单宁酶产生菌的筛选和发酵条件研究

利用富集培养技术,从天然源分离得到具有较高单宁酶活性的黑曲酶Ｎｏ．１７株（ＡｓｐｅｒｇｉｌｕｓｎｉｇｅｒＮｏ．１７）．该菌株能把五倍子中的单宁酶法水解成没食子酸,在对Ｎｏ．１７株开展产酶条件和参数优化实验的基础上,进行了实验室酶法制备没食子酸试验,并获得产物浓度为１４．１ｇ／Ｌ的没食子酸,经大孔吸附树脂分离,最终净产率达到７０％．该样品经熔点测定、元素分析、ＴＬＣ、红外等理化方法分析检测,结果均与没食子酸标样一致     

黑曲霉Aspergillus niger SL2-111所产酸性蛋白酶的分离纯化及酶学特性

采用硫酸铵盐析、Sephadex G-25柱脱盐、DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换层析、Sephacryl S-200分子筛层析和高效液相色谱等方法,从黑曲霉菌株Aspergillus niger SL2-111的发酵曲中提取了一种酸性蛋白酶,经SDS-PAGE验证,该酶纯化水平已达到电泳纯.该酶的表观分子量(Mr)约为47×103,最适pH值为3.0,pH稳定性范围为2.5～6.0,最适温度为50℃,温度稳定性范围为30～60℃;Gu2+、Mn2+对其有激活作用,Hg2+、Ag+对其则有轻度的抑制作用;该酶的氨基酸组成为中极性酸性氨基酸占17.29%,极性碱性氨基酸占4.50%,极性中性氨基酸占38.50%,其它为非极性氨基酸;N端氨基酸序列为SKGSAVTTPQ,经序列同源性比对,表明该酶与其它曲霉酸性蛋白酶具有极高的同源性.图4表5参15     

磷矿石的微生物风化作用——以一株黑曲霉(Aspergillus niger)为例

以直接和间接作用的方式研究培养基中黑曲霉Aspergillus niger对磷矿粉的风化作用。在装有100目磷矿石粉的液体培养基中接入该菌研究其对磷矿石粉的直接风化作用;同时将装有100目磷矿石粉的透析袋放入液体培养基中再接入该菌研究其对磷矿石粉的间接风化作用。按不同时间取培养液上清液,用电感耦合等离子体-发射光谱仪测定Ca2 、Mg2 、Al3 、Fe3 、K 和Mn2 浓度,用离子色谱法测定H2PO4-、SO42-和Cl-浓度。此外,黑曲霉风化作用后的矿物残渣用电子探针作表面微观形态分析和XRD矿物物相分析。结果表明:黑曲霉对磷矿石粉风化作用的直接作用强度大于间接作用;黑曲霉可风化磷矿石粉,但对矿粉中不同矿物的风化强度不同,风化过程中形成次生矿物水草酸钙。提出黑曲霉对磷矿石的风化作用源自黑曲霉生长导致的机械破坏作用、胞外分泌物的生化降解作用以及多种因素之间的协同作用。     

纤维素酶产生菌HS-F9的筛选鉴定和产酶条件优化

为了选育高产纤维素酶菌株,通过刚果红鉴别培养基以及滤纸条崩解实验测定,从牛粪堆肥中筛选到一株产纤维素酶的真菌HS-F9,根据菌株形态特性和18SrRNA基因序列分析,初步鉴定该菌为绿色木霉(Trichoderma viride).利用液体发酵培养产生纤维素酶,研究了碳源、氮源、培养时间、培养温度、培养基起始pH、接种量对菌株HS-F9产酶的影响.结果表明:产EG、CBH和FPA的最适碳源均为CMC-Na;EG和CBH在以蛋白胨为唯一氮源时酶活最高,FPase则在以黄豆粉为唯一氮源时酶活最高;产生EG、CBH和FPA的最适温度分别为30℃、30℃、33℃;最适起始pH为3.0、3.0和4.0;EG和FPase的最适接种量为2%,CBH最适接种量达到了8%;培养时间均以5～6d为宜.在最适条件下培养,该菌株EG、CBH和FPase的酶活分别达到了5275.3U/mL、8502.1U/mL和3619.1U/mL,是未优化前的1.42、1.35和1.32倍.图6表2参23     

