菲和芘对蚯蚓(Eisenia fetida)细胞色素P450和抗氧化酶系的影响

研究了菲和芘在单一低剂量污染胁迫下对蚯蚓(Eisenia fetida)体内细胞色素P450酶系和抗氧化酶系的影响.通过滤纸接触染毒法,检测蚯蚓细胞色素P450含量以及超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)和过氧化氢酶(CAT)的活性.结果表明,在供试浓度范围内,蚯蚓体内细胞色素P450含量和三种抗氧化酶活性均对毒物产生了不同程度的响应.菲和芘在蚯蚓体内的代谢诱发了细胞色素P450总含量的增加,且在此过程中有活性氧自由基产生.不同酶对毒性效应响应的域值不同,其敏感性大小为:P450＞SOD(POD) ＞CAT.根据四个指标对污染物浓度响应的域值不同,可将四者联合应用互为补充作为一套生物标记物体系,以满足污染物不同暴露浓度下土壤的毒理诊断,增强指示的敏感性和有效性.     

大豆叶片黄酮类及多酚类物质对臭氧浓度升高的响应

利用开顶式气室(Open Top Chamber,OTC),通过测定大豆叶片中黄酮类物质(总黄酮、芦丁、槲皮素和桑色素)和酚类物质(总多酚、阿魏酸和P-香豆酰)含量变化,以及苯丙氨酸解氨酶(PAL)、多酚氧化酶(PPO)及脂肪氧化酶(LOX)3种酶活性变化,研究O_3浓度升高对大豆叶片黄酮类和多酚类物质及其氧化酶的影响。以大气臭氧浓度为对照,设置110n L·L~(-1) O_3浓度为一个处理,每个处理设3个OTCs重复。结果表明,随着大豆生育期的延长,与对照相比,总黄酮、芦丁、槲皮素和桑色素都表现出先上升后下降的趋势,在开花期达到峰值,且显著(P0.05)高于对照;P-香豆酰含量表现出先上升后下降的趋势,在开花期达到峰值,总多酚和阿魏酸都显著(P0.05)上升;PAL、PPO、LOX 3种酶的活性与对照相比都显著(P0.05)升高。O_3浓度升高会诱导大豆叶片内PAL和PPO活性增强,进而增加叶片内黄酮类和多酚类物质的含量,提高大豆叶片抗氧化性,抵抗O_3的伤害。但随着O_3熏蒸时间的延长,大豆抗氧化性下降,导致籽粒产量下降。     

葡萄糖脱氢酶基因的缺失对Acetobacter sp.碳源代谢及3-羟基丙酸合成的影响

3-羟基丙酸(3-HP)是一种新兴的高附加值平台化合物,醋酸杆菌(Acetobacter sp.)可高效催化1,3-丙二醇(1,3-PDO)合成3-HP,但其膜上脱氢酶亦可将葡萄糖氧化使培养液酸化,菌体生长受限导致生物量较低.利用同源重组技术对葡萄糖脱氢酶(GDH)基因gdh进行敲除,并考察该基因缺失对细胞生长、碳源代谢及3-HP合成的影响. gdh基因敲除后混合(葡萄糖、甘油)碳源培养条件下菌体量较野生菌提高了1.72倍;碳流分析显示葡萄糖在膜上被GDH氧化生成葡萄糖酸,大部分葡萄糖酸最终被氧化为2-酮基葡萄糖酸,少量经戊糖磷酸途径(PPP)途径被分解,而甘油经磷酸化后进入中心代谢途径或糖异生途径.本研究表明gdh基因敲除后混合碳源培养可大幅度提高菌体量且可以保证较高的催化合成3-HP性能,可为改善醋酸菌碳源利用及催化性能提供理论基础.     

