产聚乙烯醇降解酶的培养条件

放线菌StreptomycesvenezuelaeGY1产生的聚乙烯醇(PVA)降解酶是一种诱导酶.以4种不同类型的PVA为唯一碳源时,该菌株单位质量细胞产酶能力比以糖类物质为唯一碳源时提高10倍以上.聚合度和醇解度最高的PVA1799是该菌株产生PVA降解酶的适宜底物,其浓度为1gL-1时,PVA降解酶的产量为120u/g(细胞).培养基中PVA1799浓度由1gL-1上升到5gL-1时,该菌株单位质量细胞产酶能力下降73%,表明PVA1799浓度过高会抑制产酶.GY1菌株产酶的最适温度和pH分别为30℃和7.0.在GY1菌株生长过程中控制以下条件有利于产生PVA降解酶:(1)保持培养体系中较高的溶氧水平;(2)在氮源中补充NO-3;(3)在一定浓度范围内添加MgSO4·7H2O、CaCl2、MnSO4、BaCl2、ZnSO4、FeSO4·7H2O和CuSO4等金属盐.Pseudomonassp.产生的PVA降解酶能够作用伯醇或仲醇类化合物,以这些伯醇或仲醇类化合物代替培养基中的PVA,不能诱导GY1菌株产生PVA降解酶;而在培养基中有PVA存在时,再添加0.5gL-1的3戊醇和环己醇能够明显促进PVA降解酶的产生(单位质量细胞产酶能力分别提高了21%和32%).图8表1参10     

Streptomyces venezuelae GY1产聚乙烯醇降解酶的培养条件

放线菌StreptomycesvenezuelaeGY1产生的聚乙烯醇(PVA)降解酶是一种诱导酶.以4种不同类型的PVA为唯一碳源时,该菌株单位质量细胞产酶能力比以糖类物质为唯一碳源时提高10倍以上.聚合度和醇解度最高的PVA1799是该菌株产生PVA降解酶的适宜底物,其浓度为1gL-1时,PVA降解酶的产量为120u/g(细胞).培养基中PVA1799浓度由1gL-1上升到5gL-1时,该菌株单位质量细胞产酶能力下降73%,表明PVA1799浓度过高会抑制产酶.GY1菌株产酶的最适温度和pH分别为30℃和7.0.在GY1菌株生长过程中控制以下条件有利于产生PVA降解酶:(1)保持培养体系中较高的溶氧水平;(2)在氮源中补充NO-3;(3)在一定浓度范围内添加MgSO4·7H2O、CaCl2、MnSO4、BaCl2、ZnSO4、FeSO4·7H2O和CuSO4等金属盐.Pseudomonassp.产生的PVA降解酶能够作用伯醇或仲醇类化合物,以这些伯醇或仲醇类化合物代替培养基中的PVA,不能诱导GY1菌株产生PVA降解酶;而在培养基中有PVA存在时,再添加0.5gL-1的3戊醇和环己醇能够明显促进PVA降解酶的产生(单位质量细胞产酶能力分别提高了21%和32%).图8表1参10     

米曲霉产氨基酰化酶条件及部分酶学性质研究

通过单因子和多因子摇瓶正交优化试验,确定了米曲霉液态发酵产氨基酰化酶的最佳发酵条件.优化发酵培养基组成(ρ/gL-1):葡萄糖40,蔗糖10,可溶性淀粉20,蛋白胨2.5,马铃薯液1000mL,pH自然.培养基装量50mL/250mL三角瓶,接种量4%.培养温度30℃,转速100r/min,发酵时间42h.每50mL培养物的总酶活由优化前的2627u提高到7338u,是优化前的2.79倍.研究了米曲霉氨基酰化酶的部分酶学性质.该酶催化反应的最适pH为7.0,最适温度为40℃,低浓度的Co2 (5×10-4mol/L)对酶活激活作用显著.图5表2参8     

Thermobifida fusca产角质酶摇瓶发酵条件研究

研究了环境和营养条件等对嗜热放线菌Thermobifida fusca WSH03-11生长及产角质酶的影响;并考察了苹果角质对角质酶诱导效果,分析了该菌产角质酶的机理.摇瓶研究确定了角质酶发酵的最佳种子培养基组成为90 g L-1可溶性淀粉、5 g L-1牛肉膏、5 g L-1酵母膏、5 g L-1NaCl、2 g L-1K2HPO4和1%微量元素液,生物量最高达18.5 gL-1,种龄取35～40 h.最佳环境条件为pH 8.0、5%接种量、培养温度50℃.最佳发酵培养基组成为1.5%乙醇、5 gL-1蛋白胨、5 g L-1酵母膏、2 g L-1K2HPO4、5 g L-1NaCl和1%微量元素液.发酵培养基中添加角质对角质酶合成与分泌有诱导作用,T.fusca的产酶机制为诱导型.采用上述最佳培养条件产角质酶为3.8 U mL-1.图4表3参9     