高效絮凝剂产生菌的筛选及培养条件

从活性污泥中分离出36株菌株,培养、筛选得到具有絮凝活性的菌株9株,其中有一株絮凝活性较高,命名为B-8,同时考察了培养时间、温度、pH和碳源对絮凝效果的影响。结果表明,培养时间72h,最佳温度为37℃,pH为7.0,葡萄糖为最佳碳源时,该微生物所产生的絮凝剂的絮凝效果最好,絮凝率可达95.75%。     

黑曲霉Aspergillsu niger SL2-111所产酸性蛋白酶的分离纯化及酶学特性

采用硫酸铵盐析、Sephadex G-25柱脱盐、DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换层析、Sephacryl S-200分子筛层析和高效液相色谱等方法,从黑曲霉菌株Aspergillus niger SL2-111的发酵曲中提取了一种酸性蛋白酶,经SDS-PAGE验证,该酶纯化水平已达到电泳纯.该酶的表观分子量(Mr)约为47×103,最适pH值为3.0,pH稳定性范围为2.5～6.0,最适温度为50℃,温度稳定性范围为30～60℃;Gu2+、Mn2+对其有激活作用,Hg2+、Ag+对其则有轻度的抑制作用;该酶的氨基酸组成为:中极性酸性氨基酸占17.29%,极性碱性氨基酸占4.50%,极性中性氨基酸占38.50%,其它为非极性氨基酸;N端氨基酸序列为SKGSAVTTPQ,经序列同源性比对,表明该酶与其它曲霉酸性蛋白酶具有极高的同源性.图4表5参15     

螺孢菌ZG9901的筛选及其产碱性果胶酶发酵条件研究

用筛选培养基从芦苇土壤中筛选到７株碱性果胶酶产生菌株,经初筛选和复筛得到产酶活性较高的一株菌株ＺＧ９９０１,初步鉴定为螺孢菌属Ｓｐｉｒｉｌｌｏｓｐｏｒａ ｓｐｐ．最适摇瓶产酶条件是：果胶２０ｇ／Ｌ,乳糖２０ｇ／Ｌ,蛋白胨３ｇ／Ｌ,酵母膏４ｇ／Ｌ,ＫＨ２ＰＯ４１ｇ／Ｌ,ＭｇＳＯ４．７Ｈ２Ｏ０．０４ｇ／Ｌ,ＭｇＣｌ２０．２ｇ／Ｌ,ｐＨ９．０,３２℃培养３６ｈ达到产酶高峰。     

秸秆污泥堆肥产纤维素酶细菌的筛选及产酶条件优化

从添加秸秆进行堆肥处理的污泥中采集样品,通过富集培养和刚果红平板染色法筛选分离出具有纤维素降解能力的细菌,再通过酶活力测定从中分离筛选出1株相对高活性的产纤维素酶细菌CI;通过基于16S rRNA基因序列的系统发育分析,初步确定该菌株为Devosia sp..利用单因素试验对目的菌株C1进行产纤维素酶发酵条件优化,结果表明菌株C1产纤维素酶的最佳发酵时间、培养温度、摇床转速以及最适初始pH值分别为60 h、30℃、130 r·min^-1和7.2～7.5,且在该条件下其滤纸酶（FPase）和羧甲基纤维素酶（CMCase）活力分别达23.10和54.97 U·mL^-1.     

