微囊藻毒素-LR完全抗原的设计及制备

从偶联位点、偶联剂、载体蛋白和偶联步骤等分析出发,设计了微囊藻毒素-LR (Microcystin-LR ,MC-LR)完全抗原的制备方法.在半抗原分子第7位氨基酸分子上引进1个自由的氨基;再用戊二醛2步法将此中间产物(H₂N-etMC-LR)分别与BSA和OVA偶联.中间产物和偶联产物分别经固相萃取和透析纯化后,经SDS凝胶电泳、紫外扫描及生物质谱技术鉴定,结果表明MC-LR与BSA的平均偶联比能达到5以上,满足了进一步免疫的要求.     

时间分辨荧光免疫一步法检测微囊藻毒素的研究

利用稀土元素Eu³⁺ 标记微囊藻毒素偶联物MCLR-BSA,在固相包被二抗的微孔板上建立了微囊藻毒素的直接竞争时间分辨荧光免疫法.条件优化后Eu³⁺ 标记物的稀释度为1∶50,微囊藻毒素单抗的合适浓度为100 ng/mL.该法对微囊藻毒素检测的灵敏度为0.02 ng/mL,试剂的测量范围是0.05～10 ng/mL,回收率达到94％以上.     

水体中微囊藻毒素-LR的间接竞争ELISA检测

在自制包被完全抗原浓度为5μg/mL、单克隆抗体工作稀释度为1∶3 000、酶标二抗鼠工作稀释度为1∶3 000、微囊藻毒素-LR浓度在0.001～30μg/L、显色底物为邻苯二胺,采用间接竞争酶联免疫吸附试验对水体中的微囊藻毒素-LR进行检测,结果表明,该方法与高效液相色谱的检测结果相关系数大于0.99,多次重复实验相对标准偏差小于10%,最低检测限能达到0.01μg/L,定量检测区间为0.01～3μg/L,该方法对[4-精氨酸]微囊藻毒素能特异性识别,对来自实际水样中的干扰有相当的耐受力.     

活体及离体条件下微囊藻毒素对鱼蛋白磷酸酶的抑制作用

用鱼组织匀浆液或纯化的酶作为酶源,研究了离体和活体条件下天然有毒物微囊藻毒素对蛋白磷酸酶的抑制作用。结果表明,3种微囊藻毒素LR、YR和RR都对蛋白磷酸酶有极强的抑制作用,毒素浓度对酶相对活力作图呈典型的Ｓ型曲线。在活体致毒时,微囊藻毒素ＬＲ可在极短时间里完全抑制鱼肝脏的蛋白磷酸酶活性。研究结果还证明,离体条件下,微囊藻毒素对鱼蛋白磷酸酶的作用模式和程度与哺乳动物中的一样,活体致毒时,微囊藻毒素对鱼蛋白磷酸酶有专一性的抑制作用。     

微囊藻毒素-LR多克隆抗体的制备

通过对新西兰大白兔免疫自制的微囊藻毒素-LR(Microcystin-LR,MC-LR)完全抗原BSA-MC-LR,获得了质量较好的抗MC-LR的多克隆抗体,间接ELISA表明抗体的效价能达到1.5×10⁵;固定包被抗原OVA-MC-LR,采用间接竞争ELISA测定水体中的微囊藻毒素,标准曲线表明对水样中MC-LR的检测下限为10ng/L,线性区间为30ng/L·3μg/L,能满足对饮用水和地表水中MC-LR的检测要求.     

总微囊藻毒素免疫检测及其预处理方法研究

在验证广谱型微囊藻毒素酶联免疫分析试剂盒性能基础上,主要研究了基于我国与美国分别推荐的水样预处理方式所检测的地表水中微囊藻毒素浓度差异.结果表明：(1)酶联免疫分析试剂盒对微囊藻毒素-LR(MC-LR)的检出限为0.04μg·L^-1,并在0.08～1.00μg·L^-1的浓度范围内表现出良好的线性检测范围;(2)基于我国与美国分别推荐的水样预处理方式,后者测得的微囊藻毒素浓度普遍高于前者(最大差值：前者未检出,后者为(0.25±0.01)μg·L^-1),且基于两者所测试的地表水样中的微囊藻毒素浓度均低于世界卫生组织(WHO)对饮用水中MC-LR所设定的残留限值;(3)酶联免疫分析试剂盒在对上述未检出水样进行加标检测时,回收率为80%～120%,变异系数低于16%,表明上述地表水中微囊藻毒素的检测结果具有较高的准确度.     

