芽三糖为主的低聚糖,分别以α-环糊精、β-环糊精、可溶性淀粉、玉米生淀粉为底物,还原糖产物比为0:0:99:3.4,表明该酶为典型的α-淀粉酶.     

麦芽寡糖基海藻糖水解酶基因在巴斯德酵母中的表达及遗传稳定性

海藻糖是一种具有很多功能的非还原性二糖,在生物制品和食品等行业中具有较广泛的用途.对来自芝田硫化叶菌(Sulfolobus shibatae)B12海藻糖酶转化过程中的关键酶基因--麦芽寡糖基海藻糖水解酶(MTHase)基因进行了遗传密码子的人工改造,合成酵母偏爱密码子和修改基因遗传密码子中的A/T含量,然后将完整的MTHase基因克隆到酵母表达载体pPICZαA,筛选出重组载体并将其导入巴斯德酵母(Pichia pastoris)细胞进行重组表达以用于海藻糖的酶转化.最后获得了一株高效稳定表达MTHase的酵母菌株,分泌到表达培养基上清中的MTHase的酶活大于800U/mg(蛋白质),该重组菌株遗传稳定率达84%以上,为工业化酶法生产海藻糖奠定了一定基础.     

苯丙氨酸解氨酶高活性红酵母(Rhodotorula sp.)CIBAS A 1401菌株的鉴定

红酵母菌株(Rhodotorula sp．)CIBAS A 1401是一株分离自我国西南天然源的具有生物技术用途的高活性苯丙氨酸解氨酶(PAL)菌种．它已经在我国作为工业生物催化酶源菌种，用于PAL／反式-肉桂酸生物转化途径生产L-苯丙氨酸(L—Phe)．该菌株细胞多为球形或卵圆形，单个或几个细胞连结成串珠，多端出芽；在麦芽汁琼脂上产生橙红色菌落，有光泽，表面粘稠，边缘整齐平滑；在马铃薯琼脂上生长不形成菌丝或无假菌丝；不形成掷孢子，不发酵任何糖，能以硝酸盐为唯一氮源，可同化葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、松三糖、D-甘露糖、甘露醇、D-木糖、D-山梨醇、D-果糖、乙醇和甘油；不能同化肌醇、赤藓醇、蜜二糖等；无有性生殖现象．按照其形态培养特征和生理生化特征，A1401菌株鉴定为粘红酵母(Rhodotorula glutinis Harrison)，并命名为粘红酵母：Rhodotorula glutinis CIBAS A 1401．图3表1参12     

土生空团菌培养基优化与摇瓶培养

在单因素试验的基础上,通过正交试验对CgSO1、CgSB2、CgO5和SPOP2这4株土生空团菌[Cenococcumgeophilum Fr.(Cg)]的培养基配方分别进行了优化.结果发现,来源不同的Cg菌株对培养基组分需求存在一定差异,碳氮源、微量元素、无机盐以及维生素都不相同,CgSO1、CgSB2、CgO5对葡萄糖和麦芽汁的混合C源以及牛肉浸膏利用最好,SPOP2对麦芽汁以及酒石酸铵的利用最好,适量的微量元素、无机盐以及维生素B1会促进Cg的生长.经平板培养基优化后的培养基配方可应用到液体培养中,这4株Cg菌经液体培养后菌丝产量分别达到了13.2、12.4、18.9和15.1g/L,均可满足液体发酵的生产要求.     

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)过氧化氢酶的分离纯化及性质

对产自枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis WSHDZ-01的过氧化氢酶,通过乙醇沉淀、DEAE阴离子交换层析、疏水层析3步纯化,最终获得电泳纯的目标酶(纯化6.8倍).该过氧化氢酶的亚基相对分子质量(M1)为63×103,在405 nm处显示特征吸收峰,推测含有血红素.计算获得酶的表观米氏常数为26.87 mmol L-1.该过氧化氢酶不受低亚硫酸钠的还原作用影响,但被氰化物、叠氮化物和3-氨基-1,2,4-三唑(单功能过氧化氢酶的专一抑制剂)强烈抑制.以邻苯二胺作为电子供体测定酶活时,该酶不显示过氧化物酶活性,因此本文将纯化的过氧化氢酶定性为单功能过氧化氢酶.此外,该酶具有热敏感的特点,且酶活在pH 5～10范围内不受pH影响,此后,活性随着pH的升高而升高,并在pH 11～12处有明显的酶活高峰,在pH 11、25℃放置60 min酶活基本不变,表明该酶在高碱条件下具有很高的活力和一定的稳定性.     