顺丁烯二酸异构酶工程菌发酵条件优化

为提高重组大肠杆菌中顺丁烯二酸异构酶表达量,通过正交试验设计,对工程菌的生长条件和目的蛋白可溶表达条件进行优化.采用250 mL三角瓶中装有50 mL(Amp 100 mg L-1)的培养基,分别研究培养基中葡萄糖、蛋白胨、酵母浸粉的浓度,培养基pH值以及摇床转速、装液量、接种量等对蛋白可溶表达量的影响.确定顺丁烯二酸异构酶工程菌最优化培养基为:蛋白胨20 g L-1、酵母浸粉2.5 g L-1、K2HPO4·3H2O 3.0 g L-1、KH2PO4 1.5 g L-1、NaCl 6 g L-1、MgSO43 g L-1,培养基pH调至6.5.确定顺丁烯二酸异构酶工程菌可溶性表达最优条件为:37℃下培养至D600 nm值为1.0时,添加终浓度为0.05 mmol L-1的IPTG进行诱导,诱导温度37℃,摇床转速220 r min-1,装液量20%,接种量5%,诱导时长为6 h.利用BioFlo 415发酵罐以最优化的培养基和发酵条件对该工程菌进行了3批发酵实验,与摇瓶实验相比,顺丁烯二酸异构酶的表达量提高了近1.5倍,单位发酵液的酶活力由46 U mL-1发酵液提高到78 U mL-1发酵液.以上数据为顺丁烯二酸异构酶重组工程菌的中试发酵奠定了基础.图7表2参17     

黄曲霉A5p1脱色糖蜜酒精废水机理初探

研究自行筛选的一株黄曲霉(Aspergillus flavus)A5p1(保藏号CGMCC.4292)对糖蜜酒精废水(MSW)的脱色机理.在外加蔗糖情况下菌株A5p1对MSW具有较好的脱色效果,脱色率由14%增高至58%;脱色进程与细胞生长基本同步.从培养液中检测出3种木质素过氧化物酶——漆酶(Lac)及两种胞外过氧化物酶即锰过氧化物酶(MnP)和不依赖锰的过氧化物酶(MiP)的酶活,但是水平不高,认为此3种酶不是主要的脱色机制.发现由各种代谢过程产生的总H2O2生成速率与脱色率基本同步,同时在第4天达到最大值,随后下降;还原糖总消耗也在初期阶段较快.外加蔗糖后总H2O2生成速率增加10倍,达到0.0027 mmol·min-1·mL-1.认为体系中脱色机制可能与产H2O2的酶相关.紫外可见光谱分析和凝胶色谱分析表明脱色过程中有大分子物质降解.综上所述初步认为,黄曲霉A5p1脱色糖蜜酒精废水是一个受产H2O2酶影响、复杂的生物降解过程.     

重组大肠杆菌产CotA漆酶的发酵条件优化

CotA漆酶在环境保护、食品工业和纸浆漂白等工业中具有重要的应用价值.将重组表达载体pET-22b/CotA转入大肠杆菌BL21(DE3),得到工程菌株,采用单因素实验和正交实验相结合的方法,研究诱导表达条件和发酵培养基对重组大肠杆菌产CotA漆酶量的影响.结果表明,初始pH 7.5的培养基中,添加0.6 mmol L-1 Cu2+,1 g L-1葡萄糖作碳源、15 g L-1蛋白胨和2 g L-1硫酸铵作氮源,以10%的接种量,37℃、200 r/min,直到菌液的D600 nm值为1.0,加入终浓度为1.0 mmol L-1的IPTG,25℃诱导12 h,漆酶的产量最高.优化前发酵液的粗提液的漆酶活性仅为1 190 U mL-1,优化后达到3 526 U mL-1,正交实验优化后漆酶活性提高了2.96倍.纯化的CotA漆酶最适反应温度为45℃,最适pH值为7.2.CotA漆酶对RBBR的脱色率在90%以上,此CotA漆酶在短时间内对染料能够有效地脱色,能够成为有潜力的工业用酶.图6表3参17     

一株烟草内生拮抗放线菌发酵条件优化

为提高烟草内生放线菌Y12发酵时产生抑菌物质的产量,通过摇瓶正交优化试验,确定了Y12的三角瓶发酵条件.发酵培养基组成为:黄豆粉1.5%,蛋白胨1.5%,葡萄糖1.5%,可溶性淀粉1.5%,MgSO4.7H2O 0.05%,(NH4)SO40.25%,NaCl 0.4%,KH2PO4 0.1%,CaCO3 0.5%;培养基初始pH 7.5,培养温度30℃,发酵时间72 h.经过优化发酵液的抑菌圈直径增加了44.9%.     