Streptomyces venezuelae GY1产聚乙烯醇降解酶的培养条件

放线菌StreptomycesvenezuelaeGY1产生的聚乙烯醇(PVA)降解酶是一种诱导酶.以4种不同类型的PVA为唯一碳源时,该菌株单位质量细胞产酶能力比以糖类物质为唯一碳源时提高10倍以上.聚合度和醇解度最高的PVA1799是该菌株产生PVA降解酶的适宜底物,其浓度为1gL-1时,PVA降解酶的产量为120u/g(细胞).培养基中PVA1799浓度由1gL-1上升到5gL-1时,该菌株单位质量细胞产酶能力下降73%,表明PVA1799浓度过高会抑制产酶.GY1菌株产酶的最适温度和pH分别为30℃和7.0.在GY1菌株生长过程中控制以下条件有利于产生PVA降解酶:(1)保持培养体系中较高的溶氧水平;(2)在氮源中补充NO-3;(3)在一定浓度范围内添加MgSO4·7H2O、CaCl2、MnSO4、BaCl2、ZnSO4、FeSO4·7H2O和CuSO4等金属盐.Pseudomonassp.产生的PVA降解酶能够作用伯醇或仲醇类化合物,以这些伯醇或仲醇类化合物代替培养基中的PVA,不能诱导GY1菌株产生PVA降解酶;而在培养基中有PVA存在时,再添加0.5gL-1的3戊醇和环己醇能够明显促进PVA降解酶的产生(单位质量细胞产酶能力分别提高了21%和32%).图8表1参10     

黑曲霉吸附弱酸性艳蓝RAWL机理研究

考察了黑曲霉对染料吸附性能的pH响应模式,红外光谱表征了菌体表面的主要官能团组成,化学修饰定量研究了不同官能团的染料吸附贡献.结果显示,在低pH条件下,菌体表现出最优的染料吸附特性:随着pH值由2.0升至6.0,染料吸附量由39.6mg/g降至9.3mg/g.菌体表面含有氨基、羧基和磷酸根.高pH下,羧基和磷酸根电离导致菌体表面带负电并与染料发生静电斥力,使得染料吸附量下降;低pH下,氨基的质子化使得菌体带正电并通过静电吸引提高染料吸附.甲基化氨基在酸性条件下仍然可以质子化,故氨基甲基化修饰后染料吸附性能不变;乙酰化氨基在酸性体系中失去质子化能力,乙酰化修饰菌体染料吸附性能下降51.6%.氨基质子化引起的菌体正电性和染料负电性之间的静电引力是染料吸附的重要机制.图6参10     

黑曲霉耐热木聚糖酶XYNB在毕赤酵母中的高效表达

高比活木聚糖酶的高效表达是进一步提高木聚糖酶发酵效价、降低生产成本的有效途径.将黑曲霉木聚糖酶基因XynB(不含信号肽)克隆到分泌型表达载体pPIC9K上,线性化后电击转化巴斯德毕赤酵母GS115,G418和PCR鉴定的阳性转化子经0.5%甲醇、在28℃诱导表达.SDS-PAGE分析表明,该蛋白相对分子质量为20×103左右.优化的诱导表达条件为,每隔12 h添加0.5%的甲醇,发酵5 d后,比活达4 757 U/mg;其最适温度为55℃,最适pH为5.0,80℃处理30min后仍有74%的残余酶活.     

米曲霉产氨基酰化酶条件及部分酶学性质研究

通过单因子和多因子摇瓶正交优化试验,确定了米曲霉液态发酵产氨基酰化酶的最佳发酵条件.优化发酵培养基组成(ρ/gL-1):葡萄糖40,蔗糖10,可溶性淀粉20,蛋白胨2.5,马铃薯液1000mL,pH自然.培养基装量50mL/250mL三角瓶,接种量4%.培养温度30℃,转速100r/min,发酵时间42h.每50mL培养物的总酶活由优化前的2627u提高到7338u,是优化前的2.79倍.研究了米曲霉氨基酰化酶的部分酶学性质.该酶催化反应的最适pH为7.0,最适温度为40℃,低浓度的Co2 (5×10-4mol/L)对酶活激活作用显著.图5表2参8     