铜暴露对赤子爱胜蚓(Eisenia fetida)抗氧化酶活力的影响

通过溶液接触法和人工土壤法,研究了不同暴露环境中Cu对赤子爱胜蚓(Eisenia fetida)SOD酶、CAT酶和GST酶活力的影响.结果显示:溶液接触试验中, Cu显著抑制蚯蚓SOD酶活力(P<0.05),人工土壤试验中Cu则诱导SOD酶活力增加,预示暴露条件影响蚯蚓SOD酶对Cu的生物响应.人工土壤试验中, Cu暴露浓度与蚯蚓CAT酶和GST酶活力的相关系数分别为0.814和0.933,均存在极显著的剂量效应关系(P<0.001).在这两种暴露环境下,赤子爱胜蚓的CAT酶和GST酶活力对Cu浓度响应敏感.     

蒽醌染料中间体溴氨酸降解酶的特性

从污染地分离筛选出的菌株BX26对蒽醌染料中间体溴氨酸有显著的降解脱色作用,降解过程受降解酶的控制,试验结果表明,降解酶为溴氨酸诱导的胞外酶,该酶在温度高于50℃处理后失活,盐度对该酶失活有影响,盐度高于1%会显著降低该酶活力,酶对溴氨酸的催化脱色要有氧参加,氮气气氛中酶活受抑制。     

固定化反胶团漆酶及其在修复土壤DDT污染中的应用

采用吸附法将反胶团漆酶吸附在表面改性后的硅藻土上,制备固定化反胶团漆酶.探讨了反胶团漆酶固定化的影响因素及其部分酶学特性,并对其在修复土壤DDT污染中的应用进行了研究.反胶团漆酶固定化的最佳温度是35 ℃,载体硅藻土的改性剂Tween-80的加入量为硅藻土质量的15%.固定化反胶团漆酶的最适作用温度为35 ℃,最适作用pH为3.5~5.0;与游离漆酶相比,固定化反胶团漆酶的热稳定性和酸碱稳定性都显著提高.采用游离漆酶和固定化反胶团漆酶修复DDT污染土壤,游离漆酶处理中DDT总量(DDTs)的降解率为50.53%,而固定化反胶团漆酶处理中DDTs的降解率高达69.17%.固定化反胶团漆酶处理较游离漆酶处理的DDTs降解率提高了近20%.     

苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)几丁质酶的分离纯化及酶学性质

以苏云金芽胞杆菌为材料 ,通过硫酸铵沉淀分级分离、DEAE - 32离子交换柱层析初步纯化 ,获得比活力为15 0 .5Umg-1的酶制剂 .研究酶催化胶体几丁质水解的反应时间和酶量对酶活力的关系 ,探讨酶催化胶体几丁质的最适条件 .温度和 pH对酶活力的影响和酶的热稳定性及酸碱稳定性的结果表明 :酶催化胶体几丁质水解的的最适pH为 5 .6、最适温度为 5 8℃ .该酶在pH 4 .5～ 6 .5区域稳定 ,而在pH >8能很快失活 ;在 5 5℃以下处理 30min ,酶活力保持不变 ;高于 5 5℃ ,酶快速失活 .图 5参 11     

磁性Fe_3O_4/石墨烯异质结固定漆酶特性及其对水中双酚A的降解研究

以磁性石墨烯为载体制备了磁性石墨烯固定化漆酶,考察了固定化漆酶的酶学特性及其对双酚A(BPA)的降解效能。结果表明,氧化石墨烯的比表面积高达726.34 m2·g-1,与游离漆酶相比,经过石墨烯固定化后漆酶对酸的适应能力、耐热性和贮存稳定性均有所提高,p H值2.0~4.0范围内固定化漆酶活性较为稳定;加入变性剂尿素(1 mol·L-1)后,固定化漆酶的相对活性为87%,游离漆酶相对活性仅为63.02%,固定化导致抗变性剂能力增强。固定化漆酶和游离漆酶活性分别在45和40℃时达到最大值。与游离漆酶相比,固定化漆酶最佳反应温度升高了5℃,且在50℃时,固定化漆酶的相对活性依然保持在95.11%;25℃,p H值4.0条件下保存10 d,固定化漆酶活性为最初活性的82.57%;固定化漆酶具有良好的重复利用性,重复利用10次后,漆酶活性仍为最初活性的82.01%。固定化酶的米氏常数Km为5.38×10-4 mol·L-1,较游离酶的大,说明固定化酶与底物的亲和力比游离酶小。磁性石墨烯固定化漆酶具有良好的吸附能力,可吸附-催化氧化水中的BPA,且石墨烯良好的吸附作用促进了催化反应,水中BPA质量浓度为15 mg·L-1时,经过18 h反应,BPA的去除率能达到82.14%左右。本研究的结果为石墨烯新型材料固定化漆酶及其应用提供了参考。     