代谢活化作用对多溴代联苯类污染物类/抗甲状腺激素活性的影响

选用大鼠肝匀浆(S9)和鼠肝癌细胞(H4ⅡE)两种体系代谢活化多溴代联苯醚混标(BDEs)和十溴联苯醚(BDE209),采用重组甲状腺激素受体基因酵母检测BDEs和BDE209母体及其代谢产物的类/抗甲状腺激素效应.结果表明,BDEs和BDE209母体均不表现甲状腺激素效应(p>0.05);但是经S9和H4ⅡE细胞代谢活化后,其代谢产物表现出明显的类甲状腺激素活性和抗甲状腺激素活性(p<0.05),BDEs和BDE209的干扰甲状腺激素效应需要经过代谢活化步骤.比较不同代谢活化体系,重组酵母细胞本身的代谢活化作用并不显著,而H4ⅡE细胞和S9代谢活化体系均能够导致活性中间体.     

硫化物胁迫对日本沼虾呼吸代谢和能量代谢酶的影响

研究了硫化物暴露后日本沼虾细胞色素氧化酶(CCO)、琥珀酸脱氢酶(SDH)、延胡索酸还原酶(FRD)和乳酸脱氢酶(LDH)4种呼吸代谢酶及能量代谢酶-精氨酸激酶(AK)活性的变化规律.将日本沼虾暴露于0.6 mg·L~(-1)、2mg·L~(-1)的2个硫化物质量浓度组和不含硫化物的对照组水体中,暴露后0、2、12、24、48 h和解除暴露后48 h取肝胰腺和肌肉组织进行酶活性分析.结果显示:肝胰腺和肌肉组织SDH和CCO活性随硫化物质量浓度升高或暴露时间延长而显著降低(P<0.05).FRD、LDH和AK活性随硫化物质量浓度升高或暴露时间延长而显著升高(P<0.05).解除硫化物暴露后48 h,各质量浓度组酶活性与对照组无显著差异.上述酶活性还存在组织差异,肝胰腺呼吸代谢酶活性高于肌肉中相应酶活性,而AK活性与此相反.结果表明,硫化物胁迫导致日本沼虾有氧呼吸代谢减弱,无氧呼吸代谢增强,并动用其能量贮存物质磷酸精氨酸,产生更多ATP以适应外界不良环境.     

基于宏基因组技术获得的对厌氧氨氧化菌代谢的新理解

厌氧氨氧化菌(Anaerobic ammonium oxidation bacteria,AAOB)是化能自养菌,由于其生理代谢的奇异性、细胞结构的特殊性以及对氮素循环的重要性,已成为环境工程、微生物以及海洋生物学等领域的研究热点.然而,AAOB未能实现纯培养的现状已成为AAOB代谢途径研究的巨大障碍.近年来兴起的宏基因组技术(Metagenomics)为AAOB代谢途径的研究提供了新手段.采用宏基因组技术,可直接研究微生物群体中某特定微生物基因组的结构与功能,摆脱了传统微生物学研究对纯培养的依赖,使未培养微生物的认识和开发成为可能.本文首先简述获取AAOB宏基因组信息的过程,然后通过比较由传统代谢研究方法和宏基因组技术获得的AAOB代谢途径的研究成果,论述基于宏基因组技术获得的对AAOB代谢的新理解,得出以下结果和结论:1)AAOB的碳素固定途径为乙酰辅酶A途径,碳素固定的还原力来自NADH或者QH2;2)AAOB氮素转化的重要中间产物是NO,而非NH2OH,并提出了以NO为核心的AAOB代谢的改进模型;3)AAOB的ATP合成途径为氧化磷酸化,推测的电子传递途径为N2H4—QH2—细胞色素bc1复合体;细胞色素bc1复合体再将电子用于NO2-还原和N2H4合成.AAOB的宏基因组技术使AAOB代谢途径的研究更具方向性.随着分子生物学理论和技术的不断发展,宏基因组学的升级技术(如宏转录组学、宏蛋白质组学)将为AAOB代谢途径的研究提供新的方法与平台.图3表1参51     