棒状链霉菌突变株CCRC11518-Ⅲ50克拉维酸发酵条件的研究

通过单因子和多因子摇瓶正交优化试验,确定了克拉维酸产生菌棒状链霉菌突变株Streptomyces clavuligerusCCRC11518-Ⅲ50的三角瓶发酵条件.发酵培养基组成(ρ/g L-1):甘油30,大豆蛋白胨60,麦芽浸膏7.5,K2HPO4·3H2O 1.0,MgSO4·7H2O 2.0,FeSO4-7H2O 1.0;培养基初始pH 6.5;接种量15％;培养基装量20 mL/250 mL三角瓶;培养温度25℃;发酵时间72 h.克拉维酸效价由优化前的834.8 μg mL-1提高到1 082.615 μg mL-1,提高了29.7％.还在1 600 mL发酵罐中进行了初步放大试验.当接种量15％,通气量1:0.5,转速450 r min-1,25℃发酵60h克拉维酸效价达到高峰1 025 μg mL-1.图12表1参12     

抗真菌多肽捷安肽素发酵条件的研究

对筛选出的一株芽孢杆菌ZK发酵产物抗真菌多肽捷安肽素的发酵培养基组分(碳源、氮源及无机盐)和工艺条件(发酵温度、起始pH,摇床转速,装液量)进行了摸索,通过单因素实验和正交优化实验,确定了ZK菌株发酵培养基最佳组成:生物氮素3.5％、葡萄糖3％、酵母膏0.08％、MgSO4·7H2O 0.5％、KH2PO4·3H2O 0.1％;最适温度为32℃;最适初始pH为8.0.在250 mL三角瓶中装50 mL培养基,于150 r min-1的旋转摇床上32℃振荡培养72 h,ZK菌株产捷安肽素的量达到最大.图8表5参14     

深黄伞形霉(Umbelopsis isabellina)华2-1产油发酵培养条件优化

为开发微生物油脂资源,从富含油脂的土样中分离获得一株产油脂微生物——深黄伞形霉(Umbelopsisisabellina)华2-1,油脂含量达48.60%.采用单因素和正交实验方法,对深黄伞形霉华2-1的发酵培养条件进行优化研究.优化的培养条件为:葡萄糖100 g/L,酵母粉3 g/L,接种量为20%,初始pH值为5.0～6.0,MgSO4.7H2O和KH2PO4的添加浓度分别为0.5 g/L和2 g/L,培养温度为31℃,最佳发酵培养时间为168 h.华2-1在优化发酵条件下可获得菌体生物量、油脂产量和油脂含量分别为45.86 g/L、24.47 g/L和59.53%,较优化前分别提高了21.48%、33.42%和22.49%.因此,深黄伞形霉华2-1作为微生物油脂生产的新资源具有广阔的应用前景.     

苏云金芽孢杆菌生物杀虫剂发酵生产的影响因素及其工艺选择

化学杀虫剂的长期使用给生态环境造成了严重破坏,也使害虫种群的抗药性日益提高,生物杀虫剂以其＂绿色环保＂的特点引起人们的广泛关注。其中,苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）制剂是目前世界上产量最大、应用最广的生物杀虫剂。它对鳞翅目、双翅目、鞘翅目、螨类等许多有害昆虫有毒杀作用,而对人类、动物和农作物无害。长期以来,人们一直致力于苏云金芽孢杆菌发酵过程的研究,以期获得高毒效的生物杀虫剂产品。本文首先对苏云金芽孢杆菌发酵生产的各种影响因素进行了综合分析,将影响因素分为培养条件和培养基组分两类,得出最佳培养条件为温度：（30±1）℃,pH：7.0±0.1,搅拌速度：400～600r·min-1,通气量：1∶0.6～1.2（发酵培养基体积与每分钟通入空气的体积之比）,接种时间：对数期初;最佳培养基配比为碳氮比：8～10∶1,无机盐含量：KH2PO4或K2HPO4为0.075%～0.2%;MgSO4·7H2O为0.075%～0.3%;CaCO3为0.075%～0.15%;MnSO4·H2O、FeSO4·7H2O各为0.002%。其次,对当前研究与工业化生产中的各种发酵工艺进行了评述,总结了现有发酵工艺的优缺点。在现有研究基础上,降低培养基原料成本、改进发酵工艺和采用基因学手段构建高效工程菌株将成为未来研究热点。     