磁性Fe3O4/石墨烯异质结固定漆酶特性及其对水中双酚A的降解研究

以磁性石墨烯为载体制备了磁性石墨烯固定化漆酶,考察了固定化漆酶的酶学特性及其对双酚A（BPA）的降解效能。结果表明,氧化石墨烯的比表面积高达726.34 m2·g-1,与游离漆酶相比,经过石墨烯固定化后漆酶对酸的适应能力、耐热性和贮存稳定性均有所提高,pH值2.0~4.0范围内固定化漆酶活性较为稳定;加入变性剂尿素（1 mol·L-1）后,固定化漆酶的相对活性为87%,游离漆酶相对活性仅为63.02%,固定化导致抗变性剂能力增强。固定化漆酶和游离漆酶活性分别在45和40℃时达到最大值。与游离漆酶相比,固定化漆酶最佳反应温度升高了5℃,且在50℃时,固定化漆酶的相对活性依然保持在95.11%;25℃,pH值4.0条件下保存10 d,固定化漆酶活性为最初活性的82.57%;固定化漆酶具有良好的重复利用性,重复利用10次后,漆酶活性仍为最初活性的82.01%。固定化酶的米氏常数Km为5.38×10-4 mol·L-1,较游离酶的大,说明固定化酶与底物的亲和力比游离酶小。磁性石墨烯固定化漆酶具有良好的吸附能力,可吸附-催化氧化水中的 BPA,且石墨烯良好的吸附作用促进了催化反应,水中BPA质量浓度为15 mg·L-1时,经过18 h反应,BPA的去除率能达到82.14%左右。本研究的结果为石墨烯新型材料固定化漆酶及其应用提供了参考。     

有机废弃物降解过程酶作用及其调控机制的研究进展

有机废弃物处置不当造成的环境污染和资源浪费已引起广泛关注,生物降解可以有效地实现有机废弃物资源化利用。微生物分泌的酶能催化生物降解的矿化和腐殖化过程,提高有机物降解率。然而,以往研究主要集中于微生物作用,对有机废弃物降解过程酶作用及其调控机制的总结很少。该文从酶学和生物化学角度出发,论述了生物酶催化降解有机质、促进腐殖质合成和削减污染物毒性等作用过程。基于酶动力学和热力学特征,从微生物、酶的固定化、理化因子和添加剂4个方面阐述酶作用的调控机制。生物酶高效、环保、可控,是有机废弃物资源化利用的重要催化剂之一。未来应加强研究酶降解的途径与分子机制、微生物-酶-有机废弃物系统的新陈代谢、激活剂对酶作用的调控、酶的固定化技术以及降解酶的生产与应用,以推动有机废弃物资源化利用的进程。     

降解菌djl-6多菌灵水解酶的提取及性质

以往对多菌灵降解菌Rhodococcus qingshengii sp.nov.djl-6的降解途径研究显示,该菌株首先通过多菌灵水解酶将多菌灵水解成二氨基苯并咪唑,从而对多菌灵进行脱毒.为开发酶制剂并有效应用于环境中残留污染物多菌灵的降解,比较了不同提取方法(高压细胞破碎、超声波破碎和添加溶菌酶破碎)对多菌灵水解酶提取效率的影响,并对其酶学特性进行了初步研究.结果表明,djl-6菌株在LB培养基中培养72~84 h,生长量和产酶量均达到最大值.采用超声波破碎提取酶的效率较高(蛋白浓度为7.92 mg/mL),但酶活损失较大(比酶活只有1.2 U/μg protein).多菌灵水解酶属于一种胞内组成型酶.该酶水解多菌灵的最适pH值为7.0,最适温度为30℃,Zn2+和K+对酶活有一定的抑制作用.     