运用BioBrick组装策略共表达CYP108N7及其氧化还原伴侣

细胞色素P450单加氧酶(简称P450,CYP)是功能强大的单加氧酶超家族,可以催化多种化学法难以实现的氧化反应.实验室前期挖掘的P450新酶CYP108N7,能够利用菠菜铁氧化还原蛋白(Fdx)和铁氧化还原蛋白还原酶(FdR)作为非天然氧化还原伴侣进行电子传递,并在双质粒系统中实现共表达.本研究拟简化表达体系,重新构...     

不同逆境条件下辣子草抗氧化酶系统的变化

辣子草(Galinsoga parviflora Cav.)原产南美洲,1915年在我国云南和四川等地被发现,是一种危害较严重的外来入侵种,研究其在逆境条件下的生理适应机制对于有效预警和治理该入侵种具有十分重要的意义.采用人工设置温度梯度和自然干旱方法,研究了在不同环境胁迫条件(温度和干旱)下辣了草抗氧化酶系统和丙二醛(MDA)的变化.结果表明:在10～30 ℃范围内,辣子草抗氧化酶系统变化趋势不一致,MDA含量未出现显著性变化;在5℃、35℃和45℃胁迫下,抗氧化酶系统受到损伤,MDA含量显著上升;在干旱胁迫条件下,抗氧化酶系统先上升,后下降,MDA含量在干旱胁迫后期含量显著上升.应用Fuzzy方法,对辣了草抗氧化酶在2种逆境不同水平胁迫下的动态进行综合评价,认为其对低温环境具有较强的耐受能力,对干旱环境的耐受性较差.     

特定静电场长期作用下作物叶绿体膜组分及膜流动性的变化

研究了0.3kV/cm静电场长期作用下,大豆、黄瓜与油青菜心叶片光合细胞中叶绿体膜脂肪酸组分和膜流动性的影响.结果表明,静电场处理使叶绿体膜不饱和脂肪酸相对含量增加,饱和脂肪酸相对含量减少,膜脂肪酸的不饱和度指数和膜流动性提高.进一步研究发现,静电场处理使叶片细胞内丙二醛(MDA)含量降低,超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)和过氧化氢酶(CAT)活性提高,表明静电场的作用提高了作物光合细胞抗氧化保护酶系统的功能,使光合细胞中叶绿体膜流动性增加.图3表1参16     

微生物细胞色素P450酶及其对异源物质的代谢研究进展

细胞色素P450是一类广泛存在于动植物和微生物中的亚铁血红素-硫醇盐蛋白超家族,参与外源物质如药物、除草剂、杀虫剂和许多持久性难降解有机污染物等的生物氧化和降解.基于近年来文献综述P450酶的命名及分类、结构和催化机制,并总结微生物来源的P450酶在代谢和降解异源物质方面取得的研究进展.P450基因超家族主要依赖于氨基酸序列一致性进行统一命名和分类;P450酶结构虽较为保守,但其对底物的识别位点缺乏保守性,是构成其催化多样性的结构基础;细菌和真菌来源的部分P450酶能够代谢和降解异源物质,如多环芳烃、除草剂等,但效率较低,实际应用可能性较小.未来结合各种组学,需继续挖掘高效降解异源物质的P450酶资源,并对已有对异源物质有降解作用的P450酶进行蛋白分子改造,提高其活性并实现污染环境的生物修复.     