洱海水华期间饮用水源区产毒微囊藻和微囊藻毒素-LR的分布特征

水华期间微囊藻毒素的释放会严重影响洱海饮用水源水质安全.应用荧光定量PCR结合酶联免疫法快速检测洱海水华高发秋季(8—11月)主要旅游区和饮用水源地产毒微囊藻丰度和微囊藻毒素LR浓度.结果表明,荧光定量PCR方法能够快速定量洱海中总微囊藻种群和产毒微囊藻丰度,并且能有效预测洱海水体产毒潜能.洱海总微囊藻平均丰度为8.15×10~6copies·L~(-1),9月份均值最高,产毒微囊藻平均丰度为6.42×10~5copies·L~(-1),也于9月达到最高值,占总微囊藻的比例为1.0%~69.8%,水温和TP显著影响洱海总微囊藻丰度,低温、低P是洱海微囊藻水华的限制因子.洱海毒素峰值期为10月上旬,期间水源地微囊藻毒素和胞外微囊藻毒素全部检出,叶绿素a显著影响总微囊藻毒素和胞外微囊藻毒素分布,说明在一定程度上Chl a值能预测水体微囊藻释放的毒素风险.洱海总微囊藻毒素LR最高值达2.17μg·L~(-1),已超过集中式生活饮用水地表水源地对MC-LR的限值(1.0μg·L~(-1)),表明水华期间洱海饮用水水源安全问题不容忽视.     

浮水草本浮萍对微囊藻毒素影响的试验

研究了在不同处理时间和不同初始微囊藻毒素浓度下,浮萍的生长、光合生理特性以及对微囊藻毒素的去除效果.结果表明,当MC-RR的浓度不超过960 μg·L-1时,浮萍对微囊藻毒素具有很强的耐受性,其光合生理特性不受微囊藻毒素的抑制,并且还可以通过增大生长速度来减小微囊藻毒素对自身的伤害.此外,尽管还没有直接证据表明浮萍能够降解微囊藻毒素,但浮萍确实能够在短时间内有效去除水体中微囊藻毒素,说明浮萍可能在蓝藻水华的生物治理中具有一定的应用前景.     

水环境中微囊藻毒素分析技术进展

微囊藻毒素将成为衡量水质好坏的指标之一。水体中微囊藻毒素的检测是了解水体污染和毒素控制的基础,因此微囊藻毒素的检测变得尤其重要。文章综述了目前微囊藻毒素的来源、化学结构和性质的研究成果,重点评述国内外微囊藻毒素检测方法进展。     

官厅水库微囊藻毒素的LC-ESI/MS定性分析

在利用高效液相色谱方法研究的基础上,采用液相色谱-电喷雾质谱(LC-ESI/MS)方法对相同的藻毒素样品进行了进一步的定性研究.结果表明,官厅水库微囊藻产生的5种微囊藻毒素中3种分别是常见的Microcystin-RR,Microcystin-LR和Microcystin-YR,分子量分别为1 038,995和1 045.另外2种分子量分别为1 052和1 009,分别与Microcystin-YY和Mglu-LR的分子量相同,但完全的验证工作还有待更深入的研究.     

草丁膦人工抗原的合成与免疫效价的测定

用戊二醛作为交联剂合成草丁磷-卵清蛋白(oviparous,OVA)人工抗原,通过紫外吸收、31P核磁扫描的方法检测和鉴定草丁磷人工抗原,并用此合成抗原免疫小鼠,检测抗体的生成。结果表明,人工抗原紫外吸收光谱与OVA、草丁磷光谱相比发生了改变,人工抗原、草丁磷31P核磁光谱位移大致相同,通过计算人工抗原中草丁磷与卵清蛋白的偶联比是36.7∶1。免疫小鼠数周后在其血清中检测出抗体(其血清的效价为1∶320000)。草丁磷人工抗原合成及对小鼠的免疫成功,为制备草丁磷单克隆抗体打下了基础。     

呋喃丹多克隆抗体的制备与初步应用

以呋喃丹为原料,在强碱性(pH>12)下水解生成呋喃酚,与对硝基苯氯甲酸酯和6-氨基己酸反应,合成呋喃丹半抗原,即6-［［(2,3-二氢-2,2-二甲基-7-苯并呋喃基氧)羰基］氨基］己酸(BFNH). 通过活性酯法将半抗原与载体BSA偶联制备的呋喃丹人工免疫抗原免疫家兔获得了抗呋喃丹多克隆抗体,免疫抗原BFNH-BSA和包被抗原BFNH-OVA的结合比分别为18∶1和5∶1.采用辛酸-硫酸铵二步沉淀法纯化兔Ⅱ抗体,抗体最高效价为5.12×106,重、轻链分子量分别约为55和22 ku.通过间接竞争ELISA鉴定抗体质量,测得在10-7～0.01 mg/mL范围内,抑制率与标准农药浓度的线性关系显著,呋喃丹残留最低检测限为10-7 mg/mL,与5种结构相似的氨基甲酸酯类的交叉反应率低于10%. 并初步应用于果蔬样品呋喃丹残留的快速检测.      