一株能产生聚乙烯醇降解酶的委内瑞拉链霉菌

以聚乙烯醇(PVA)为唯一碳源,从土壤中筛选到1株能产生胞外PVA降解酶的放线菌GY1.根据扩增出的该菌株的16SrDNA全序列在GenBank中的比较结果,结合生理生化实验、细胞化学成分及菌落形态分析,确定该菌为委内瑞拉链霉菌(Stretopmycesvenezuelae).GY1菌株以PVA为唯一碳源时,产生的PVA降解酶活性达到120UL-1,是以葡萄糖或可溶性淀粉为唯一碳源时的10倍.当在PVA培养基中添加1gL-1至3gL-1的葡萄糖时,该菌株细胞量和PVA降解酶总酶活随着葡萄糖添加量的增加而增加,最大细胞量是未添加葡萄糖时的2.4倍,最高总酶活是未添加葡萄糖时的2.6倍,而单位质量细胞产生PVA降解酶的能力提高不大.但当添加的葡萄糖浓度从3gL-1增至10gL-1时,总酶活随着细胞量的增加出现下降趋势,同时单位质量细胞产生PVA降解酶的能力也大大降低.在相同PVA聚合度下,高醇解度PVA比低醇解度PVA更有利于GY1菌株的生长及产生PVA降解酶.图5表1参16     

耐碱性木聚糖酶产生菌的筛选及发酵条件研究

利用刚果红透明圈法,从造纸厂碱性土壤中筛选到一株木聚糖酶生产菌株X24-14,经培养特性研究及16S rDNA序列分析,初步认为该菌属于纤维菌属(Cellulosimicrobium).经发酵条件优化,该菌在麸皮60 g/L,蛋白胨10 g/L,K2HPO4 7.0 g/L, pH 8.5,接种量为5%, 37 ℃, 200 r/min的条件下发酵培养108 h,可达到最大活力,为2 204 u/mL. 该酶最适反应温度为60 ℃;具有较宽的pH作用范围,在pH 4.2～9.4范围内能保持较高的酶活力,在pH 9.4条件下,仍具有80%的酶活力; pH稳定性较好,在4 ℃、pH 11.0的条件下处理24 h仍能保持75%的酶活力.图3表1参12     

产油脂微藻的分离鉴定及培养条件优化

为促进自养高产油微藻的工业化应用,从青海多种生境中分离到34株产油微藻,以筛选获得产油脂最高的青3-2-2株为出发株,18S rRNA分析表明其与栅列藻属(Scenedesmus sp.)同源性达到99%以上,确定该株属于栅列藻属.研究氮源、培养时间、培养温度、初始pH值等培养条件对微藻生物量及油脂含量的影响,优化培养条件为:硝酸钠为氮源,以10%(V/V)接种量接种于普通SE培养基,培养温度为25℃,初始pH 7.0,培养周期为20 d,可以获得较高的油脂产率,比优化前的产率增加了近70%.     

深黄伞形霉(Umbelopsis isabellina)华2-1产油发酵培养条件优化

为开发微生物油脂资源,从富含油脂的土样中分离获得一株产油脂微生物——深黄伞形霉(Umbelopsisisabellina)华2-1,油脂含量达48.60%.采用单因素和正交实验方法,对深黄伞形霉华2-1的发酵培养条件进行优化研究.优化的培养条件为:葡萄糖100 g/L,酵母粉3 g/L,接种量为20%,初始pH值为5.0～6.0,MgSO4.7H2O和KH2PO4的添加浓度分别为0.5 g/L和2 g/L,培养温度为31℃,最佳发酵培养时间为168 h.华2-1在优化发酵条件下可获得菌体生物量、油脂产量和油脂含量分别为45.86 g/L、24.47 g/L和59.53%,较优化前分别提高了21.48%、33.42%和22.49%.因此,深黄伞形霉华2-1作为微生物油脂生产的新资源具有广阔的应用前景.     

一株中度嗜盐淀粉酶产生菌的分离鉴定及酶活测定

为开发极端环境工业用酶,从新疆盐碱土微生物中分离得到一株中度嗜盐高产淀粉酶活性菌株H3,其能耐受30%盐浓度和pH 11的极端环境.通过形态特征、生理生化实验及16S rRNA基因序列分析,确定H3属于Gracilibacillus属.该菌株能在盐浓度为0~30%的培养基上生长,最适生长盐浓度为5%~10%,最适pH值为8.5.在最适生长盐浓度、pH条件下,其淀粉酶活性可达到4 830个活力单位,可用于高盐高碱环境下淀粉的水解.