恩诺沙星在鲫鱼肝微粒体中的代谢及代谢关键酶

抗生素因具有抗菌谱广、杀菌性强等特点而被广泛应用于人类医药、畜牧业、农业和水产养殖业。其进入水生生物体内后,会在药物代谢酶的作用下发生代谢转化,产生生态毒性。采用鲫鱼肝微粒体体外孵育法,探究恩诺沙星细胞色素P450酶作用下的代谢转化过程,并通过代谢抑制实验确定关键的代谢酶。结果表明,恩诺沙星体外代谢过程符合一级动力学方程,当恩诺沙星暴露浓度为1 mg·L-1时,其在肝微粒体中的消除速率常数(k)最大为0.00303 min-1,半衰期(t1/2)最短为228.8min,应用高效液相色谱串联质谱(HPLC-MS/MS)技术,检测到了恩诺沙星脱乙基产物和羟基化产物;代谢抑制实验结果表明,CYP3A4在恩诺沙星代谢过程中起主要作用,是恩诺沙星代谢的关键酶。本研究结果为深入了解恩诺沙星在水生生物体内的代谢转化及其生态风险提供了基础数据。     

阿特拉津和绿麦隆对赤子爱胜蚓组织抗氧化酶活性的影响

通过模拟污染实验,分析了阿特拉津和绿麦隆在单一和混合污染胁迫下对蚯蚓鲜重和抗氧化酶(超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT))活性的影响.结果表明,蚯蚓鲜重随着处理时间的延长而降低,与处理浓度有一定的相关性.两种除草剂在蚯蚓体内的代谢表现为低浓度时诱导了SOD和CAT活性的增加,而高浓度时则抑制其活性;阿特拉津对蚯蚓SOD和CAT的诱导效应和抑制效应大于绿麦隆.     

扩展细胞色素P4502A6对大位阻底物的适应性

细胞色素P450酶(P450)的分子改造及其催化的生物转化是当前的两个研究热点.本研究以扩展P450 2A6的底物适应性为目标,通过尝试对P450 2A6酶进行N-端修饰提高表达量、筛选随机突变库以及点突变改变活性位点重要氨基酸残基等手段,在两个随机突变体中未筛选到功能突变体,但通过点突变重要氨基酸残基获得了新的突变体P450 2A6 (N297Q/I300A).该突变体具有比野生型和已报道的其它突变体更广泛的底物适应性,能够催化氧化大位阻底物6-苄氧基吲哚(6-OBzl-indole)生成蓝绿色物质.该物质经质谱测定为靛蓝类二聚体化合物.实验表明,其中两个氨基酸残基的变化都是关键突变,此结果与最新的P450 2A6突变体晶体结构研究相符.计算机模拟显示,I300A突变导致活性口袋在铁卟啉环的垂直和水平方向都增大,使其能接纳在两个方向都有位阻的底物;而297位的天冬酰胺是一个功能保守的残基,N297Q的变化可能与氢键等弱作用有关.图4表1参29     

砷(V)及苯胺联合暴露对土壤微生物群落组成及抗氧化酶活性的影响

砷(As)和苯胺是环境中常见的持久性有毒污染物,在石油、印染及化工等工业场地环境中具有较高的复合污染风险。目前采用单一物种及模式生物分析复合污染物的联合毒性效应的研究已有大量报道,相比而言,混合菌群具有复杂的种间相互作用且更接近实际环境,但是复合污染对混合菌群的毒性效应尚缺乏深入研究。本研究以从非污染土壤富集分离的混合菌群为研究对象,研究As(V)-苯胺的联合毒性效应及其产生机理。本研究发现土壤混合菌群对As(V)和苯胺的单一污染具有较高的耐受性,对As(V)和苯胺的半数抑制浓度(IC₅₀)分别达到30 g·L^-1和3.2 g·L^-1。As(V)-苯胺复合污染在混合菌群中表现出协同抑制效应(1+1>2)。另外,As(V)-苯胺复合污染与单一污染相比,复合污染显著增加混合菌群胞内及细胞表面吸附的总砷浓度,并且降低细胞抗氧化酶(SOD和CAT)活性。As(V)和苯胺单一及复合污染下细菌群落组成分析的结果表明,菌株在单一污染中的耐受表现无法用来准确预测其对复合污染的耐受。我们的结果初步揭示了土壤混合菌群在单一及复合污染生...     