产纤维素酶菌株的选育分析及发酵工艺优化

对实验室6株产纤维素酶菌株进行酶活特性研究.首先通过观察纤维素平板的酶溶解透明圈大小进行初步分析,比较6株菌种子发酵液中纤维素酶含量.再根据不同种纤维素酶作用的底物化学键的不同,分别测定菌株的滤纸酶活(FPA)、纤维素内切葡聚糖酶(CMCase)活、纤维素外切葡聚糖酶(CBH)活和β-葡萄糖苷酶酶活,发现菌株中黑曲霉的各产酶指标均高于其它菌株.根据Box-Behnken原理对黑曲霉发酵工艺进行优化设计,得到最适碳源稻草粉含量9.47 g.L-1、麸皮含量49.33 g.L-1,氮源中(NH4)2SO4含量为2.0 g.L-1,发酵后黑曲霉产生的滤纸酶活力达到76.72 U.mL-1,比优化前酶活力提高88.69%.     

添加剂对绿色木霉JQF-04纤维素酶热稳定性的影响

如何提高酶蛋白的热稳定性是分子生物学、微生物学、生化工程学等学科长期所关注的重要研究课题之一.本文研究了多种添加剂对绿色木霉纤维素酶热稳定性的影响.在60℃的溶液中,多元醇(乙二醇、甘油、赤藓糖醇、木糖醇和山梨糖醇)能提高该酶的热稳定性,随着浓度的增加,赤藓糖醇、木糖醇和山梨糖醇促进酶的热稳定性呈线性增高;适当的多元醇分子长度对该酶的热稳定性有最优的保护效应;不同浓度和不同分子量的聚乙二醇对该酶的热稳定性具有明显的影响;在无机盐中,单价金属阳离子比二价金属阳离子更能显著地提高该酶的热稳定性;酶液溶剂的改变直接影响着该酶的热稳定性,该酶在D2O溶液中比在水溶液中稳定,其酶活半衰期延长了2.6倍.研究表明,热环境使酶蛋白分子的螺旋结构发生变化而失活,但某些溶质和溶剂的存在可能通过作用于蛋白质分子的三维结构而影响该酶的热稳定性.图7参15     

基于序列筛选发掘宏基因组文库中的新颖卤化酶基因

绝大部分微生物的不可培养性使微生物的开发利用受到了限制,而宏基因组学策略为研究土壤中的不可培养微生物提供了途径.天然卤化物具有抗菌活性和抗肿瘤活性等生物活性,卤化酶在催化化合物的卤化过程中,对化合物活性产生重要影响,而以卤化酶基因为探针,可以发现与之偶联的天然生物合成基因簇,为卤化物的发现提供基础.利用卤化酶基因序列的保守区域设计简并引物,筛选土壤宏基因组文库获得卤化酶阳性克隆,并对获得的卤化酶基因间的进化及其与天然产物合成的关系进行分析.结果显示:通过同源序列筛选获得了65个卤化酶阳性克隆,序列同源分析表明约85%的阳性克隆中的卤化酶基因序列与已知卤化酶的相似性低,所获卤化酶基因具有较好的新颖性和多样性.而对所获克隆中生物合成相关基因的分析表明其中一个克隆中同时存在聚酮合酶基因与卤化酶基因,其可能与卤代I型聚酮合成相关.本研究基于序列筛选的方法,从宏基因组文库中发现了新的卤化酶基因和聚酮合酶基因,为进一步发现新颖的天然卤化物生物合成基因簇及天然卤化物奠定了基础.     

杀灭菊酯对土壤过氧化氢酶活性的影响

为了探讨杀灭菊酯(Fenvalerate)对土壤过氧化氢酶作用的可能机制,采用室内模拟试验研究了杀灭菊酯对土壤过氧化氢酶活性和酶促反应特征参数的影响,并采用分子荧光光谱法研究了杀灭菊酯对离体过氧化氢酶构象的影响.结果表明,1)随着培养时间的延长,杀灭菊酯对土壤过氧化氢酶和离体过氧化氢酶活性的影响均表现为抑制→激活→恢复,与土壤过氧化氢酶相比,离体过氧化氢酶的抑制最低点发生前移;2)24h培养时间下,土壤过氧化氢酶抑制率与杀灭菊酯浓度呈显著正相关;3)24h培养时间下,随杀灭菊酯浓度的增加,酶促反应米氏常数Km逐渐增大,过氧化氢酶活性、酶促反应最大反应速率Vmax、Vmax/Km均逐渐减小,且各参数与杀灭菊酯浓度均显著相关,表明过氧化氢酶酶促反应特征参数可以表征杀灭菊酯对土壤过氧化氢酶活性的影响程度,其作用机理为混合型抑制;4)分子荧光光谱结果表明,随着杀灭菊酯浓度的增加,离体过氧化氢酶在352nm波长处的相对荧光强度不断增强,其分子构象发生了变化,分子渐趋疏松.