对硫磷的人工抗原合成与鉴定

为防治病虫草害,确保农业丰收,每年有大量农药化学品施入环境中,从而使环境监测任务日趋繁重.气相色谱、液相色谱这些传统的农药残留检测手段,因其仪器昂贵,前处理过程复杂等难以满足快速监测需要.酶联免疫吸附分析(Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay简称ELISA)技术,具有设备简单、成本低廉、专一性强、灵敏度高、样品预处理简化、适于同时检测大量样品等优点.近年来已发展成为一种简单、灵敏、快速的农药残留测试技术而应用于环境监测中.     

2,4-D完全抗原的合成及其免疫性能评价

以2,4-D为半抗原,BSA为载体蛋白,通过EDC的偶联反应条件优化试验,合成了多种结合比的完全抗原,制备了小分子环境污染物的多克隆抗体.结果表明,偶联反应优化步骤是2,4-D、BSA和EDC同时反应,4°C条件下反应18h.偶联反应可以在2,4-D的浓度为10.0～12.0 mg/mL的0.05mol/L的磷酸盐缓冲溶液中进行,反应缓冲体系pH控制在5.4～6.1之间.EDC的加入量低于12 mg时,采用2,4-D和多聚赖氨酸的偶联物为包被抗原.通过balb/c小鼠免疫试验评价结合比分别为6、12、18和25的完全抗原的免疫性能,结果表明结合比为12和18的完全抗原具有很好的免疫原性.其中以结合比为18的完全抗原免疫小鼠获得的抗血清对包被抗原载体的非特异性吸附低于阴性血清,2,4-D特异性血清含量高,适于作为完全抗原免疫小鼠进一步制备单克隆抗体.     

氯菊酯农药抗体制备及酶标抗原合成

为建立一种快速检测氯菊酯的酶免疫学方法,以自制的氯菊酯半抗原(Py)与牛血清白蛋白(BSA)偶联得到免疫原.免疫健康新西兰白兔获得特异性多克隆抗体.用间接酶联免疫吸附法(ELISA)鉴定抗体效价为1:2500和1:4000.合成了辣根过氧化物酶(HRP)标记抗原(HRP-Py),并经紫外分光光度法鉴定,摩尔分子比为2.5:1.     

大田软海绵酸和鳍藻毒素时间分辨荧光免疫层析试纸条的研制与应用

腹泻性贝类毒素主要包括大田软海绵酸（okadaic acid,OA）、鳍藻毒素-1（dinophysis toxin-1,DTX-1）和鳍藻毒素-2（dinophysis toxin-2,DTX-2）。被贝类毒素污染的海产品可对食用者的健康构成危害。在我国近岸海域OA常有检出,DTX-1和DTX-2偶有检出。本文用荧光免疫微球标记抗OA单克隆抗体,利用牛血清白蛋白合成高偶联比的包被抗原,以硝酸纤维素膜为载体,运用免疫层析技术,研制了能够同时快速准确检测OA、DTX-1和DTX-2的时间分辨荧光免疫层析试纸条,定量限分别为90.6 μg/kg、115.4 μg/kg和69.8 μg/kg。实验验证结果表明:本文研制的时间分辨荧光免疫层析试纸条对含有OA、DTX-1和DTX-2中的一种、两种或三种组分的毒素样品检测结果,与液相色谱?串联质谱法检测结果的相关性良好。该时间分辨荧光免疫层析试纸条灵敏、准确、操作简便,成本低,在我国海洋环境监测及海产品食用安全检测中,应用前景良好。     

农田土壤中微囊藻毒素污染特征及风险评价

蓝藻水华释放的微囊藻毒素(MCs)通过灌溉、堆肥沤田等途径进入农田土壤造成污染.采用固相萃取-高效液相色谱串联质谱方法(HPLC-MS/MS)研究了滇池周边35个代表性农田土壤样品中3种典型微囊藻毒素(MC-LR、MC-RR、MC-YR)的含量、分布特征及风险水平.结果表明,MCs检出率为85.7%,总含量为n.d.~7.8μg/kg,平均含量为1.6 μg/kg,其中MC-RR检出率(82.9%)和含量(n.d.~5.3μg/kg)最高. 3种MCs的健康风险和生态风险均在可接受范围内,健康风险以MC-YR最大,生态风险以MC-LR最大.儿童以口腔暴露MCs为主,成人以皮肤暴露MCs为主,儿童暴露MCs的健康风险高于成人.     

一株降解微囊藻毒素的缺陷短波单胞菌的分离鉴定及降解特性研究

从太湖水华腐烂蓝藻中筛选出一株能够降解MC-LR的细菌,将其编号为Q3.经形态、生理生化及16S rRNA基因序列分析鉴定为缺陷短波单胞菌(Brevundimonas diminuta).研究发现,在实验条件下该菌能以MC-LR为唯一碳源和氮源生长;7 d内可将初始浓度为0.96 mg·L-1的MC-LR降解为0.37 mg·L-1,降解效率达到61.5%.同时,本研究首次发现缺陷短波单胞菌能够降解藻毒素,并且在此菌种中扩增出了降解过程的关键基因mlr A,推测该菌可能与已报道的Sphingomonas sp.ACM-3962等菌具有相同的降解机制.