一株高效不对称还原产生(R)-苯基乙二醇的菌株筛选、鉴定及全细胞催化体系

(R)-苯基乙二醇是合成许多光学活性药物的重要手性中间体,其制备具有重要的现实意义.以α-羟基苯乙酮为底物,从土壤中筛选得到一株能够立体选择性催化α-羟基苯乙酮产生(R)-苯基乙二醇的细菌菌株HBU-SI7.经形态学观察和16S r DNA序列分析,鉴定此转化菌株为红球菌属菌株Rhodococcus sp.菌株全细胞催化体系研究表明在邻苯二甲酸二丁酯-磷酸盐缓冲液(V:V=1:3)的两相催化体系下,菌体转化α-羟基苯乙酮的最优浓度为3.0 g/L,转化率高达96.2%,e.e值为99.3%.本研究建立的红球菌全细胞催化还原体系对(R)-苯基乙二醇的高效制备具有潜在的研究和应用价值.     

人工多细胞体系研究进展

人工多细胞体系具有可实现代谢分工、复杂底物利用等功能,已成为合成生物学发展的研究热点.概述人工多细胞体系的优势,介绍现阶段人工多细胞体系构建的方式及设计原则,通过文献对目前人工多细胞体系应用于环境修复的实例进行归纳汇总,最后借助CiteSpace直观地分析人工多细胞的研究主题及趋势.与单一微生物相比,人工多细胞体系具有劳动分工更优化、代谢负担更低、底物转化能力更高、鲁棒性强等特点.目前主流的人工多细胞体系构建方式为自上而下法或是自下而上法,其设计原则一般是基于底盘细胞选择、种群控制策略、数值模拟预测等等.通过文献计量分析,人工多细胞的研究主题包含微型自主运动的发展以及生物电子传输等领域,然而随着“代谢工程”“人工智能”等词汇的突现,未来人工多细胞体系的研究会更加关注多细胞体系的设计与构建、细胞代谢途径、细胞间信息传递及相互作用等方面.结合现状及热点,提出未来人工多细胞体系的研究应关注：（1）解析人工多细胞体系成员之间相互作用机制与代谢方式;（2）根据人工多细胞体系的结构、行为与功能逐步优化构建方式;（3）开发基于人工多细胞体系的环境生物修复策略.（图3表2参71）     

东亚飞蝗辅酶Q-细胞色素C还原酶基因克隆和序列分析

辅酶Q-细胞色素C还原酶是组成线粒体呼吸链的4种酶复合体之一,对线粒体呼吸链的电子传递起着重要作用.同时,辅酶Q-细胞色素C还原酶还是杀真菌剂(Fungicide)、抗原虫(Antiprotozoan)、抗癌药物(Anticancer drugs)以及抗疟疾(Antimalarial)药物——阿托喹酮(Atovaquone)、氯胍(Proguanil)、布帕伐醌(Buparvaquone)的作用靶标,可将它作为昆虫的药靶,设计和开发新型的杀虫剂.采用RACE方法,克隆了东亚飞蝗[Locusta migratoria manilensis(Meyen)]辅酶Q-细胞色素C还原酶cDNA全序列(GenBank登录号:GU593056.1).获得的cDNA全长939 bp,其中可读框819 bp,编码272个氨基酸,推测其相对分子质量为29.48 ku,等电点为9.19.通过与其它10个物种的细胞色素C还原酶基因的氨基酸序列进行比对,发现东亚飞蝗与家蚕、赤拟谷盗、黒腹果蝇、埃及伊蚊、致乏库蚊、小家鼠、人、丽蝇蛹集金小蜂、蜜蜂和豌豆蚜的辅酶Q-细胞色素C还原酶氨基酸序列同源性分别为72%、72%、66%、63%、60%、59%、59%、58%、57%和56%.     