转化血型用蕃茄α－D－半乳糖苷酶的分离、纯化及理化性质

成熟蕃茄匀浆后，经硫酸铵盐析，ＤＥＡＥ－ＳｅｐｈａｄｅｘＡ－５０离子交换层析，ＳｅｐａｄｅｘＧ－１００凝胶过滤和Ｍｅｌｉｂｉｏｓｅ－Ａｇａｒｏｓｅ亲和层析，获得了α－Ｄ－半乳糖苷酶（Ｃ．Ｅ．３．２．１．１１）。酶制剂经ＰＡＧＥ检测为一条带；ＳＤＳ－Ｇ－ＰＡＧＥ测得酶Ｍｒ为３４０００；比活力５２．９Ｕ／ｍｇ·；提纯倍数为５２９０１产率为４５％．酶专－催化以α－Ｄ－半乳糖为末端ａ－（１，３）连接的糖苷键，以ＰＮＰＧ（对硝基苯－α－Ｄ－半乳糖昔）为废物，酶催化反应的Ｋｍ＝０．１１ｍｍｏｌ／Ｌ，Ｖｍａｘ为６７μｍｏｌ·ｍｇ１－·ｍｉｎ－１．ｔ稳定范是０～３５℃；ＰＨ稳定范围是４．０～７．０．最适ｐＨ为５．１．半乳糖是酶的竞争性抑制剂；Ｃｕ２＋、Ｚｎ２＋、Ｍｎ２＋、Ｆｅ３＋、Ａｇ＋和ＥＤＴＡ对酶活性无影响．纯酶制剂可作为Ｂ型血向Ｏ型血转化的工具酶液．     

青霉菌发酵生产β-葡萄糖苷酶培养基优化及纤维素酶可溶性诱导物制备

在纤维素酶生产过程中,常用的固体诱导物存在着诱导效率低、传质阻力大和不易于流加培养等局限性,所以利用β-葡萄糖苷酶催化葡萄糖生产槐糖等可溶性诱导物进行纤维素酶发酵具有重要意义.为实现β-葡萄糖苷酶的低成本高效生产,首先利用本实验室分离的β-葡萄糖苷酶生产菌Penicillium sp.YH02为产酶菌株,利用响应面法对麸皮、麦草和微晶纤维素3个参数浓度进行优化,优化后β-葡萄糖苷酶酶活提高15.03%.其次,利用菌株YH02所产的β-葡萄糖苷酶,以高浓度葡萄糖为底物进行转糖苷反应,合成诱导里氏木霉(Trichodema reesei)产纤维素酶的可溶性诱导物.结果表明,以10 g/L该可溶诱导物为碳源时,里氏木霉Rut-C30在48 h时滤纸酶活比未进行催化反应的葡萄糖对照高24.9倍.离子色谱分析结果表明,高浓度葡萄糖经过菌株YH02分泌的β-葡萄糖苷酶催化后产生具有诱导能力的槐糖、龙胆二糖和纤维二糖.本研究实现了β-葡萄糖苷酶的高效生产并成功制备了可溶性诱导物,为降低纤维素酶生产成本提供了参考.(图4表1参22)     

海栖热袍菌耐高温β-甘露糖苷酶基因的克隆及表达

以海栖热袍菌(Thermotoga maritima)MSB8基因组DNA为模板,克隆得到β-甘露糖苷酶基因(man2).测序分析表明,该基因全序列为2358bp,编码785个氨基酸,分子量约为92×103.根据蛋白质氨基酸的同源性分析,该β-甘露糖苷酶与新阿波罗栖热袍菌(Thermotoga neapolitana)Man2(accession No.AAK52304.1)的同源性最大,达到80%.将此基因连接至表达载体pET-28a( )并转化到大肠杆菌BL21细胞中,经IPTG诱导,β-甘露糖苷酶活力达5.96U/mL.粗酶的温度稳定性分析表明,该酶的热稳定性好,90℃处理10min,活力回收率65%,具有重要的工业应用前景.图3表1参17     