芥蓝AOP基因家族生物信息学分析

芥子油苷(GS)是一类植物次生代谢产物,其多样性是由特定氨基酸前体延伸和侧链修饰所致.在侧链修饰过程中,AOP2和AOP3被证明可催化甲基亚磺酰基烷基GS分别形成烯基和羟烷基GS.为了解芥蓝(Brassica alboglabra) AOP基因家族成员编码2-氧化戊二酸双加氧酶的生物学功能,利用鉴定的家族成员进行蛋白质...     

五氯酚(PCP)对鸡肝癌细胞(LMH)毒性效应的机制研究

五氯酚(pentachlorophenol,PCP)是一种持久性有机污染物,广泛用于灭钉螺、木材防腐、除草剂等方面,由于PCP在环境中的持久性和生物累积性,其对生态环境和人类健康造成潜在危害。本文以鸡肝癌细胞系(chicken hepatoma cells,LMH)为受试对象,探讨了PCP对细胞色素P450(CYP450)和抗氧化系统的影响。MTT结果显示LMH细胞经不同浓度PCP暴露后,呈现出先促进细胞增殖后抑制的J-型曲线,PCP对LMH细胞24 h的半数效应浓度(24 h-EC50)为427.52μmol·L~(-1)。LMH细胞在1.56、6.25、25、100μmol·L~(-1)PCP染毒条件下可增加细胞EROD、MROD、PROD和BFC活性,并可使CYP1A、1B、1C、2H及3A家族基因mRNA表达水平升高。LMH细胞在0.4~100μmol·L~(-1)PCP染毒下可显著降低硫酸基转移酶(SULT1B1和SULT 1C1)基因mRNA水平。此外,LMH细胞在6.25、25、100μmol·L~(-1)PCP染毒下可引起细胞内ROS升高,同时PCP(1.56~100μmol·L~(-1))可显著增加细胞内MDA含量和降低GSH/GSSH比值。这些结果表明细胞色素P450(CYP450)基因及酶活性的变化、细胞内ROS和MDA含量及GSH/GSSH可作为评价LMH细胞PCP毒性效应的敏感性生物标志物。此研究在细胞水平上利用多个评价指标研究PCP对细胞的毒性效应,为PCP环境风险评价提供依据。     

羟基化多溴联苯醚(OH-PBDEs)在小鼠肝脏微粒体的体外代谢及对CYP450酶活性的影响

羟基化多溴联苯醚(OH-PBDEs)是一类具有内分泌干扰效应的酚类化合物,生物毒性要高于母体多溴联苯醚(PBDEs),研究OH-PBDEs的体外代谢行为对于理解其在生物体内的富集转化具有重要意义。以小鼠肝脏微粒体作为研究对象,考察了3-OH-BDE-47、5-OH-BDE-47、6-OH-BDE-47和2’-OH-BDE-68在小鼠肝脏中的体外代谢,并分别研究了浓度为0.1、0.2、0.4、0.6、1.0μmol·L-1条件下4种OH-PBDEs对细胞色素P450酶系中7-乙氧基香豆素-O-脱乙基酶(ECOD)、7-乙氧基异吩唑酮-O-脱乙基酶(EROD)和苯胺4-羟基化酶(ANH)活性的影响。结果表明,4种OH-PBDEs在小鼠肝脏微粒体中均能够快速代谢,代谢率分别为80%(3-OH-BDE-47)、42%(5-OH-BDE-47)、86%(6-OH-BDE-47)和63%(2’-OH-BDE-68)。实验所设OH-PBDEs各浓度对微粒体的ECOD活性无显著性抑制作用,但对EROD的活性均表现出相同的显著抑制作用;4种OH-PBDEs表现出不同的ANH活性影响,即3-OH-BDE-47对ANH活性具有抑制作用,5-OH-BDE-47具有诱导作用,而6-OH-BDE-47和2’-OH-BDE-68对ANH活性无显著性影响。