镉、汞、锌3种重金属的雌激素样作用（Estrogenic Activity of Cadmium, Mercury, and Zinc）

为探讨镉、汞、锌3种重金属的雌激素样作用,采用双杂交酵母法测定了醋酸镉、氯化汞、醋酸锌单独作用时对重组基因酵母β-半乳糖苷酶诱导活性的EC50值.实验结果表明,醋酸镉浓度为1.0×10-5mol·L-(1实验浓度范围10-7~10-2mol·L-1),氯化汞浓度为5.0×10-7mol·L-(1实验浓度范围10-9~10-5mol·L-1),醋酸锌浓度为1.0×10-4mol·L-(1实验浓度范围10-9~10-2mol·L-1)时对酵母β-半乳糖苷酶诱导活性最大,分别达到1.3、0.95和1.1U.不能求出镉、汞、锌单独作用时对β-半乳糖苷酶诱导活性的EC50值.一味计算EC50值不仅难以评价重金属的雌激素活性,而且限制重组受体基因酵母法的普遍运用.一些重金属通过MCF-7细胞法(E-screen)呈阳性,通过重组hERα酵母法YES检测呈阴性,有可能是重金属通过与ERβ作用而产生效应.若构建出含ERβ基因的双杂交酵母菌株,与现有的方法互补将能完善环境雌激素的体外测评系统.     

一株碱性果胶酶高产细菌的分离、系统发育分析和产酶条件的初步优化

从腐烂的苹果表皮筛选到一株碱性果胶酶的高产菌株,命名为WSHB04-02.分离菌株为革兰氏阳性细菌,有芽孢,菌落颜色为乳白色.分离菌株WSHB04-02的16SrDNA全序列分析表明,该菌株与Bacillussubtilus具有99%的相似性,并与其他13株产碱性果胶酶菌株的16SrDNA结果进行同源性分析,并构建系统发育树.发现菌株WSHB04-02在不含果胶类物质与Mg2 的培养基上能高产碱性果胶酶,在优化的培养条件下,碱性果胶酶的酶活达到34U/mL,在国内还未见报道.图6表2参15     

微酸多年卧孔菌产漆酶条件优化及其在染料脱色中的应用

微酸多年卧孔菌(Perenniporia subacida)产漆酶能力对生物漂白等研究具有重要意义.通过单因子和正交试验确定了微酸多年卧孔菌(菌株号:Dai 8224)的最适产酶条件:麦芽糖20 g/L,酵母浸粉5 g/L,pH 5.4,Cu2+2.0 mmol/L,培养温度24℃,转速160 r/min,接种量1.5%(V/V),此时酶活最高可达1.945 U/mL.单独使用微酸多年卧孔菌漆酶粗酶液对染料具有很好的脱色效果.该菌株对于50 mg/L杂环类染料中性红的脱色率可达98.3%,对偶氮染料刚果红的脱色率次之,为91.57%,对亚甲基蓝和铬天青的脱色率也都在80%以上.此外,其催化中性红脱色的最佳底物浓度为60 mg/L,脱色率达到99.42%,其中,生物降解作用占55.92%,菌体吸附作用占43.5%.结果表明该菌对多种染料脱色具有较大的应用潜力.图4表3参31     

响应面法优化锰氧化细菌发酵培养基

Bacillus sp.WH4是一株锰氧化能力强的锰氧化细菌,在锰污染的水源净化方面具有较好的应用前景.为提高发酵液中Bacillus sp.WH4的活菌数,应用响应面法优化其发酵培养基.Plackett-Burman设计获得对活菌数有显著影响的4个因素:豆粕粉、KH2PO4、MgSO4、FeSO4;最陡爬坡试验确定中心组合实验的最大响应区域;中心组合设计和响应面分析优化出4个显著因素的最佳浓度.优化后的最适培养基(w/%)组成为:蔗糖2、豆粕粉0.96、K2HPO4 0.8、KH2PO4 0.19、MgSO4.7H2O 0.11、CaCl2 0.02、NaCl 0.5、FeSO4.7H2O 0.02.发酵试验表明,最优培养基的活菌数可达4.2×109 CFU mL-1,比初始发酵培养基提高近3倍.     

响应面法优化Paraconiothyrium variabile GHJ-4产漆酶发酵条件

为提高子囊菌Paraconiothyrium variabile GHJ-4产漆酶的能力,采用响应面法对其发酵条件进行优化.首先用Plackett-Burman法筛选出4个影响较大的重要因素,分别为:接种量(X1)、培养时间(X2)、装样量(X3)和转速(X4).继而采用最陡爬坡路径逼近最大响应区域,并结合中心组合试验...